CN103788231B

CN103788231B - 一种从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素a的方法

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Publication number: CN103788231B
Application number: CN201410060799.3A
Authority: CN
Inventors: 于广利; 张玉倩; 祝贺; 郎银芝; 赵小亮
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2014-02-24
Filing date: 2014-02-24
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2034-02-24
Also published as: CN103788231A

Abstract

本发明涉及利用动物器官制备高纯度硫酸软骨素的技术，尤其是一种利用兔耳软骨制备高纯度硫酸软骨素A的方法。将兔耳剥皮、去肉，得新鲜兔耳软骨，经脱脂、胰蛋白酶酶解、乙醇沉淀及阴离子交换树脂纯化，获得高纯度的硫酸软骨素A，其分子量在16～59kDa之间。本发明利用兔耳软骨制备硫酸软骨素A，具有原料来源丰富、产品产率高和纯度高的特点，能满足医药市场对高纯度硫酸软骨素A的需求。

Description

一种从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法

技术领域

本发明涉及利用动物器官制备高纯度硫酸软骨素的技术，尤其是一种利用兔耳软骨制备高纯度硫酸软骨素A的方法。

背景技术

硫酸软骨素（Chondroitinsulfate，CS）是一种硫酸多糖类物质，以蛋白聚糖形式广泛存在于各种动物组织和器官中，具有多种生理作用。生物组织中的硫酸软骨素，主要有硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素B(CSB)和硫酸软骨素C(CSC)，其中：CSA是由葡糖醛酸（GlcA）以β-1,3-糖苷键与4-硫酸-乙酰氨基半乳糖(GalNAc4S)以β-1,4-糖苷键交替连接而成。硫酸软骨素A具有很好的抗炎、降血脂等生理活性，在临床中广泛应用。我国是硫酸软骨素生产和出口大国，从猪、牛、鸡等软管中提取的硫酸软骨素占世界市场的80%以上。随着老龄人口数量不断增长，骨关节炎患者逐年增多，全球硫酸软骨素的市场需求量很大，仅美国每年硫酸软骨素用量达600多吨。中国有13亿人口，加之近年来硫酸软骨素开始应用于抗凝抗血栓、口腔黏膜溃疡、滴眼液、口服保健品、某些神经性头痛、化妆品行业以及组织工程中等，应用领域不断扩大，市场前景十分广阔。近年来研究表明，硫酸软骨素在抗寄生虫和病毒感染、再生医学、抗肿瘤等领域也有很大的应用潜力。

目前，市场上硫酸软骨素多来自于猪、牛、羊、鸡等动物的软骨、喉骨、气管等组织，由于来源不同，硫酸软骨素质量很难控制。我国药用硫酸软骨素有硫酸软骨素A钠和供注射用的CSA，来源为猪喉骨、鼻骨和气管等软骨组织。近年来，猪流感、猪口蹄疫、猪蓝耳病等疾病时有发生，极有可能会对其来源的硫酸软骨素的应用受到限制。

在CSA制备方面，中国专利申请（公开号CN102898541A）涉及用鱼骨提取硫酸软骨素的方法，虽然来源于鱼类的硫酸软骨素与陆生动物相比，受污染程度很小，但是其二糖重复单元中C-4位硫酸酯基和C-6位硫酸酯基比例与药用硫酸软骨素A差别较大。中国专利申请（公开号CN102850466A）披露了牦牛骨制取硫酸软骨素的方法，由于牦牛分布具有明显的地域性，相比之下原材料难以获得。中国专利申请（公开号CN102690372A）涉及一种用鸡骨架生产硫酸软骨素的方法，同样由于禽流感的频繁流行，鸡来源的产品也存在一定安全隐患。此外，现有专利所得硫酸软骨素还存在纯度不高及不能直接作为药用的缺点。

