JP5610339B2

JP5610339B2 - α−グルコシダーゼ阻害剤及び糖類の製造方法

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Publication number: JP5610339B2
Application number: JP2010147574A
Authority: JP
Inventors: 明彦室田; 要鬘谷; 三保子本
Original assignee: Meiji University
Current assignee: Meiji University
Priority date: 2010-06-29
Filing date: 2010-06-29
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2030-06-29
Also published as: JP2012012430A

Description

本発明は、新規のα−グルコシダーゼ阻害剤、及びその製造に好適な糖類の製造方法に関する。

α−グルコシダーゼは、α−グルコシド結合に作用して糖質を分解する酵素であり、ヒトではすい臓や小腸上皮細胞で分泌される。そして、α−グルコシダーゼ阻害剤は、糖質の分解を抑制するので、例えば、血糖値や体重を適正な範囲に維持するための医薬品としての有用性が高い。
このような医薬品として有用なα−グルコシダーゼ阻害剤を、豊富に存在する天然資源を利用して効率良く製造できれば、極めて有用である。

これに対して、天然資源を利用したα−グルコシダーゼ阻害剤としては、コンドロイチン硫酸Ｄを有効成分とするものが開示されている（特許文献１参照）。
ところで、コンドロイチン硫酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸とからなる多糖類で、その一部の炭素原子が硫酸エステル化されたものであり、該ガラクトサミンの４位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ａ、該ガラクトサミンの６位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ｃが存在し、これら以外にも、コンドロイチン硫酸Ｂ、Ｄ、Ｅ及びＫも存在する（化学便覧第６版応用化学編Ｉ）。

コンドロイチン硫酸は、動物の結合組織の基質部分として、軟骨、ガラス体、角膜、大動脈などに広く分布し、多くの場合ヒアルロン酸と共存している。
例えば、コンドロイチン硫酸Ａは、牛や馬の鼻軟骨やクジラの鼻軟骨に含まれる。コンドロイチン硫酸Ｂは、ブタの皮膚等に含まれることが知られている。コンドロイチン硫酸Ｃは、ブタやサメ由来のものが主流であり、比較的高純度のものが市販されている。コンドロイチン硫酸Ｄは、エイの軟骨やニジマス、大西洋サケなどの鼻軟骨に含まれていると言われているが、市販されている試薬で高純度のものはほとんどない。コンドロイチン硫酸Ｅは、イカの軟骨などに含まれている。コンドロイチン硫酸Kは、カブトガニの軟骨に含まれることが知られている。しかしながら、これらコンドロイチン硫酸Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋを単離することは容易ではない。

このように、コンドロイチン硫酸は、その由来に応じて様々な構造を有している。そして、特許文献１によれば、これらのうちのＤユニットを構成単位とするコンドロイチン硫酸Ｄのみがα−グルコシダーゼ阻害活性を有しているとされ、コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃに関しては、いずれもα−グルコシダーゼ阻害活性をほとんど示さないとされている。

特開２００５−２６３６８８号公報

このような中、上記のように、α−グルコシダーゼ阻害剤は、血糖値や体重を制御する医薬品としての利用価値が高く、特許文献１に開示されているものをはじめとする従来のものとは異なる、より低分子量で、製造が容易な新たなα−グルコシダーゼ阻害剤を求める要望が多い。
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、新規なα−グルコシダーゼ阻害剤を提供することを課題とする。

上記課題を解決するため、
本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸とからなる多糖類で、該ガラクトサミンの４位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ａ、及び該ガラクトサミンの６位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ｃを主たる構成単位とするコンドロイチン硫酸を加水分解し、質量平均分子量を５７００Ｄａ〜２５０００Ｄａとした分解物を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤を提供する。
また、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸とからなる多糖類で、該ガラクトサミンの４位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ａ、及び該ガラクトサミンの６位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ｃを主たる構成単位とするコンドロイチン硫酸を含有する水溶液に、加圧及び加熱条件下、二酸化炭素ガスを作用させて、前記コンドロイチン硫酸を加水分解し、質量平均分子量が５７００Ｄａ〜２５０００Ｄａである糖類を生じさせる工程を有する糖類の製造方法を提供する。

