DE4010368A1 - Mittel zur bekaempfung von aids-viren und anderen viren - Google Patents
Mittel zur bekaempfung von aids-viren und anderen virenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Bekämpfung von AIDS-Viren
und anderen Viren.
Die Anzahl an Patienten mit AIDS ist in jüngster Zeit besonders in den USA und
in Afrika enorm angestiegen und umfaßt augenblicklich bis zu etwa 50 000 Personen,
wobei die Anzahl der Virusträger in der ganzen Welt etwa das 100fache beträgt.
Es wird gesagt, daß fast alle Virusträger innerhalb von fünf Jahren von der
Krankheit befallen werden und die Todesrate etwa 100% erreicht. AIDS läßt das
Immunsystem von lebenden Körpern in der Weise kollabieren, daß der AIDS-Virus
die Helfer-T-Zellen, die das Immunsystem steuern, infiziert und diese zerstört.
Als Ergebnis werden die Personen von jeder Infektion, von malignen Tumoren
und dergleichen befallen und sterben dann an diesen Krankheiten.
Bis zum heutigen Tage hat man das auf Nucleinsäuren basierende AZT (Azidothymidin)
allein als therapeutisches Mittel gegen AIDS verwendet. Aufgrund erheblicher
Nebenwirkungen (wie beispielsweise Anämie) kann das AZT aber nicht
während langer Zeitdauern verabreicht werden.
Auf der anderen Seite ist Lignin in der Natur nach Cellulose reichlich vorhanden,
es ist in fast allen Pflanzen enthalten und wird durch den Menschen als Teil der
Nahrungsmittel zu sich genommen. Erst kürzlich haben die physiologischen
Wirkungen (wie beispielsweise eine Wirkung bei Darmstörungen usw.) von
pflanzlichen Fasern Interesse gefunden. Darüber hinaus fallen Lignin-Derivate
hauptsächlich in Ablaugen auf dem Gebiet der Zellstoff- und Papierindustrie an.
Deren Einsatzmöglichkeit als Arzneimittel ist jedoch noch kaum untersucht
worden, wobei allerdings ihre Antitumoreigenschaften bekannt sind.
Daher ist die physiologische Wirkung von Ligninsulfonsäure und anderen
Lignin-Derivaten, insbesondere deren antivirale Wirkung gegenüber dem NDV-Virus
(Newcastle Disease Virus), welcher zu der Paramyxovirus-Familie gehört
und dem RSV-Virus (Rous Sarcoma Virus) und dem HIV-Virus (Human Immunodeficiency
Virus), welcher zu der Familie der Retroviren gehört, der auch der AIDS-Virus
angehört, untersucht worden, was schließlich zur Vollendung der Erfindung
geführt hat.
Die Erfindung betrifft daher ein Mittel zur Bekämpfung von AIDS-Viren und anderen
Viren, das die Ablauge von Zellstoff-Aufschlüssen und/oder davon abgeleitete
Produkte als Hauptbestandteil enthält.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Ablauge von Zellstoff-Aufschlüssen
und/oder davon abgeleiteten Produkten bei der propylaktischen
und/oder therapeutischen Bekämpfung von AIDS-Viren und anderen Viren.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Mittel zur Bekämpfung von AIDS-Viren und
anderen Viren, das die nicht-holzigen (nicht-lignösen) Bestandteile von Hölzern
und/oder Kräutern und/oder davon abgeleitete Derivate als Hauptbestandteil
enthält.
Zunächst ist die Antivirusaktivität und Sulfit-Ablauge bestimmt worden, wobei
sich gezeigt hat, daß die Wirkung gegen NDV-Virus bei etwa 1,5 mg/ml und gegen
RSV-Virus bei etwa 100 µg/ml auftritt. Als nächstes wurde die Sulfit-Ablauge
durch Ultrafilter (vom UK-Typ) in Fraktionen mit Molekulargewichten von 10 000
und 1000 fraktioniert. Die Menge an Zuckern, Asche und Ligninsulfonsäure
wurde in jeder Fraktion bestimmt und die Antivirusaktivität getestet. Die dabei
erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Es hat sich nun herausgestellt, daß die Substanz, die Antivirusaktivität aufweist,
in der Ligninsulfonsäure vorliegt, und daß insbesondere die Fraktion, die eine
hohe Aktivität zeigt, auf der Seite der hohen Molekulargewichte liegt. Diese Fraktion
weist ebenfalls eine starke Antivirusaktivität gegenüber dem HIV-Virus auf.