从利用动物组织中提取安全、卫生、无害的医药级硫酸软骨素，成为近几年业界关注的焦点。随着家兔养殖业的发展，大量兔耳被作为各种普通食品被人们食用，兔耳软骨中含有大量硫酸软骨素，是一种优良的硫酸软骨素原料，经国内外专利检索表明，目前还没有从兔耳中制备硫酸软骨素的报导。充分利用兔耳资源，从中提取医药级硫酸软骨素，可延伸家兔养殖业产业链。

发明内容

针对现有技术制备硫酸软骨素A中存在的不足，本发明的目的在于提供一种从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，该方法可有效利用兔肉加工废料兔耳，获得纯度高的硫酸软骨素A，能弥补市场对来源安全的药用硫酸软骨素的大量需求。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案是：

一种从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，该方法包括以下步骤：

(1)脱脂：将新鲜兔耳剥皮、去肉后得兔耳软骨，有机溶剂浸泡，取出软骨干燥后粉碎，得脱脂软骨粉；

(2)酶解：脱脂软骨粉用Tris-HCl缓冲液浸泡，煮沸后降温至37℃，加入胰蛋白酶，37℃恒温搅拌酶解后煮沸使酶灭活；

(3)乙醇沉淀：将(2)所得酶解液离心，上清液加入乙醇沉淀，离心后取沉淀加蒸馏水复溶后对蒸馏水透析，透析内液减压浓缩干燥后得软骨素粗提产物；

(4)纯化：将(3)所得软骨素粗提产物用蒸馏水溶解，以蒸馏水和不同浓度氯化钠水溶液为流动相，经过Q-SepharoseFastFlow强阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，合并收集含有硫酸软骨素A组分，对蒸馏水透析，减压浓缩、冻干，得到硫酸软骨素A。

所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，该方法获得硫酸软骨素A的分子量为16～59kDa。

所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，步骤(1)中，加入兔耳软骨的10～20倍体积有机溶剂，采用浸泡脱脂2～8h和/或采用有机溶剂浸泡和间歇搅拌配合脱脂2～8h，所用有机溶剂是乙醇、丙酮或氯仿/甲醇混合溶液之一种或两种以上。

所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，步骤(1)中，间歇搅拌是指每间隔1h，搅拌5～10分钟。

所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，步骤(2)中，酶解所用Tris-HCl缓冲液浓度为0.05～0.2mol/L，pH为7～9，胰蛋白酶的用量为脱脂软骨粉质量的1～10%。

所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，步骤(3)中，乙醇沉淀时加入乙醇的体积为提取液体积的1～5倍，透析所用透析袋截留分子量为1000～10000Da。

所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，步骤(4)中，Q-SepharoseFastFlow强阴离子交换树脂纯化所用氯化钠水溶液浓度为0.7～1.0mol/L。

所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，步骤(4)中，粗提产物用蒸馏水溶解后，经过Q-SepharoseFastFlow强阴离子交换树脂分离纯化，用0.7～1.0mol/L的氯化钠水溶液先后洗脱2～8个柱体积，并收集洗脱液，经浓缩透析脱盐后，冷冻干燥，得到硫酸软骨素A。

本发明的优点和有益效果为：

(1)本发明将兔耳剥皮、去肉，得新鲜兔耳软骨，经脱脂、胰蛋白酶酶解、乙醇沉淀及阴离子交换树脂纯化，获得高纯度的硫酸软骨素A，其分子量在16～59kDa之间。其中，原料兔耳软骨来源于兔肉加工废料，来源丰富，安全可靠，成本低廉，适合大规模工业化生产。