本発明によれば、新規なα−グルコシダーゼ阻害剤を提供できる。

実施例１における原料の^１Ｈ−ＮＭＲによる解析結果を示す図である。実施例１における原料の^１３Ｃ−ＮＭＲによる解析結果を示す図である。実施例１における原料のＤＱＦ−ＣＯＳＹによる解析結果を示す図である。実施例１における原料のＴＯＣＳＹによる解析結果を示す図である。実施例１における原料のＨＭＱＣによる解析結果を示す図である。実施例１における原料のＨＭＢＣによる解析結果を示す図である。実施例１における加水分解反応時の反応時間ごとの反応液のＧＰＣによる解析結果を示す図である。実施例１における原料と分解物１〜６の^１Ｈ−ＮＭＲによる解析結果を示す図であり、（ａ）は、ＮＭＲスペクトルの全体図を、（ｂ）は３〜５ｐｐｍの拡大図をそれぞれ示す。実施例１における分解物１〜６の質量平均分子量とα−グルコシダーゼの阻害率（％）との関係を示すグラフである。実施例２における分解物６の濃度とα−グルコシダーゼの阻害率（％）との関係を示すグラフである。

以下、本発明について、詳細に説明する。なお、本発明において、分子量の単位として示す「Ｄａ」は「ダルトン」を意味する。

＜α−グルコシダーゼ阻害剤＞
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸とからなる多糖類で、該ガラクトサミンの４位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ａ、及び該ガラクトサミンの６位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ｃを主たる構成単位とするコンドロイチン硫酸を加水分解し、質量平均分子量を２５０００Ｄａ以下とした分解物（以下、単に「分解物」と略記することがある）を有効成分とする。

本発明において、「コンドロイチン硫酸Ａ」とは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸とからなる多糖類で、該ガラクトサミンの４位の炭素原子が硫酸エステル化されたＡユニットを有する、下記式（１）で表される二糖を構成単位として含むものである。そして、「コンドロイチン硫酸Ｃ」とは、前記多糖類で、該ガラクトサミンの６位の炭素原子が硫酸エステル化されたＣユニットを有する、下記式（２）で表される二糖を構成単位として含むものである。
そして、本発明における「コンドロイチン硫酸」とは、前記コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃを主たる構成単位とするものであり、その他の構成単位として、天然資源中に不可避的に存在する糖鎖や、ペプチド等を含んだものも使用できる。

前記コンドロイチン硫酸は、軟骨、骨、軟骨腫、頸靭帯、角膜、血管壁、腱等の結合組織に広く存在しており、その由来する部位は特に限定されない。また、由来する動物もブタやサメをはじめ、種々のものが知られており、特に限定されないが、サメ由来であるものが好ましい。

前記分解物は糖類であり、質量平均分子量が２５０００Ｄａ以下であり、５７５Ｄａ〜２５０００Ｄａであることが好ましく、５７００Ｄａ〜２００００Ｄａであることがより好ましい。コンドロイチン硫酸の分解物で、このような低分子量のものは、従来知られていない。
また、前記分解物は、数平均分子量が２３０００Ｄａ以下であることが好ましく、４３１Ｄａ〜２３０００Ｄａであることがより好ましく、４３００Ｄａ〜１８０００Ｄａであることが特に好ましい。

