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Neues Chondroitinsulfat und Verfahren zu seiner Herstellung Die Erfindung
betrifft ein Chondroitinsulfat, das gekennzeichnet ist durch ein mittleres Molekulargewicht
von 4000 + 2000 und insbesondere durch ein mittleres Molekulargewicht von 4000 und
eine Intrinsic-Viskosität von 0,7 - 0,8 dl/g. Sie betrifft weiter ein Verfahren
zur Herstellung eines solchen niedermolekularen Chondroitinsulfats sowie dessen
Verwendung für pharmazeutische MittelO Das erfindungsgemäße niedermolekulare Chondroitinsulfat
ist ein pharmazeutisch sehr interessantes Produkt und insbesondere wirksam bei Arteriosklerose
und entzündlichem Rheumatismus sowie der Heilung von Schnitten und Wunden, und zwar
in viel stärkerem Maße als irgendein anderes herkömmliches Präparat.
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Chondroitinsulfat ist ein Schwefelsäureester eines Polysacharids
mit N-Acetylgalactosamin und Uronsäure in äquimolaren Mengen und sein Molekulargewicht,
das Je nach angewandter Herstellungsart beträchtlich schwankt, liegt im allgemeinen
im Bereich zwischen einigen 106 und einigen 104.
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Die Bestimmung der Kettenlänge bzw. des Molekularge wichte vom in
Handel erhältlichen Chondroitinsulfatpräparaten
nach der Methode
von 5. Mo Partridge u. a. (Biochemical Journal, 79, (1961), 15 - 26) liefert Werte,
die im allgemeinen in der Gegend von 20.000 bis 50.000 liegen.
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Derartige Chondroitinsulfate haben sich bereits zur Verhinderung und
Behandlung von Gehörausfall als wirksam erwiesen sowie für Behandlungen von Nephritis
und Nephrosis, von Lebererkrankungen, Neuralgie, Rheumatismus und Augenleiden. Die
biologische Aktivität des Chondroitinsulfats ändert sich jedoch, wenn man vom angegebenen
Molekulargewichtsbereich abgeht und hängt von der NolekUlgröße ab.
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So wurde nun festgestellt, daß ein Chondroitinsulfat mit einem mittleren
Molekulargewicht von 4000 + 2000 überraschenderweise pharmazeutisch ganz besonders
wirksam ist, und gemäß der Erfindung wird ein Verfahren vorgeschlagen9 nach dem
ein Chondroitinsulfat mit dem angegebenen Molekulargewichtsbereich erhalten werden
kann Der vorliegenden Erfindung lag die Idee zugrunde, daß die biologische Aktivität
von Chondroitinsulfat vom Molekulargewicht abhängen sollte. Es wurden daher in Vivo
mit gebräuchlichen hochmolekularen Chondroitinsulfatpräparaten und mit dem erfindungsgemäß
hergestellten niedersolekularen Chondroitinsulfat Testreihen durchgenihrt. Dabei
wurde festgestellt, daß das erfindungsgemä#e Produkt für die Behandlung von entzündlichein
Rheumatismus und Arteriosklerose sowie für die Heilung von Schnitten und Wunden
weit wirksamer ist als die herkömmlichen Präparate. Im Rahmen dieser Untersuchungen
wurden die folgenden Prüfungen durchgeführt: A) Wirkungen bezüglich der Arteriosklerose
(1)
Klärung der Fett-Trübe im Blutplasma (Methode nach Neng u. a. t American Journal
of Physiology, 179, (1954), 314).
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Diese Untersuchungsmethode umfaßt eine intravenöse Injektion von
Chondroitinsulfat beim erwachsenen Hund, Blutentnahme wenige Minuten nach dieser
Injektion, Abtrennung des Plasmas und Mischen desselben mit einer Fettemulsion definierter
Zusammensetzung, Lagerung der Mischung bei 37 °C und Bestimmung der Trübung der
Emulsion in bestimmten Intervallen in Größen der Extinktion bei 700 m/u zur Bestimmung
des Fett-Trübeklärungsfaktors in diesem mit Chondroitinsulfat aktivierten Plasma.