(2)本发明采用的制备工艺简单，产率高，产品产率相对软骨湿重可达到3～5%，相对脱脂软骨粉重量12～16%，可弥补市场供应量不足的缺陷。

(3)采用本发明方法制备的硫酸软骨素A，产品纯度高，分子量为16～59kDa，产品安全可靠。

附图说明

图1为本发明硫酸软骨素A的醋酸纤维素薄膜电泳图。

图2为本发明硫酸软骨素A的十八角激光散射仪分析图。图中，RE-1为实施例1；RE-2为实施例2。

图3为本发明硫酸软骨素A的红外光谱图。

图4为本发明硫酸软骨素A的紫外光谱图。

具体实施方式

本发明所提供高纯度兔耳软骨硫酸软骨素A的制备方法，包括以下步骤：

(1)脱脂：在兔死亡后将新鲜兔耳剥皮、去肉后得兔耳软骨，有机溶剂浸泡，间歇搅拌，取出软骨干燥后粉碎，得脱脂软骨粉。

(2)酶解：脱脂软骨粉用Tris-HCl缓冲液浸泡并煮沸后降温至37℃，加入胰蛋白酶，37℃恒温搅拌酶解后煮沸使酶灭活。

(3)乙醇沉淀：将(2)所得酶解液离心，上清液加入乙醇沉淀，离心后取沉淀加蒸馏水复溶后对蒸馏水透析，透析内液减压浓缩干燥后得软骨素粗提产物。

(4)纯化：将(3)所得软骨素粗提产物用蒸馏水溶解，以蒸馏水和不同浓度氯化钠水溶液为流动相，经过Q-SepharoseFastFlow(QFF)强阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测洗脱情况，洗脱液分别对蒸馏水透析，减压浓缩、冻干，得到硫酸软骨素A纯化组分。

步骤(1)中，兔耳软骨加入10～20倍体积有机溶剂搅拌浸泡脱脂2～8h。所用有机溶剂可以是乙醇、丙酮或氯仿/甲醇混合溶液之一种或两种以上。步骤(2)中，脱脂兔耳软骨用0.05～0.2mol/LpH=7～9的Tris-HCl缓冲液浸泡后，煮沸后降温至37℃，加入脱脂软骨粉质量1～10%的胰蛋白酶37℃搅拌酶解提取，后经煮沸灭活离心去除蛋白酶。步骤(3)中，酶解离心上清液加入1～5倍体积无水乙醇，沉淀离心收集蒸馏水复溶后用截留分子量为1000～10000Da的透析袋透析至透析外液电导率不再变化，透析内液减压浓缩干燥。步骤(4)中，Q-SepharoseFastFlow(QFF)强阴离子交换树脂纯化所用流动相氯化钠浓度为0.7～1.0mol/L。

所述硫酸软骨素A分子量为16～59kDa，醋酸纤维素薄膜电泳检测条带单一，凝胶渗透色谱检测洗脱峰对称，¹³C-NMR谱图与标准硫酸软骨素A一致，纯度高。

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进一步的详细说明，结合附图阅读本发明的具体实施例后，本发明的其他优点和特点将变得更加清晰，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1

取新鲜兔耳3对，剥皮、去肉，获得兔耳软骨35g，加入350mL丙酮浸泡、间歇搅拌4h（每间隔1h，搅拌10分钟），弃去丙酮浸泡液，加入350mL氯仿/甲醇（氯仿与甲醇体积比4∶1）浸泡4h，去除有机溶剂，干燥后粉碎，干燥得10.1g脱脂软骨粉。将脱脂软骨粉用200mL、0.1mol/L、pH=8.0的Tris-HCl缓冲液浸泡后煮沸2h，降温至37℃后加入1.5g胰蛋白酶，37℃恒温搅拌酶解22h，100℃煮沸5min使酶灭活。将酶解液离心，取上清加入600mL无水乙醇，离心收集沉淀，沉淀加蒸馏水复溶，用截流分子量为3500Da的透析袋透析脱盐，透析袋内液减压浓缩、干燥得到软骨素粗产物1.54g。取粗提产物0.3g，用3mL水溶解，经QFF柱(柱体积为300mL)分离，用0.7mol/L的NaCl水溶液洗脱3个柱体积，然后用0.8mol/L的NaCl水溶液洗脱4个柱体积并收集洗脱液，经浓缩透析脱盐后，冷冻干燥，得到110mg硫酸软骨素A。