前記分解物は、薬学上許容される塩であっても良い。前記分解物は、例えば、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、硫酸基（−ＯＳＯ_３Ｈ）、水酸基（−ＯＨ）等の水素イオン（Ｈ^＋）が解離し得る基を有しており、このような塩を形成し得る基の少なくとも一つにおいて、解離した水素イオンがその他のカチオンに置換されて、塩を形成していても良い。なお、水素イオンが解離し得る基は、上記のものに限定されず、コンドロイチン硫酸の種類によっては、例えば、スルホン酸基（−ＳＯ_３Ｈ）、リン酸基（−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）−（ＯＨ）_２）等のその他の酸基も例示でき、塩の形成部位が、コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃ以外の構成単位にあっても良い。

前記分解物の薬学上許容される塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩等が例示できる。塩の形成部位が複数である場合には、これら複数の塩はすべて同じでも良いし、一部が同じでも良く、すべて異なっていても良い。

好ましい有効成分としては、前記分解物のうち、コンドロイチン硫酸のＡユニットとＣユニットとの比率（Ａユニット：Ｃユニット）が、１．０：５．０〜１．０：１００であるものが例示できる。なお、ここでの「比率」とは、前記分解物を^１Ｈ−ＮＭＲで解析した時の、Ａユニットに由来するピークの積分値と、Ｃユニットに由来するピークの積分値との比率のことを指す。

前記コンドロイチン硫酸を加水分解する方法は、質量平均分子量が２５０００Ｄａ以下である分解物が得られる限り、特に限定されない。
例えば、加水分解は、前記コンドロイチン硫酸を含有する水溶液に、加圧及び加熱条件下、二酸化炭素ガスを作用させて行う。

加圧時の圧力は、０．２ＭＰａ以上であることが好ましく、０．２〜１．５ＭＰａであることがより好ましく、０．２〜０．７ＭＰａであることが特に好ましい。
加熱時の温度は、１０５℃以上であることが好ましく１０５〜１５０℃であることがより好ましく、１０５〜１３０℃であることが特に好ましい。
加熱時間は、加熱時の温度等、その他の条件を考慮して適宜設定すれば良いが、加熱時の温度が上記範囲内である場合には、３〜４８時間であることが好ましく、８〜３６時間であることがより好ましく、１２〜２８時間であることが特に好ましい。

加水分解反応は、バッチ式及び連続式のいずれで行っても良い。

前記分解物は、加水分解後の反応液から容易に取り出すことができる。
例えば、前記分解物の分離には、透析等の膜分離を適用するのが好適であり、前記分解物のうち、所望の分子量のものを分離できる膜を選択すれば良い。
また、適宜必要に応じて、ろ過、洗浄、抽出、ｐＨ調整、脱水、濃縮等の後処理を行っても良い。
そして、最終的に前記分解物は、例えば、結晶化、凍結乾燥、カラムクロマトグラフィー等の手段により取り出せば良い。さらに、必要に応じて、これら手段を繰り返すことで、精製を行っても良い。

得られた前記分解物は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、^１Ｈ−ＮＭＲ等の解析により同定できる。
また、前記分解物の質量平均分子量は、例えば、ＨＰＬＣで各分解物のピークを分離し、分子量測定用のソフトウェアを使用することで測定できる。

本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤の製剤形態は特に限定されず、目的に応じて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、細粒剤、液剤（水薬等）等の経口剤；吸入剤、座剤、注射剤、貼付剤、スプレー剤、軟膏等の非経口剤等から適宜選択すれば良い。これら製剤形態のα−グルコシダーゼ阻害剤は、いずれも公知の方法で製造できる。

α−グルコシダーゼ阻害剤を経口剤等の製剤形態とする場合には、これら製剤の製造で通常使用される各種添加剤を配合しても良い。前記添加剤としては、賦形剤、滑沢剤、可塑剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、矯味剤、着色剤、香料等が例示できる。
前記添加剤は、一種を単独で使用しても良いし、二種以上を併用しても良い。二種以上を併用する場合には、その組み合わせ及び比率は、目的に応じて適宜選択すれば良い。

前記賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、果糖、デキストリン、デンプン、食塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、無水ケイ酸、カオリン等が例示できる。