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(2) Biochemische und pathologische Untersuchungen hinsichtlich der
durch Cholesterindiät bedingten Arteriosklerose beim Kaninchen.
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Chondroitinsulfat wurde dem mit einer cholesterinhaltigen Diät gefütterten
bzw. aufgezogenen Kaninchen verabreicht und seine präventive und therapeutische
Wirkung gegenüber der diätetischen Arteriosklerose wurde anhand von verschiedenartigen
biochemischen Prüfungen bestimmt, wie des Gesamtcholesterins im Plasma, des C/P-Verhältnisses
des Gesantcholesterins in der Leber, des Gesamtlipoidgehaltes in der Leber, des
Gesamtcholesterins in der Aorta, des freien Cholesterins in der Aorta US dgl. und
durch pathologische Untersuchung der Aorta B) Wirlmng hinsichtlich des entzündlichen
Rheumatismus
(1) Wärmekoagulation von Protein (Verfahren nach Mizushima
u0 a0; Arch. Intern. Pharmacodynamine, 157, (1965), 115).
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(2) Inhibition des Formalin-Filterpapiergranuloms (Verfahren nach
Tanaka u. a. Endocrinologica Japonica, 2, (1960), 357) (3) Anti-Bradykinin-Aktivität
(4) Inhibition der passiven kutanen Anaphylaxie C) Wirkung hinsichtlich der Beschleunigung
der Wundheilung (1) Förderung der Entwicklung von Fibroblast in Gewebskultur (2)
Zunahme der Wund-Zugfestigkeit.
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Die erhaltenen Prüfungsergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen
1 bis 3 zusammengefaßt.
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Die bei den Prüfungen gefundenen Prozentwerte gemessener Wert der
behandelten Gruppe x 100 gemessener Wert bei der nichtbehandelten Gruppe wurden
in die folgenden Klassen eingeteilt: weniger als 69 % ++ sehr wirksam) 70 - 89 %
+ wirksam) 90 - 95 % ~ mäßig wirksam) mehr als 96 % = (unwirksam) nahezu 100 % 0
Tabelle
1 Wirkung in bezug auf die Arteriosklerose Plasma Leber Aorta
| Mole- Ges.- C/P- Blut- Ge- Ges.- Ges.- Makro- Ges.- Freies-
Wirk- |
| kula- Chole- Ver- druck wicht Chole- Fett skop. Chole- Chole-
sam- |
| gew. sterin hält- sterin Befund Sterin sterin keit |
| nis |
| 31 000 + + 0 - + + - - ~ + |
| 10 000 ~ ~ 0 - - ~ + - + ~ |
| 6 000 ~ + 0 - + ~ + ~ + + |
| 5 300 ++ ++ 0 ~ ++ ++ + ++ + ++ |
| 4000 ++ + 0 + ++ ++ + ++ + ++ |
| 3 500 ++ + 0 + ++ ++ + ++ + ++ |
| 2 200 ~ ~ 0 - ~ + + ++ + + |
| 800 ~ ~ 0 - - - ++ ++ ++ + |
Tabelle 2 Wirkung in bezug auf den entzündl. Rheumatismus
| Molekular- Wärmekoagu- Inhibition des Anti-Bradykinin- Inhibition
der |
| gewicht lation von Formalin-Filter- Aktivität passiven kutanen |
| Protein papiergranuloms Anaphylaxie |
| 31 000 - + - - |
| 10 000 - ~ - - |
| 6 000 + + ~ + |
| 5 300 ++ + + + |
| 4 000 +++ + + + |
| 3 500 ++ + + + |
| 2 200 + + + + |
| 800 - + + - |
Tabelle 3 Wirkung in bezug auf die Beschleunigung der Wundheilung
| Molekulargewicht Entwicklung von Zunahme der Wund-Zug- |
| Fibroblast festigkeit |
| 31 000 + - |
| 10 000 - - |
| 6 000 ++ + |
| 5 300 ++ ++ |
| 4 000 +++ +++ |
| 3 500 ++ ++ |
| 2 200 ++ ++ |
| 800 + + |
Wie die Ergebnisse dieser Tabellen zeigen, ist das niedermolekulare
Chondroitinsulfat mit einem Molekulargewicht von 2000 bis 6000 für therapeutische
Zwecke weit wirksamer als das herkömmliche Chondroitinsulfat mit einem Molekulargewicht
von etwa 20.000 bis 50. 000.