Diese Tatsache täuscht jedoch nicht darüber hinweg, daß es noch aktive antivirale
Substanzen außer der Ligninsulfonsäure in der Sulfit-Ablauge gibt. Die in der
Erfindung angewendeten Verfahren zur Untersuchung bzw. Austestung der Antivirusaktivität
werden nun nachfolgend aufgezeigt.
Bei der Untersuchung der Anti-NDV-Aktivität vermehrt man primäre CEF-Kulturzellen
(Chick Embryo Fibroblast) auf einer Platte mit 96 Vertiefungen und infiziert
mit dem NDV-Virus. Nach 30 Minuten fügt man dann nach und nach verdünnte
Proben hinzu und beurteilt 24 Stunden später unter dem Mikroskop die
Konzentration, bei der die durch den Virus verursachte Zellfusion inhibiert wird.
Bei der Untersuchung der anti-RSV-Aktivität infiziert man nach der Vermehrung
der CEF-Zellen auf einer Platte mit 96 Vertiefungen mit dem RSV-Virus. Nach 1
Stunde fügt man nach und nach verdünnte Proben hinzu und beurteilt 5 Tage später
die Konzentration, bei der die durch den Virus verursachte Transformation inhibiert
wird.
Für die anti-HIV-Untersuchung verwendet man als Zellen und Virus MT-4-Zellen
(mit HTLV-1-Zellen infizierte humane T-Zellen) bzw. HTLV-IIIb-Virus. Man stellt
das Virusmedium aus dem Überstand von Molt 4/HIVHTLV-IIIb-Zellkulturen, die
HIV-produzierende Zellen sind, her. Der Virustiter beträgt 1 × 10⁶ TCID₅₀/ml. Daneben
verwendet man als Medium RPMI 1640-Zellen (welche Antibiotika enthalten).
Man fügt für die Kultur gleiche Mengen an MT-4-Zellen mit 1 × 10⁶ Zellen/ml
und HTLV-IIIb-Zellen mit 2 × 10⁴ TCID₅₀/ml in jede Vertiefung einer Platte
mit 24 Vertiefungen, die man während 1 Stunde zur Absorbierung des Virus unter
Kulturbedingungen hält. Danach fügt man Probenlösungen, die auf verschiedene
Konzentrationen verdünnt sind, hinzu und gibt schließlich Medium bis auf
ein Volumen von 1 ml hinzu und hält dann während 4 Tagen in einem CO₂-Inkubator
mit einer Temperatur von 37°C unter Kulturbedingungen. Für Vergleichszwecke
stellt man Kulturen mit Zellen, die nicht mit HTLV-IIIb-Virus infiziert
sind und ohne die Zugabe der Probenlösungen her. Man beurteilt die Antiviruswirkung
nach zwei Verfahren, nämlich nach der Inhibierung der durch den HIV-Virus
verursachten Zelldegeneration und nach der Inhibierung der Entwicklung
von spezifischem HIV-Antigen auf der Oberfläche der Zellen. Zunächst beurteilt
man die Wirkung der Zelldegeneration aus der Inhibierung der letalen Wirkung
auf Zellen durch Zugabe der Probe, indem man die Anzahl der lebenden Zellen
nach der Trypanblau-Methode für das 4-Tage-Kulturmedium, welches sowohl
durch den HIV-Virus infiziert und nicht infiziert ist, zählt. Des weiteren fügt man
für die Bestimmung des spezifischen HIV-Antigens, nachdem man die mit Methanol
fixierten Zellen zunächst mit anti-HIV-Humanserum während 40 Minuten
bei 37°C umgesetzt hat, FITC-markiertes anti-human IgG hinzu und läßt während
40 Minuten bei 37°C reagieren und zählt dann die Anzahl der mit Fluoreszenz
markierten Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops aus.
Als nächstes bestimmt man die Antivirusaktivität verschiedener Lignin-Derivate.
Die Ergebnisse sind der Tabelle 2 zu entnehmen. Die Verfahren zur Herstellung
der in dieser Tabelle gezeigten Proben sind die folgenden.
○ Natrium-Ligninsulfonat
Die Herstellung erfolgt durch Behandlung von Calcium-Ligninsulfonat mit Natriumsulfat, wobei die Base ausgetauscht wird.
Die Herstellung erfolgt durch Behandlung von Calcium-Ligninsulfonat mit Natriumsulfat, wobei die Base ausgetauscht wird.