前記滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、タルク、トウモロコシデンプン、マクロゴール等が例示できる。

前記可塑剤としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセリン類、トリアセチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、アセチルグリセリン脂肪酸エステル、クエン酸トリエチル等が例示できる。

前記結合剤としては、ゼラチン、アラビアゴム、セルロースエステル、ポリビニルピロリドン、水飴、甘草エキス、トラガント、単シロップ等が例示できる。
前記崩壊剤としては、デンプン、カンテン、カルメロースカルシウム、カルメロース、結晶セルロース等が例示できる。
前記湿潤剤としては、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

前記矯味剤としては、白糖、ハチミツ、サッカリンナトリウム、ハッカ、ユーカリ油、ケイヒ油等が例示できる。
前記着色剤としては、酸化鉄、β−カロテン、クロロフィル、水溶性食用タール色素等が例示できる。
前記香料としては、レモン油、オレンジ油、ｄｌ−メントール、l−メントール等が例示できる。

α−グルコシダーゼ阻害剤を吸入剤、注射剤、貼付剤、スプレー剤、軟膏等、非経口剤の製剤形態とする場合には、使用できる溶媒として、注射用蒸留水、無菌の非水性溶媒、懸濁剤等が例示できる。非水性溶媒又は懸濁剤の基剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、オリーブ油、コーン油、オレイン酸エチル等が好ましいものとして例示できる。

さらに、α−グルコシダーゼ阻害剤を貼付剤等、非経口剤の製剤形態とする場合には、有効成分等の各成分と基剤との混合物を、布、紙、プラスチックフィルム等に薄く塗布すれば良い。

本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤には、本発明の効果を妨げない範囲内で、上記成分以外の薬学上許容される任意成分を、必要に応じて適宜配合しても良い。
前記任意成分としては、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤等が例示できる。

α−グルコシダーゼ阻害剤の投与量は、患者の年齢、症状等により適宜調節することが好ましい。例えば、通常、成人一人一日あたり、前記分解物の投与量として、０．１〜５０ｍｇ／人であることが好ましい。
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、所定量を一日に一回又は複数回に分けて投与される。

α−グルコシダーゼ阻害剤に関し、特開２００５−２６３６８８号公報には、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ、Ｄ及びＥのうち、α−グルコシダーゼ阻害活性を有するのは、コンドロイチン硫酸Ｄのみであることが開示されている。
すなわち、本発明における前記コンドロイチン硫酸の加水分解物が、α−グルコシダーゼ阻害活性を有することは、上記の開示内容に照らして、全く意外なものであると言える。また、特開２００５−２６３６８８号公報には、コンドロイチン硫酸Ｄがα−グルコシダーゼの活性を、最大で８０〜９０％程度阻害することが記載されている。これに対して、本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、９５％程度の阻害率を示すものがあり、極めて阻害活性が高い。

＜糖類の製造方法＞
本発明の糖類の製造方法は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸とからなる多糖類で、該ガラクトサミンの４位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ａ、及び該ガラクトサミンの６位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ｃを主たる構成単位とするコンドロイチン硫酸を含有する水溶液に、加圧及び加熱条件下、二酸化炭素ガスを作用させて、前記コンドロイチン硫酸を加水分解し、質量平均分子量が２５０００Ｄａ以下である糖類を生じさせる工程を有する。かかる製造方法によって得られる糖類は、特に質量平均分子量が２５０００Ｄａ以下であるものが、α−グルコシダーゼ阻害剤の有効成分として好適である。