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Mit der Abnahme des Molekulargewichtes des Chondroitinsulfats verschwindet
allmählich die Metachromasie-Reaktion, die für diese Verbindung charakteristisch
ist, und die Absorption des Sulfatrestes im IR-Abs orptionsspektrum nimmt allmählich
ab, wie den angefügten Kurven Fig. 1 und 2 zu entnehmen ist man kann daher annehmen,
daß sich die vorliegende Verbindung in einem Zustand gerade eben vor dem Verlust
der Chondroitincharakteristiken befindet.
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Von den angefügten Kurven zeigt die obere, Fig. 1, das Spektrum für
ein handelsübliches Chondroitinsulfat und die untere, Fig. 2, für ein niedermolekulares
Chondroitinsulfat gemäß der Erfindung.
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Es wurde ebenfalls gefunden, daß Chondroitinsulfat mit einem Molekulargewicht
von 800 die oben angegebenen Charakteristiken bereits verloren hat und daß die IR-Absorptionsbande
der Verbindung mit einem Molekulargewicht von 10.000 wenig Veränderung zeigt.
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Als Verfahren zur Verminderung des Molekulargewichts von Chondroitinsulfat
war bereits das Aufheizen desselben mit verdünnter Säurelösung bekannt. So wird
beispielsweise in der japanischen Patentschr ift Publikations-Nr. 7630/ 1964 angegeben,
da# Chondroitinsulfat 108 Stunden land mit 0,05 n wä#riger Salzaäure auf 100 °C
aufgeheizt werden soll.
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Dieses Verfahren hat Jedoch viele Nachteile und kann nicht direkt
zur Herstellung des erfindungsgemäßen Produktes angewandt werden. Es ist in der
praktischen Durchrührung ungünstig, da eine Temperatur von 100 OC über eine lange
Zeit hinweg konstantgehalten werden muß. Vor allem aber liegt das Molekulargewicht
des so hergestellten Chondroitinsulfats in der Gegend von etwa 800, also ganz offensichtlich
außerhalb des Bereiches der erfindungsgemäß erstrebten Produkte.
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Das für medizinische Behandlungen brauchbare erfindungsgemäße Chondroitinsulfat
mit einem mittleren Molekulargewicht von 4000 1 2000 kann also nach den bisher bekannten
gebräuchlichen Verfahren nicht hergestellt werden.
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Es wurde daher ein neues Verfahren entwickelt unter Festlegung der
idealen Bedingungen, nämlich einer höheren Säurekonzentration, einer niedrigeren
Temperatur und einer kürzeren Behandlungsdauer, für die Gewinnung eines verbesserten
Chondroitinsulfats mit einem Molekulargewicht von 4000 ~ 2000 und der geringsten
Verfärbung.
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Temperaturen über 95 °C sollten bei der Zersetzung von Chondroitinsulfat
mit Säure vermieden werden, da der Dampfdruck bei Temperaturen über 95 °C relative
hoch ist, was wiederum die Konstanthaltung der Zersetzungstemperatur innerhalb eines
definierten Bereiches schwierig macht.
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Weiterhin sind so hohe Temperaturen ungeeignet, da die Zersetzungsreaktion
dann zu rasch fortschreiten und zu Chondroitinsulfat mit unerwünscht niedrigem Molekulargewicht
fUhren kann. Beispielsweise kann das handelsübliche Chondroitinsulfat bei solchen
Temperaturen bei Verwendung von 0,1 n Salzsäurelösung innerhalb von zwei Stunden
zu einer Verbindung mit einem Molekulargewicht von etwa 2000 zersetzt bzw. abgebaut
werden.
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Aus praktischen Gründen ist es wünschenswert, die Reaktionszeit innerhalb
von 24 Stunden und vorzugsweise auf etwa 10 Stunden festzusetzen.
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Obgleich in Verbindung mit der entsprechenden Aufheiztemperatur und
Zeit irgendeine beliebige Säurekonzentration gewählt werden kann, ist es in Anbetracht
der nachfolgenden Neutralisation und Trennverfahren zweckmäßig, eine 0,1 bis 1 n
Säure beim erfindungsgemäßen Verfahren zu verwenden.
