CN101701043B - 一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法,属于新型生物工程技术领域。它解决了现有的硫酸软骨素提取步骤多,工艺流程繁琐,产品得率低,蛋白质和氮杂质含量较高的问题。本发明鲨鱼硫酸软骨素的提取方法包括以下步骤:A、碱提;B、酶解;C、超滤;D、氧化、结晶。本发明鲨鱼硫酸软骨素的提取方法工艺流程简单,工艺步骤较少,易于操作可实现大规模的工业化生产,且产品的收率可以达到17%-22%,纯度可以达到90-96%。
Description
技术领域
本发明涉及一种硫酸软骨素的提取方法,具体地说涉及一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法;属于新型生物工程技术领域。
背景技术
硫酸软骨素是从动物组织中提取的黏多糖类物质,其基本单位是D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖硫酸酯。一般硫酸软骨素约含50-70个二糖单位,平均分子量10000-30000。分子中带有大量的负电荷,具有调脂、抗炎及弱的抗凝血、抗血栓生物活性,对维持细胞环境的相对稳定性和正常功能具有重要作用。
硫酸软骨素能促进基质中纤维的增长,增强通透性,改善血液循环,加速新陈代谢,促进渗透液的吸收及炎症的消除;其聚阴离子具有强的保水性,能改善眼角膜组织的水分代谢,对角膜有较强的亲和力,能在角膜表面形成一层透气保水膜,促进角膜创伤的愈合及改善眼部干燥症状。
硫酸软骨素能将水分吸入蛋白多糖分子内,使软骨变厚及有如海绵般,并增加关节内的滑液量。如此一来,它便能提供“垫衬”作用以增强关节的减震能力和缓和行走或跳动时的冲击和摩擦。硫酸软骨素还作为输送管道,为软骨输送重要的氧和营养素,同时把二氧化碳和废物加以排除。硫酸软骨素还可以抑制破坏软骨的酵素(例如胶原酶、弹性蛋白酶和组织蛋白酶),以免软骨被分解或溶解。
自然界中的硫酸软骨素多存在于动物的软骨、喉骨、鼻骨,鱼类软骨中含量也很丰富,结缔组织含量很少。目前,市场上硫酸软骨素多从猪、牛、羊等动物软骨中提取,该类动物的软骨中硫酸软骨素含量和产品价值都较低。而从鲨鱼软骨中提取的鲨鱼硫酸软骨素属于纯天然海洋生物活性物质,能够降血脂、抗衰老、防止动脉粥样硬化,在防治冠心病和心肌梗塞等心血管疾病中有较好的疗效;还能调节关节机能,用于治疗关节炎和预防结缔组织相关的疾病;并且具有抗病毒、抗肿瘤、提高机体免疫力的作用。鲨鱼硫酸软骨素以其独特的生物活性功能在医药和保健品中有着广泛的应用。
采用传统的稀碱、稀碱-盐、稀碱-酶等提取硫酸软骨素的方法,产品得率低,蛋白质和氮杂质含量较高;中国专利申请(公开号:CN101358220A)涉及鲨鱼软骨中提取硫酸软骨素钙的方法,该方法包括有熟化、碱化、酶解、去蛋白、结晶、树脂预处理、树脂交换、超滤脱水、滤液钙化、结晶脱水干燥各工序过程组成。虽然采用该方法可以提高鳖鱼硫酸软骨素的纯度,节约乙醇的使用量。但是该方法不仅工艺步骤多,工艺流程繁琐;而且酶解后需要升温将酶灭活过滤,酶不能反复使用,不能进行连续化生产。
发明内容
本发明针对现有技术存在的缺陷,提供一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法,该方法不仅可以大大减少酒精的用量以及酒精回收的能耗,而且实现连续化生产。
本发明的目的是通过下列技术方案来实现的:一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法,该方法包括以下步骤:
A、碱提:选择鲨鱼软骨脱脂后将其粉碎,加入碱溶液和氯化钠溶液在温度为20-60℃的条件下提取1-10小时,过滤后调滤液pH值为8.5-9.0;
B、酶解:将上述碱提后的滤液中加入到酶反应器中,加入为软骨投料量1.0%-5.0%的固定化酶,在pH值为2.0-9.0,温度为45-55℃的条件下酶解2-10小时;
C、超滤:将酶解后的滤液脱色后,在室温下超滤脱水浓缩至原体积的1/3-1/2;
D、氧化、结晶:调超滤脱水后的浓缩液pH值为8.5-9.0,加入为软骨投料量0.5%-3%的双氧水,在温度为15-40℃的条件下氧化3-8小时过滤,调滤液pH值为5.0-6.0,加入95%乙醇结晶,使乙醇浓度达65-75%,结晶后离心、洗涤、干燥后得到鲨鱼硫酸软骨素。
本发明步骤A中脱脂的具体过程是:取鲨鱼软骨在沸水中蒸煮2-6h,冲洗干净,用乙醇或丙酮浸泡30min去除油脂。碱提过程中采用间歇搅拌可增大碱和软骨的接触面积,加快碱提速度。为了提高鲨鱼硫酸软骨素的收率,过滤后的残渣需要用蒸馏水浸泡后再次过滤,合并过滤液,用HCl调pH值至8.0-9.0。