以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。

以下に示す実施例で使用したコンドロイチン硫酸（ゼリア新薬工業株式会社、サメ由来）は、通常の^１Ｈ−ＮＭＲ、^１３Ｃ−ＮＭＲによる解析に加え、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣによる解析を組み合わせて行った結果、前記コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃを主たる構成単位とするコンドロイチン硫酸であることを確認した。この時のコンドロイチン硫酸Ａとコンドロイチン硫酸Ｃとの比率（Ａユニット：Ｃユニット、^１Ｈ−ＮＭＲでの積分値の比率）は、１．０：９．９であった。^１Ｈ−ＮＭＲによる解析結果を図１に、^１３Ｃ−ＮＭＲによる解析結果を図２に、ＤＱＦ−ＣＯＳＹによる解析結果を図３に、ＴＯＣＳＹによるによる解析結果を図４に、ＨＭＱＣによる解析結果を図５に、ＨＭＢＣによる解析結果を図６に、それぞれ示す。使用したＮＭＲ装置及び試薬は、以下の通りである。
（ＮＭＲ装置及び試薬）
ＪＥＯＬＥＣＡ５００ＮＭＲ（日本電子データム社製）
マグネット：１１．７４Ｔ
ボア径：５４／８９ｍｍ
解析ソフトウェア：ＡＬＩＣＥ１ＤＶｅｒｓｉｏｎ４、ＤｅｌｔａＶｅｒｓｉｏｎ４．３．６
ＮＭＲサンプル管：ＨＩＰ−７（ＭｉｌｍａｄＬａｂＧｒａｓｓ社製）
内標準物質：ＩＳＯＴＥＣ^ＴＭＴＳＰ−ｄ_４９８ＡＴＯＭ%Ｄ
重溶媒：ＩＳＯＴＥＣ^ＴＭＤ_２Ｏ９９．９ＡＴＯＭ%Ｄ

［実施例１］
＜コンドロイチン硫酸の加水分解物の調製＞
コンドロイチン硫酸（原料）５．００ｇと超純水５００ｍＬを反応容器に入れ、反応容器を開放系にした上で、二酸化炭素ガス（世田谷酸素商事社製）を注入し、３０℃に昇温しながら２０分間バブリングした。これにより、溶媒中に溶存している二酸化炭素の量を一定にした。
次いで、反応容器内を密閉し、二酸化炭素ガスで０．３ＭＰａまで圧力を上げた。
次いで、昇温して、圧力を一定に保ちながら、表１に示すように所定温度で所定時間反応させた。
次いで、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／ＰｏｒＢｉｏｔｅｃｈＣｅｌｌｕｏｓｅＥｓｔｅｒ（ＣＥ）ＤｉａｌｙｓｉｓＭｅｍｂｒａｎｅｓ、ＭＷＣＯ：１０００、直径２９ｍｍ×４５ｍｍ×５ｍ、フナコシ社製）を使用して、反応後の反応液を、超純水を用いて２４時間透析し、オリゴペプチドを反応液から除去した。この間、透析開始から３時間後及び６時間後に超純水を交換した。
次いで、透析後の反応液を凍結乾燥して、コンドロイチン硫酸の加水分解物（分解物１〜６）を得た。

下記装置及び条件による高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行い、分子量測定ソフトウエア（ＥＺＣＨＲＯＭ、ＧＬＳＣＩＥＮＣＥ社製）を使用して、得られた分解物１〜６の分子量を測定した。測定結果を表１に示す。表１中、「Ｍｗ」は質量平均分子量を、「Ｍｎ」は数平均分子量を、「Ｍｐ」はピークトップ分子量を、「Ｍｗ／Ｍｎ」は分散度を、それぞれ示す。

（ＨＰＬＣ装置及び条件）
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００Ｂｉｎ．Ｐｕｍｐ
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００Ｄｅｇａｓｓｅｒ
ＲＩ検出器：ＪＡＳＣＯＲＩ２０３１ｐｌｕｓ
カラム：ＳＨＯＤＥＸＫＳ−８０４（排除限界：４０００００）、ＳＨＯＤＥＸＫＳ−８０２（排除限界：１００００）
サンプルループ：ＰＨＥＯＭＹＮＥ５００μＬループ
溶離液：０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ−リン酸緩衝液
分子量計算ソフト：ＥＺＣＨＲＯＭ（ＧＬＳＣＩＥＮＣＥ社製）