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Die untere Grenze für die Zersetzungstemperatur muß dann auf 35 Oc
festgesetzt werden, da das gewünschte Produkt mit einem Molekulargewicht von 4000
+ 2000 selbst mit einer 1 n Säure und einer 24 Stunden dauernden Behandlung bei
tieferen Temperaturen nicht mehr erhalten werden kann.
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Die mit der sauren Zersetzung von Chondroitinsulfat einhergehende
Verfärbung ist bei einem Abbau bis zu einem Molekulargewicht von 2000 nicht so bedeutend,
Jedoch bei weiter fortschreitender Zersetzung sehr kräftig. Es wurde weiter gefunden,
daß selbst bei einer sorgfältig überwachten sauren Zersetzung zur Erzielung des
Produktes mit vor bestimmtem Molekulargewicht mit zunehmender Reaktionstemperatur
und/odor Reaktionsdauer ein dunkleres Produkt rhalten werden kann.
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Abgesehen von diesen Laboratoriumsbefunden wurde festgestellt, daß
bei der tatsächlichen Produktion von niedermolekularem Chondroitinsulfat eine b.träohtliohe
Verfärbung auftritt, selbst bei einem Produkt mit einem Molekulargewicht von etwa
4000. Als Grund daher wurde g*-funken, daß das Material der Produktionseinrichtun£en
einen
großen Einfluß auf die Verfärbung des Produktes hat. Bei der Vorrichtung zur Durchführung
der sauren Zersetzung muß daher selbst bei kleinen Teilen, wie beispielsweise dem
Rührer oder Ventilen, streng darauf geachtet werden, daß kein Metall mit der Reaktionsmischung
in Berührung kommt. Ebenso werden für alle anderen Verfahrensschritte neben der
sauren Zersetzung nichtmetallische oder mit einem nichtmetallischen Material ausgefütterte
Vorrichtungen benutzt.
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Nach Behandlung des Chondroitinsulfats unter den vorgenannten Bedingungen
wird die Reaktionsmischung rasch auf Raumtemperatur abFekdhlt und neutralisiert,
um den weiteren Fortschritt der sauren Abbaureaktion zum Stillstand zu bringen,
Bei der Neutralisation wird der pH-Wert der Reaktionsmischung auf 4,5 bis 5,5 eingestelltg
und zwar mit einer alkalischen Lösung. Wenn der pH-Wert die obere Grenze überschreitet,
verfärbt sich die Mischung allmählich abhängig von der Zunahme des pH-Wertes und
wenn letzterer 7,0 übersteigt, wird die Verfärbung schlagartig stärker.
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Als alkalische Lösung für die Neutralisation wird bevorzugt eine
wäßrige Lösung von schwachem Alkali, wie Natriumcarbonat oder Kaliumcarbonat, verwendet.
Starke Alkalien, wie Natriumhydrozyd, müssen vermieden werden, da mit deren Anwendung
im allgemeinen eine unerwünschte Verfärbung auftritt. Man kann annehmen, daß diese
Erscheinung auf einen übermäßigen Anstieg des pH-Wertes an örtlich begrenzten Stellen
der Reaktionsmischung zurUckzuführen ist Nach der Neutralisation enthält die so
erzielte Lösung
von niedermolekularem Chondroitinsulfat im allgemeinen
Sulfat, das sich'vom Chondroitinsulfat ableitet, übermäßig zersetztes Chondroitinsulfat
und andere Salze zusammen mit dem gewünschten Produkt. Es ist daher notwendig, letzteres
durch Anwendung geeigneter Füllungsmethoden von den anderen Verunreinigungen abzutrennen.