○ Calcium-Ligninsulfonat
Die Herstellung erfolgt durch Kochen von Rotkiefer mit Calciumsulfit-Kochflüssigkeit (CaSO₃).
Die Herstellung erfolgt durch Kochen von Rotkiefer mit Calciumsulfit-Kochflüssigkeit (CaSO₃).
○ Magnesium-Ligninsulfonat
Die Herstellung erfolgt durch Kochen von Rotkiefer mit Magnesiumsulfit-Kochflüssigkeit (MgSO₃).
Die Herstellung erfolgt durch Kochen von Rotkiefer mit Magnesiumsulfit-Kochflüssigkeit (MgSO₃).
○ Kraft-Lignin
Die Herstellung erfolgt durch Kraft-Aufschluß von Rotkiefer und man erhält gebleichten Kraft-Zellstoff (mit einem Rest-Ligningehalt in der Pulpe von 2,0%).
Die Herstellung erfolgt durch Kraft-Aufschluß von Rotkiefer und man erhält gebleichten Kraft-Zellstoff (mit einem Rest-Ligningehalt in der Pulpe von 2,0%).
Die Zusammensetzung der Kraft-Ablauge beträgt 6,2% anorganische Stoffe, 2,8%
Zucker und 6,0% Lignin.
○ Dioxan-Lignin
Die Herstellung erfolgt durch Extraktion von mit einem Alkohol-Benzol-Gemisch behandeltem Holzmehl (von der Fichte), indem man während 2 Stunden bei 175°C in einer Dioxan/Wasser-Flüssigkeit (1 : 1) nach dem Verfahren von Sakakibara et al. erhitzt. Die Ausbeute beträgt etwa 45%.
Die Herstellung erfolgt durch Extraktion von mit einem Alkohol-Benzol-Gemisch behandeltem Holzmehl (von der Fichte), indem man während 2 Stunden bei 175°C in einer Dioxan/Wasser-Flüssigkeit (1 : 1) nach dem Verfahren von Sakakibara et al. erhitzt. Die Ausbeute beträgt etwa 45%.
○ Thioglykolsäure-Lignin
Die Herstellung erfolgt nach den Verfahren nach Brauns et al. in der Weise, daß man zu einer flüssigen Mischung aus Thioglykolsäure mit 2n Chlorwasserstoffsäure entfettetes Holzmehl (von der Birke) hinzufügt und während 7 Stunden erhitzt. Man filtriert dann die Masse und extrahiert den Rest mit 2% Natriumhydroxid nach dem Waschen mit Wasser und Ethanol. Man gewinnt das Lignin nach der Chlorwasserstoffällung.
Die Herstellung erfolgt nach den Verfahren nach Brauns et al. in der Weise, daß man zu einer flüssigen Mischung aus Thioglykolsäure mit 2n Chlorwasserstoffsäure entfettetes Holzmehl (von der Birke) hinzufügt und während 7 Stunden erhitzt. Man filtriert dann die Masse und extrahiert den Rest mit 2% Natriumhydroxid nach dem Waschen mit Wasser und Ethanol. Man gewinnt das Lignin nach der Chlorwasserstoffällung.
○ Sulfomethyliertes Produkt des Kraft-Lignins
Die Herstellung erfolgt in der Weise, daß man zu einer etwa 25%igen Aufschlämmung von Kraft-Lignin Na₂SO₃ (10 bis 20%, bezogen auf Kraft-Lignin) und dann HCHO (äquimolar zu Na₂SO₃) hinzufügt und während 1bis 2 Stunden bei 60 bis 80°C reagieren läßt und dann weiterhin 2 bis 3 Stunden bie 130 bis 150°C weiter reagieren läßt und anschließend abkühlt und trocknet.
Die Herstellung erfolgt in der Weise, daß man zu einer etwa 25%igen Aufschlämmung von Kraft-Lignin Na₂SO₃ (10 bis 20%, bezogen auf Kraft-Lignin) und dann HCHO (äquimolar zu Na₂SO₃) hinzufügt und während 1bis 2 Stunden bei 60 bis 80°C reagieren läßt und dann weiterhin 2 bis 3 Stunden bie 130 bis 150°C weiter reagieren läßt und anschließend abkühlt und trocknet.