实施例2

取新鲜兔耳5对，剥皮、去肉，获得兔耳软骨57g，加入850mL丙酮浸泡、间歇搅拌8h（每间隔1h，搅拌5分钟），去除丙酮干燥后粉碎，干燥得19.4g脱脂软骨粉。脱脂软骨粉用390mL、0.1mol/L、pH=8.0、Tris-HCl缓冲液浸泡后煮沸3h，降温至37℃后加入5.0g胰蛋白酶，37℃恒温搅拌酶解21h，100℃煮沸5min使酶灭活。酶解液离心，取上清加入浓度为95wt%的乙醇780mL，离心收集沉淀，沉淀加蒸馏水复溶，用截流分子量为7000Da的透析袋透析至透析袋外液电导率不再变化，透析袋内液减压浓缩、干燥得到软骨素粗产物2.37g。取粗提产物0.5g，用5mL水溶解，经QFF柱(柱体积为300mL)分离，用0.8mol/L的NaCl水溶液洗脱3个柱体积，然后用1.0mol/L的NaCl水溶液洗脱2个柱体积并收集洗脱液，经浓缩透析脱盐后，冷冻干燥，得到123mg硫酸软骨素A。

上述硫酸软骨素的鉴定及分析：

1、硫酸软骨素鉴别及纯度的醋酸纤维素薄膜电泳分析

以硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素B(CSB)和硫酸软骨素C(CSC)为对照品，用醋酸纤维素薄膜电泳法分析所得多糖种类和纯度，实验结果如图1所示。从图1可知，实施例1和实施例2所得组分电泳条带单一，说明产品纯度高，将这两种组分分别命名为RE-1和RE-2，其电泳迁移率与标准品CSA一致，说明两种组分均为硫酸软骨素A。

2、十八角激光散射仪测定硫酸软骨素A分子量

用高效凝胶渗透色谱（HPGPC）及十八角激光散射仪和示差检测器联用在线检测方法分析RE-1和RE-2的分子量，结果见表1。

表1硫酸软骨素纯化组分分子量测定结果统计表

样品	Mw	Mn	D(Mw/Mn)
				RE-1	16.2～39.4kDa	16.2～38.7kDa	1.00～1.02
RE-2	27.7～58.9kDa	27.7～58.0kDa	1.00～1.02

实验结果如图2所示，RE-1以及RE-2这两种硫酸软骨素A组分色谱峰均单一对称，进一步说明产品纯度高，经计算其分子量分别为16.2～39.4kDa和27.7～58.9kDa，分子量分布宽度D均为1.00～1.02。

3、硫酸软骨素A的红外光谱分析

本发明所制备的硫酸软骨素A如图3所示。以RE-2为例，3410cm^-1处为羟基O-H伸缩振动，1640cm^-1左右为GalNAc4S乙酰基中C=O吸收峰，1420cm^-1处为GlcA羧基中C=O伸缩振动，1250cm^-1左右则为GalNAc4S中S=O伸缩振动，850cm^-1左右明显的伸缩振动代表GalNAc4S中C4位有硫酸酯基取代，而820cm^-1处无明显吸收，表明C6位无硫酸酯基取代，进一步说明所得硫酸软骨素为硫酸软骨素A，而非硫酸软骨素C。RE-1的红外吸收特征与RE-2类似。

4、硫酸软骨素A的紫外光谱分析

本发明所制备的硫酸软骨素A的紫外光谱图如图4所示。以RE-1为例，图中仅在195nm处存在末端吸收，而在280nm左右未见蛋白吸收峰，260nm左右也未见核酸的吸收峰，说明样品中无残余蛋白或核酸类物质，样品纯度较高。RE-2的紫外吸收特征与RE-1类似。