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Wenn Äthanol als Fällungsmittel verwendet wird, kann der Erfolg oder
Mißerfolg dieser Fällung von der Chondroitinsulfatkonzentration in der ursprtinglichen,
für die Zersetzung verwendeten Lösung abhKngenO Wenn die Chondroitinsulfatkonzentration
in der Lösung nach der Zersetzung geringer als 3 % ist, findet selbst bei einem
direkten Zusatz einer größeren Äthanolmenge zu der Lösung wie z. B. von bis zu 90
% (V/v) bezogen auf das Gesamtvolumen der Lösung keine Ausfällung des gewünschten
Produktes statt. Wenn also die Chondroitinsulfatkonzentration nach der sauren Zersetzung
und Neutralisation für die Ausfällung des Produktes zu gering ist, muß die Lösung
vor dem Zusatz von Äthanol eingeengt werden, und zwar zweckmäßig im Vakuum, da bei
Temperaturen über 50 OC unerwünschte Verfärbungen der Lösung auftreten können.
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Wenn die Chondroitinsulfatkonzentration dagegen in der anfänglichen
Lösung über 4 % liegt, kann die Lösung nach der sauren Zersetzung und Neutralisation
zur Ausfällung des gewünschten niedermolekularen Chondroitinsulfats direkt mit Äthanol
versetzt werden.
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Allerdings ist darauf zu achten, daß die für die saure Zersetzung
angewandte Säurekonzentration in Abhängigkeit von der Zunahme der Chondroitinsulfatkonzentration
der Lösung erhöht werden muß. Wenn die Chondroitinsulfatkonzentration zu Beginn
beispielsweise 2 % beträgt, muß die
Salzsäurekonzentration für
die Zersetzung von handelsüblichem Chondroitinsulfat bei 75 C und zur Erzielung
des gewünschten Produktes mit einem Molekulargewicht von 4000 innerhalb von 5 Stunden
bei 0,1 n liegen und bei einer Chondroitinsulfatkonzentration von 10 % bei 0,3 n.
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Mit 0,1 n Salzsäure bei einer 10prozentigen Chondroitinsulfatkonzentration
kann das gewünschte niedermolekulare Chondroitinsulfat selbst bei einer längeren
Aufheizzeit von etwa 24 Stunden nicht erzielt werden.
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Bei Verwendung einer Lösung mit 4 % Chondroitinsulfat und darüber
wird die Lösung nach der sauren Zersetzung neutralisiert und dann zur Ausfällung
des niedermolekularen Chondroitinsulfits mit dem 7- bis 8fachen des Volumens an
95prozentigem (V/V) Äthanol versetzt. Auf diese Weise kann die gewünschte Verbindung
bzw. das gewünschte Produkt leicht von den begleitenden Verunreinigungen abgetrennt
werden. Das vorliegende niedermolekulare Chondroitinqulfat (M.G. 4000 + 2000) unterscheidet
sich von dem bekannten Chondroitinsulfat mit einem Molekulargewicht von etwa 800
auch hinsichtlich der Intrinsio-Viskosität. So liegt beispielsweise die Intrinsic-Viskosität
von Chondroitinsulfat mit einem mittleren Molekulargewicht von 4000 bei 0i bis 0,3
dl/g, während die Intriniic-Viskosität des bekannten Produktes mit einem Molekulargewicht
von 800 bei 0,03 dl/g liegt.
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Es folgen Beispiele zur Erläuterung der Erfindung: Beispiel 1 650
1 destilliertes Wasser werden in einen mit Glas ausgekleideten, geschlossenen Behälter
bzw. Tank mit einem
Doppelmantel gebracht, durch den zu zur Aufrechterhaltung
einer Temperatur von 65 + 1 °C heißes Wasser geleitet wird. 15 kg handelsübliches
Chondroitinsulfat (mittleres Molekulargewicht: 29.000) werden hinzugefügt und in
diesem Wasser unter Verwendung eines mit Glas überzogenen Rührers gelöst. Nach dem
Auflösen wird die Lösung allmählich mit 12,9 1 36prozentiger Salzsäure unter Rühren
versetzt und dann mit destilliertem Wasser bis auf 750 1 verdünnt. Die Säurekonzentration
der Lösung beträgt nun 0,2 n. Diese Lösung wird 10 Stunden lang bei 65 + 1 0C mäßig
gerührt und dann rasch durch Einbringen von kaltem Wasser in den Doppelmantel gekühlt.