Wie aus Tabelle 2 zu ersehen ist, erkennt man Antivirusaktivitäten bei allen in
der Tabelle aufgeführten Lignin-Derivaten, wobei die Ligninsulfonsäuren die
stärkste Antiviruswirkung aufweisen. Außerdem sind die Lignin-Derivate nicht
auf die in der Tabelle gezeigten beschränkt und man kann jedes bekannte Derivat
verwenden.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.
Pro Ansatz dialysiert man unter Verwendung einer Dialysemembran 100 ml der
in Tabelle 1 gezeigten Sulfit-Ablauge gegen Leitungswasser während 4 Tage und
während 3 Tagen gegen destilliertes Wasser. Nach der Dialyse konzentriert man
mit einem Rotationsverdampfer die Flüssigkeit auf etwa 30 ml, führt dann eine
Gefriertrocknung durch und erhält etwa 3,5 g einer Fraktion, die reich an Ligninsulfonsäure
ist. In dieser Fraktion vermindert man sowohl den reduzierenden
Zucker als auch die Asche auf etwa 1/10 im Vergleich zu den Gehalten in der ursprünglichen
Sulfit-Ablauge. Bei der Bestimmung der anti-NDV- und anti-RSV-Aktivitäten
weist diese Fraktion Wirkungen bei 0,5 mg/ml bzw. 0,04 mg/ml auf.
Nachdem man 100 ml der in Tabelle 2 aufgeführten Kraft-Ablauge auf einen pH-Wert
von 3,0 eingestellt hat und somit das Kraft-Lignin gefällt hat, zentrifugiert
man dieses (bei 10 000 min-1) und sammelt die gefällte Fraktion. Diese überführt
man dann durch Trocknen unter vermindertem Druck in ein Pulver und erhält
etwa 4,0 g einer Fraktion, die reich an Kraft-Lignin ist. Nach Suspendierung in destilliertem
Wasser fügt man zur vollständigen Lösung 1n NaOH hinzu und stellt eine
Lösung mit einer Endkonzentration von 1% her. Bei der Bestimmung der anti-NDV-
und anti-RSV-Aktivitäten unter Verwendung dieser Kraft-Lignin-Lösung
erkennt man Wirkungen bei 0,8 mg/ml in Form von Feststoffen.
Unter Verwendung eines Teils der in Tabelle 1 aufgeführten Sulfit-Ablauge mit einer
Fraktion von Molekulargewichten von über 10 000 bestimmt man die anti-HIV-Aktivität.
Die Ergebnisse sind der Tabelle 3 zu entnehmen.
Wie aus den obigen Ergebnissen zu ersehen ist, inhibiert die anti-HIV-Aktivität
der Fraktion der Sulfit-Ablauge mit einem Molekulargewicht von mehr als
10 000 vollständig die durch den Virus hervorgerufene Zelldegeneration und die
Bildung von HIV-spezifischen Antigen bei einer sehr niedrigen Konzentration
von 8 µg/ml. Die Toxizität gegenüber Zellen tritt nur in geringem Maße bei einer
Konzentration von 500 µg/ml auf, was ein Beweis dafür ist, daß diese Fraktion ein
Antivirusmittel mit sehr hohem SI-Index (Selektiver Index) ist.
Claims (7)
1. Mittel zur Bekämpfung von AIDS-Viren und andern Viren enthaltend die
Ablauge von Zellstoff-Aufschlüssen und/oder davon abgeleitete Produkte als
Hauptbestandteil.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ablauge von Zellstoff-Aufschlüssen
Sulfit-Ablauge und/oder Kraft-Ablauge ist.
3. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfit-Ablauge
durch Ultrafiltration, Gelfiltration oder dergleichen fraktioniert worden ist und
die Fraktion mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als etwa 5000 als
Hauptbestandteil vorliegt.
4. Verwendung der Ablauge von Zellstoff-Aufschlüssen und/oder davon abgeleiteten
Produkten bei der prophylaktischen und/oder der therapeutischen Bekämpfung
von AIDS-Viren und anderen Viren.
5. Mittel zur Bekämpfung von AIDS-Viren und anderen Viren enthaltend
Lignin-Derivate als Hauptbestandteil.
6. Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Lignin-Derivate
aus dem Lignin von Hölzern oder Kräutern als Rohmaterial gewonnen worden
sind.
7. Mittel zur Bekämpfung von AIDS-Viren und anderen Viren enthaltend die
nicht-holzigen (nicht-lignösen) Bestandteile von Hölzern und/oder Kräutern
und/oder davon abgeleitete Derivate als Hauptbestandteil.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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