5、硫酸软骨素A的¹³C-NMR分析

表2硫酸软骨素纯化组分¹³C-NMR信号归属

以Sigma公司来源于牛气管的CSA为标准对照，对本发明所制备的硫酸软骨素A进行¹³C-NMR分析。其中，CSA标准品中GalNAc4S中C4信号化学位移为77.77ppm，C6信号化学位移为62.27ppm，而在68.75ppm是GalNAc6S的C6信号峰。对于本发明所得兔耳软骨，77.77ppm峰较高，表明GalNAc4S含量较高，虽然也存在68.75ppm峰，但峰高相对牛气管的CSA低很多，且GalNAc6S含量较低。

6.硫酸软骨素A的二糖组成分析

为了进一步考察兔耳来源硫酸软骨素细微结构，采用硫酸软骨素酶ABC进行完全酶解，用强阴离子交换-高效液相色谱（SAX-HPLC）分析其二糖组成，结果见表3。

表3兔耳硫酸软骨素A二糖组成分析

二糖	CSA标准品	RE-1	RE-2
				Δdi0S	—	11.7wt%	7.3wt%
Δdi6S	42.1wt%	26.1wt%	15.8wt%
				Δdi4S	57.9wt%	57.7wt%	72.4wt%
ΔdiS_D	—	4.4wt%	4.5wt%

以Sigma公司来源于牛气管的CSA为对照，将RE-1和RE-2以软骨素酶ABC（EC4.2.2.4）降解，进行强阴离子交换-高效液相色谱（SAX-HPLC）分析，结果发现，RE-1和RE-2的细微结构明显不同于牛气管来源CSA,Δdi4S/Δdi6S比值较高，分别为2.21和4.58，均高于牛气管1.38。另外，RE-1和RE-2中还含7.3～11.7wt%的Δdi0S和4.4wt%左右的ΔdiS_D。由于RE-1和RE-2中Δdi4S和Δdi6S含量分别为57.7wt%和72.4wt%，且含有7.3～11.7wt%的Δdi0S和4.4wt%左右的ΔdiS_D，进一步说明RE-1和RE-2为一种新型硫酸软骨素A。

综上，本发明以兔耳软骨为原材料提取硫酸软骨素A，粗品产率占兔耳软骨原料的12～16wt%，纯度高，分子量及其分布宽度符合药典对于注射用硫酸软骨素的要求。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤(2)中，酶解所用Tris-HCl缓冲液浓度为0.05～0.2mol/L，pH为7～9，胰蛋白酶的用量为脱脂软骨粉质量的1～10%；

(4)纯化：将(3)所得软骨素粗提产物用蒸馏水溶解，以蒸馏水和不同浓度氯化钠水溶液为流动相，经过Q-SepharoseFastFlow强阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，合并收集含有硫酸软骨素A组分，对蒸馏水透析，减压浓缩、冻干，得到硫酸软骨素A；

步骤(4)中，Q-SepharoseFastFlow强阴离子交换树脂纯化所用氯化钠水溶液浓度为0.7～1.0mol/L；

该方法获得硫酸软骨素A的分子量为16～59kDa。

2.根据权利要求1所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，其特征在于，步骤(1)中，加入兔耳软骨的10～20倍体积有机溶剂，采用浸泡脱脂2～8h和/或采用有机溶剂浸泡和间歇搅拌配合脱脂2～8h，所用有机溶剂是乙醇、丙酮或氯仿/甲醇混合溶液之一种或两种以上。

3.根据权利要求2所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，其特征在于，步骤(1)中，间歇搅拌是指每间隔1h，搅拌5～10分钟。

4.根据权利要求1所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，其特征在于，步骤(3)中，乙醇沉淀时加入乙醇的体积为提取液体积的1～5倍，透析所用透析袋截留分子量为1000～10000Da。

5.根据权利要求1所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，其特征在于，步骤(4)中，粗提产物用蒸馏水溶解后，经过Q-SepharoseFastFlow强阴离子交换树脂分离纯化，用0.7～1.0mol/L的氯化钠水溶液先后洗脱2～8个柱体积，并收集洗脱液，经浓缩透析脱盐后，冷冻干燥，得到硫酸软骨素A。