「Ｃｈｅｖｏｌｏｔ，Ｌ．ｅｔａｌ．，ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ１９９９，３１９，１５４．」、「Ｂｏｉｓｓｏｎ−Ｖｉｄａｌ，Ｃｅｔａｌ．，ＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＲｅｓｅａｒｃｈ２０００，５１，２１６．」に記載の方法に従って、下記装置及び試薬を使用して元素分析により、得られた分解物１〜６の硫酸化度（％）を測定した。

（元素分析装置）
ｖａｒｉｏＥＬＩＩＩ（ｅｌｅｍｅｎｔａｒ社製、測定可能元素：Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｓ）
（試薬）
スズ箔ボート
ＭＥＲＣＫＫｇａＡＳｕｌｆａｎｉｌｉｃａｃｉｄ（ｓｔａｎｄａｒｄｆｏｒｅｌｅｍｅｎｔａｌａｎａｌｙｓｉｓＧＲｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓ）
Ｅｌｅｍｅｎｔａｒｔｕｎｇｓｔｅｎ（ＶＩ）−ｏｘｉｄｅｐｏｗｄｅｒ
（測定方法）
スズ箔（舟型）の空の重さを量り、そこに三酸化タングステンを質量比で分解物１〜６の１〜２倍量（約１５ｍｇ〜３０ｍｇ）量り取り、ゼロ点とした。硫酸化多糖類中にはアルカリ金属であるＮａやＫが含まれているが、三酸化タングステンを加えることにより、装置のカラムの破損が防止でき、また、正確な測定値が得られる。
次いで、１０〜１５ｍｇの分解物１〜６を、このスズ箔に詰め、空気が入らないようにしながら直径５ｍｍ以下の大きさの錠剤型試料とした。なお、ここまでのすべての作業は、スズ箔に指紋を付着させないために、ゴム手袋を装着して行った。
次いで、前記錠剤型試料一つにつき、最低３回（ｎ≧３）「Ｓ」について元素分析を行った。分析終了後、標準物質（スルファニル酸）による補正値をかけ、測定値Ｓ（％）とした。
次いで、得られた測定値Ｓから、下記式（Ｉ）に従って、分解物１〜６の硫酸化度（％）を平均値として算出した。測定結果を表１に示す。
硫酸化度（％）＝測定値Ｓ／（３２．０７／１０３．０６）・・・・（Ｉ）

図７に、反応時間の経過にしたがって、分解物の主たるピークが低分子量側へ移動していく様子を示す。図７は、加水分解反応時の反応液のＧＰＣによる解析結果であり、横軸は保持時間を示し、保持時間が長い（横軸の数値が増加する）ほど、分解物の分子量が小さいことを示す。（ａ）はコンドロイチン硫酸（原料）を示し、以下、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）の順に反応時間が長くなり、それに伴い、分子量が小さくなっていることを示す。
図７から明らかなように、コンドロイチン硫酸（原料）は、加水分解反応により低分子量化されていた。

また、分解物１〜６は、いずれも分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が２以下であり、硫酸基（−ＳＯ_３Ｈ）がほとんど脱離していなかった。そして、^１Ｈ−ＮＭＲによる解析の結果、これら分解物以外の物質に由来すると考えられるシグナルは検出されなかった。^１Ｈ−ＮＭＲによる解析結果を図８示す。図８（ａ）は、ＮＭＲスペクトルの全体図を、（ｂ）は３〜５ｐｐｍの拡大図をそれぞれ示す。
以上より、分解物１〜６は高純度且つ高品質であることが確認できた。

＜α−グルコシダーゼ阻害活性の測定＞
得られたコンドロイチン硫酸の加水分解物（分解物１〜６）について、以下に示す手順でα−グルコシダーゼの阻害活性を測定した。測定に使用した各種水溶液の調製方法を以下に示す。