步骤B中按鲨鱼软骨重量百分比的1.0%-5.0%加入固定化酶。在该重量百分比范围内,产品的纯度达95%以上,收率达17%以上,氮含量<2.8%。酶解过程中保持pH值为2.0-9.0。
步骤C中脱色采用活性炭和硅藻土脱色,具体的脱色过程是:将滤液升温至60℃左右加入为软骨投料量0.5%-5%的活性炭和适量硅藻土,慢慢搅拌20-40分钟,压滤。脱色不仅可吸附小分子色素杂质,使产品颜色洁白;而且可以部分吸附蛋白、多肽、氨基酸类杂质,使溶液澄清,防止堵塞超滤膜或者延长超滤膜清洗周期。
步骤D中采用氢氧化钠溶液调浓缩液pH值为8.5-9.0,采用盐酸溶液调滤液pH值为5.0-6.0。
在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中,步骤A中所述的鲨鱼软骨为鲨鱼头软骨、鲨鱼尾软骨、鲨鱼脊椎软骨、鲨鱼翅软骨中的一种或多种。鲨鱼软骨中硫酸软骨素含量高达50-60%,且市场价值比普通动物来源的硫酸软骨素高。鲨鱼软骨种类很多,有不同来源的鲨鱼,同种鲨鱼还可以有不同部位的骨头。可采用的软骨包括头骨、尾骨、中骨、翅骨、牙骨。这些部位的软骨产品得率较高,可达11%以上。
在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中,步骤A中所述的碱溶液为浓度为2%-5%的氢氧化钠溶液,所述的氯化钠溶液的浓度为1%-3%,所述的氢氧化钠溶液和氯化钠溶液的加入量均为鲨鱼软骨重量的4-6倍。鲨鱼硫酸软骨素和蛋白共价连接成糖蛋白,氢氧化钠溶液可以切断糖苷键,使糖蛋白水解,释放出游离的硫酸软骨素,同时使杂质蛋白部分水解。但氢氧化钠溶液的浓度过高会使产品色泽加深,并使硫酸软骨素部分降解。氯化钠溶液可提高离子强度,促进糖蛋白的解离,并有利于后续乙醇沉淀。但氯化钠溶液的浓度过高在乙醇沉淀中会成为夹杂析出,增大灰分杂质含量。
在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中,步骤B中所述的酶反应器为连续搅拌釜式反应器、固定床式反应器、流化床式反应器其中的一种。作为优选,所采用的酶反应器为流化床式反应器。本发明采用流化床式反应器与固定床式反应器相比,具有以下优点是:可以实现固体物料的连续输入和输出;流体和颗粒的运动使床层具有良好的传热性能,床层内部温度均匀,而且易于控制,特别适用于强放热反应。
在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中,步骤B中所述的固定化酶为固定化木瓜蛋白酶、固定化胰蛋白酶、固定化胃蛋白酶、固定化微生物碱性蛋白酶中的一种或多种。所述的固定化微生物碱性蛋白酶可以为固定化枯草杆菌蛋白酶等。作为优选,所述的固定化酶为固定化木瓜蛋白酶。上述酶都是非专一性蛋白酶,即能够对各种蛋白质进行水解。不同酶其作用的pH不同,碱性蛋白酶、胰蛋白酶最适pH为碱性,胃蛋白酶为酸性,木瓜蛋白酶近中偏碱。不同酶作用效果要视底物蛋白而定。本发明优选采用木瓜蛋白酶有以下好处:1、木瓜蛋白酶是植物性蛋白酶,适合于保健食品、药品生产过程2、木瓜蛋白酶固定化工艺条件简单,固定化后酶活力回收较高3、用固定化木瓜蛋白酶酶解产品收率与采用其它固定化酶酶解相比稍高。
在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中,步骤B中所述的固定化酶固定化方法为包埋法或交联法中的一种或两种;所述的包埋法采用的载体为海藻酸钠或海藻酸钠和壳聚糖,所述的交联法采用的载体为壳聚糖,采用的交联剂为戊二醛。本发明采用固定化酶与现有技术采用的一般游离的酶制剂相比不但具有高度专一性、催化效率高及作用条件温和,而且比游离的酶制剂稳定,使用寿命长,可反复使用多次,能使生产管道化、连续化和自动化,不会污染反应液,产物的分离提纯简单,收率高,酶活损失少。可以实现大规模工业化生产鲨鱼硫酸软骨素。固定化酶的制备方法有物理吸附法、载体偶联法、交联法和包埋法。本发明优选采用交联法和包埋法,其中交联法中依靠壳聚糖和戊二醛双功能基团,使酶蛋白分子之间发生交联,凝集成网状结构而成为固定化酶。包埋法采用海藻酸钠或海藻酸钠和壳聚糖制成凝胶或半透膜,将蛋白酶包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜的微型胶束内。采用海藻酸钠和壳聚糖作为固定化载体。具有以下优点:首先两者都是天然高分子凝胶物质,来源丰富、价格低廉、无毒安全、生物相容性好。其次海藻酸钠作为酶包埋的载体,固定化方法简单,条件温和,酶活损失少。再次壳聚糖分子含有游离氨基,易于使酶固定化,固定化酶性质稳定。海藻酸钠-壳聚糖固定化木瓜蛋白酶,其热稳定性好,半衰期长,凝胶硬度较高,可用于装柱使用,便于工业自动化生产。