Danach werden allmählich 125 1 einer 4prozentigen wäßrigen Natronlauge zur Einstellung
des pH-Wertes der isösung auf 4,8 zugegeben. Die so behandelte Lösung wird dann
im Vakuum auf etwa die Hälfte eingeengt. 425 1 des so erhaltenen Konzentrats" werden
zu 3400-l 95prozentigem Äthanol unter Rühren zugegeben und die Mischung wird weitere
drei Stunden gerührt0 Danach wird die Ausfällung durch Anwendung einer Art Entrahmungszentrifuge
(bulk-skiming type centrifugal machine) abgetrennt. Die Ausfällung wird dann zum
Waschen wieder in 95prozentigem Äthanol suspendiert und erneut zentrifugiert. Die
so abgetrennte Ausfällung wird dann über einen flachen Trog bzw. ein Tablett ausgebreitet
und im Vakuum getrocknet. Man erhalt auf diese Weise 13,8 kg eines gelben niedermolekularen
Chondroitinsulfats (Molekulargewicht: 3700).
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Beispiel 2 Es wurde die gleich. Vorrichtung wie in Beispiel 1 verwendet.
15 kg handelsübliches Chondroitinsulfat' (mittleres Molekulargewicht: 31.000) wurden
in destilliertem
Wasser bei 80 + 1 °C gelöst. Zu dieser Lösung
wurden 6,75 kg Oxalsäure hinzugegeben und die Lösung dann mit Wasser auf 750 1 verdilunt.
Die Säurekonzentration beträgt 0,1 n0 Diese Lösung wird unter mäßigem Rühren 12
Stunden lang bei 80 1 1 OC gehalten dann gekühlt und mit 8,0 kg Calciumcarbonat
portionsweise versetzt. Bei der Zugabe von Calciumcarbonat tritt eine Ausfällung
von Calciumoxalat auf und der pH-Wert der Lösung erreicht 5,1. Nach Abtrennung der
Calciumozalat-Ausfällung über ein mit Filterhilfen bedecktes Blatt- oder Bandfilter
(leaf-type filter) wird das Filtrat in Vakuum bei 40 oC auf etwa die Hälfte des
ursprdnglichen Volumens eingeengt und mit dem 8fachen Volumen an 95prozentigem Äthanol
zur Ausfällung des gewünschten Produktes versetzt. Nach der Abtrennung wird die
Ausfällung mit 95prozentigem Äthanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Auf diese
Weise werden 11,4 kg eines weißen niedermolekularen Chondroitinsulfats (Molekulargewicht:
3300) erhalten.
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Beispiel 3 Es wurde die gleiche Vorrichtung wie in Beispiel 1 verwendet.
40 kg handelsübliches Chondroitinsulfat (mittleres Molekulargewicht: 31.000) wurden
in 650 1 destilliertem Wasser bei 73 OC gelöst, und es wurden dann 11,2 1 36prozentige
Salzsäure zugegeben. (Die Säurekonzentration liegt dann bei 0,2 n), Diese Lösung
wird unter gelindem Rühren 8 1/2 Stunden bei 73 + 2 °C gehalten und dann abgekühlt
und mit 6,8 kg Natriumcarbönat versetzt. Der pH-Wert der Lösung beträgt dann 4,6.
Zu dieser Lösung wird dann das 7fache Volumen an 95prozentigem Äthanol zugegeben
und die Ausfällung abgetrennt, mit Äthanol gewaschen
und im Vakuum
getrocknet. Man erhält auf diese Weise 37 kg niedermolekulares Chondroitinsulfat
(Molekulargewicht: 4400) in Form eines weißen Pulvers. Die nachfolgende Tabelle
zeigt verschiedene Analysendaten für dieses Produkt0 Tabelle Analyse-Ergebnisse
Prüfung Ergebnis Bemerkung Elson-Morgan-Reaktion + pH 5,46 der lprozentigen Lösung
NaCl-Gehalt 0,76 % Ca++ Schwermetalle 20 ppm U.S0P.
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As 10 ppm U.S.P.
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Farbe 0,055 E1 % (450 m u) 5 cm Molekulargewicht 4 400 Chondroitinsulfatgehalt
88,9 % Carbazolreaktion Verlust beim Trocknen 2,27 % U. S. P.
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Verbrennungsrückstand 26,88 % U.S.P.