（ｐＨ６．８（３７℃）、６７ｍＭリン酸カリウム緩衝液）
水酸化ナトリウム（３９１５５−１２０１、純正化学株式会社製）４．００ｇに純水１００ｍＬを加え、１．０ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を調製した。５００ｍＬメスフラスコに、リン酸カリウム（ＰｏｔａｓｓｉｕｍＰｈｏｓｐｈａｔｅ，ＭｏｎｏｂａｓｉｃＡｎｈｙｄｒｏｕｓ（ＳＩＧＭＡ社製））４．５５９３５ｇと純水５００ｍＬを加えて溶解し、これを褐色瓶に移した後、恒温槽中で３７℃に保ちながら、上記の１．０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を加え、ｐＨを６．８に調整した。
（グルタチオン水溶液）
１００ｍＬメスフラスコに、グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＦｒｅｅＡｃｉｄ，ＲｅｄｕｃｅｄＦｏｒｍ（ＳＩＧＭＡ社製））０．０９２１９ｇと純水１００ｍＬを加え、溶解させて、グルタチオン水溶液を調製した。
（α−グルコシダーゼ水溶液）
１００ｍＬメスフラスコにα−グルコシダーゼ（α−ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳＩＧＭＡ社製））５．０ｍｇと純水１００ｍＬを加え、溶解させて、α−グルコシダーゼ水溶液を調製した。
（ｐ−ニトロフェニルα−Ｄグルコシダーゼ水溶液）
１００ｍＬメスフラスコにｐ−ニトロフェニルα−Ｄグルコシダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）０．３０１２ｇと純水１００ｍＬを加え、溶解させて、ｐ−ニトロフェニルα−Ｄグルコシダーゼ水溶液を調製した。
（炭酸ナトリウム水溶液）
５００ｍＬメスフラスコに、無水炭酸ナトリウム（ＳｏｄｉｕｍＣａｒｂｏｎａｔｅ，Ａｎｈｙｄｒｏｕｓ（ＳＩＧＭＡ社製））５．２９９５ｇと純水５００ｍＬを加え、溶解させて、炭酸ナトリウム水溶液を調製した。

分解物１〜６を１４．７５ｍｇ秤量し、前記リン酸カリウム緩衝液２．５ｍＬを加えて完全に溶解させた後、さらに前記グルタチオン水溶液０．１００ｍＬと前記α−グルコシダーゼ水溶液０．１００ｍＬとを加え、恒温槽にて３７℃で１０分間予備加熱を行った。
次いで、前記ｐ−ニトロフェニルα−Ｄグルコシダーゼ水溶液０．２５０ｍＬを加え、恒温槽にて３７℃で２０分間加熱した。この時の分解物１〜６の濃度は、それぞれ０．５質量／体積％である。
次いで、前記炭酸ナトリウム水溶液８．００ｍＬを加えて測定用試料（分解物１〜６を使用したものをそれぞれ試料３〜８とした）とし、波長４００ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定した。そして、吸光度の測定値から、下記式（ＩＩ）に従って、α−グルコシダーゼの阻害活性（阻害率（％））を測定した。この時、同時に、分解物１〜６に代えてコンドロイチン硫酸（原料）を使用した試料（試料２）と、分解物１〜６を使用しなかった試料（ブランク、試料１）についても測定した。測定用試料は、一水準につき七つ準備してすべて測定に供し（ｎ＝７）、そのうち明らかな測定誤差があったものを除いて、酵素活性の平均値から阻害率（％）を算出した。測定結果を表２に示す。また、分解物の質量平均分子量と阻害率（％）との関係を示すグラフを図９に示す。
阻害率（％）＝（通常測定時の吸光度−補正値）／（分解物を入れなかった場合の吸光度−補正値）×１００・・・・（ＩＩ）
なお、「通常測定時の吸光度」とは試料３〜８の吸光度を、「分解物を入れなかった場合の吸光度」とは試料２の吸光度を、「補正値」とはセル補正値をそれぞれ示す。

［実施例２］
分解物６の濃度を、０．５質量／体積％に代えて、０．００１質量／体積％（試料１０）、０．００５質量／体積％（試料１１）、０．０１質量／体積％（試料１２）、０．０５質量／体積％（試料１３）、０．１質量／体積％（試料１４）としたこと以外は、実施例１と同様に、α−グルコシダーゼの阻害活性を測定した。この時、同時に、分解物６を使用しなかった試料（ブランク、試料９）についても測定した。測定用試料は、一水準につき三つ準備してすべて測定に供し（ｎ＝３）、酵素活性の平均値から阻害率（％）を算出した。測定結果を表３に示す。また、分解物６の濃度と阻害率（％）との関係を示すグラフを図１０に示す。

さらに、分解物の濃度をｙ軸、阻害率（％）をｘ軸としてグラフにプロットし、この時の関係を近似して、数式「ｙ＝０．０００１１２ｘ−０．００１２１８（ただし、２０≦ｘ≦５５」を算出した。そして、この数式にｘ＝５０を代入して、阻害率５０％の時の分解物の濃度０．００４４質量／体積％を求めた。以上より、分解物６のＩＣ_５０（阻害率を５０％とするのに必要な量）は、０．００４４ｍｇ／ｍＬであった。これは、一般的なα−グルコシダーゼ阻害剤であるＴｒｉｚｍａＢａｓｅのＩＣ_５０（０．５６ｍｇ／ｍＬ）よりも桁違いに小さく、約１３０倍の阻害作用を有することが確認できた。

コンドロイチン硫酸の加水分解物は、質量平均分子量が２５０００Ｄａ以下、特に５７００〜２００００Ｄａの範囲で、顕著に高い阻害活性を示した。
特開２００５−２６３６８８号公報の図１には、コンドロイチン硫酸Ａ（生化学工業社製試薬）及びコンドロイチン硫酸Ｃ（生化学工業社製試薬）が、α−グルコシダーゼ阻害活性を有していないことが開示されている。ここで、生化学工業社製試薬のコンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃの分子量は、それぞれ２５０００〜５００００、４００００〜８００００であるということが生化学工業社のカタログに開示されていることからすれば、コンドロイチン硫酸の加水分解物の質量平均分子量をいかに選択するかによって、α−グルコシダーゼ阻害活性が左右されることが分かる。
したがって、本発明におけるコンドロイチン硫酸の加水分解物のα−グルコシダーゼ阻害活性は、コンドロイチン硫酸を加水分解により低分子量化することによって初めて得られたものであり、その効果は極めて顕著なものである。また、低分子量化するにあたっての安定的な製造方法は、α−グルコシダーゼ阻害剤の製造において重要である。

本発明は、糖尿病治療薬や抗肥満薬等の、α−グルコシダーゼ阻害作用を有する各種医薬品として利用可能である。

Claims

Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸とからなる多糖類で、該ガラクトサミンの４位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ａ、及び該ガラクトサミンの６位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ｃを主たる構成単位とするコンドロイチン硫酸を加水分解し、質量平均分子量を５７００Ｄａ〜２５０００Ｄａとした分解物を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤。
Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸とからなる多糖類で、該ガラクトサミンの４位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ａ、及び該ガラクトサミンの６位の炭素原子が硫酸エステル化されたコンドロイチン硫酸Ｃを主たる構成単位とするコンドロイチン硫酸を含有する水溶液に、加圧及び加熱条件下、二酸化炭素ガスを作用させて、前記コンドロイチン硫酸を加水分解し、質量平均分子量が５７００Ｄａ〜２５０００Ｄａである糖類を生じさせる工程を有する糖類の製造方法。