在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中,步骤C中所述的超滤脱水采用的超滤膜为中空纤维式超滤膜、卷式超滤膜、平板式超滤膜中一种。作为优选,本发明采用中空纤维式超滤膜。中空纤维式超滤膜不仅单位面积所占空间小;而且中空纤维式超滤膜采用的是错流过滤,减轻了膜污染和浓差极化的程度,膜通量下降慢,清洗频率低。
在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中,步骤C中所述的超滤膜截留分子量为5,000-10,000。本发明提取方法中的截留分子量视待浓缩料液的组成而定。分子量太大,产物会透过膜孔,达不到浓缩的目的;分子量太小,杂质分子不能透过膜孔,从而达不到分离杂质的目的。
在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中,作为优选,步骤D中所述的双氧水的用量为软骨投料量的1%-2%,氧化温度为25-35℃,氧化时间为4-6小时。
综上所述:本发明具有以下优点:
1、本发明采用鲨鱼软骨来提取鲨鱼硫酸软骨素,鲨鱼软骨中硫酸软骨素含量高达50-60%,且市场价值比动物来源的硫酸软骨素高。在提取过程采用固定化酶酶解代替传统的游离酶酶解工艺,酶解结束后反应液流出酶反应器,固定化酶可以回收再利用且可以实现连续化生产;酶解液使用超滤膜浓缩工艺,大大减少了酒精的用量以及酒精回收的能耗,并提高了产品的收率和纯度。最终产品的收率可以达到17%-22,纯度可以达到90-96%。
2、本发明鲨鱼硫酸软骨素的提取方法工艺流程简单,工艺步骤较少,易于操作可实现大规模的工业化生产。
附图说明:
图1是本鲨鱼硫酸软骨素的提取方法工艺流程图。
图2是本鲨鱼硫酸软骨素的提取方法在酶解过程中的工艺流程图。
图3是本鲨鱼硫酸软骨素的提取方法在超滤过程中的工艺流程图。
图4是采用本方法提取的鲨鱼硫酸软骨素的高效液相色谱图。
图中,1、流化床;3、酶解循环罐;4、酶解循环泵;1a、中空纤维超滤膜;3a、超滤循环罐、4a、超滤循环泵。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图,对本发明的技术方案作进一步具体的说明;但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1
选取鲨鱼头软骨200g,在沸水中蒸煮2-6h,冲洗干净,用乙醇或丙酮浸泡30min去除油脂。脱脂后的鲨鱼软骨打成碎片,加入800g浓度为5%NaOH溶液和800g浓度为3%食盐溶液,在温度为20℃的条件下间歇搅拌碱提取10h,过滤,残渣用适量蒸馏水浸泡过滤,合并两次滤液,并用HCl调pH值至8.0。
选用木瓜蛋白酶,采用普通交联固定化方法将其制成4g固定化木瓜蛋白酶。其中以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂进行固定化。如图2所示,在流化床式反应器1中加入固定化木瓜蛋白酶,将碱提后的滤液加入到酶解循环罐3中由酶解循环泵4打入到流化床式反应器1在温度为45℃的条件下保温酶解10小时;酶解液进入酶解循环罐3中循环直至酶解结束,从酶解循环罐3出料,新的碱提液进入流化床式反应器开始下一轮操作。在酶解过程中用氢氧化钠溶液调整pH为8.0。酶解结束后,将滤液升温至60℃,加入0.5-5%活性炭和适量硅藻土,慢速搅拌20-40min,板框压滤。
如图3所示,选用截断分子量5000的中空纤维超滤膜浓缩,将上述滤液放入到超滤循环罐3a中由超滤循环泵4a打入若干个中空纤维超滤膜1a,各个中空纤维超滤膜中循环液的浓度一次升高,最后一个中空纤维超滤膜引出达到要求的浓缩液从超滤循环罐3a中流出,杂质溶液透过中空纤维超滤膜管壁,在管间汇合后排出。超滤过程中进料温度20℃,中空纤维超滤膜压力0.6MPa,浓缩液的体积是原体积1/3。
浓缩液用碱调pH至9.0,加入4g的双氧水,15℃氧化8h,过滤。过滤后用盐酸调节氧化后滤液pH至5.0,加入浓度为95%的乙醇结晶,最终使溶液中乙醇终浓度达65%,沉淀8-12h后离心得粗品。用蒸馏水洗涤、干燥后得到鲨鱼硫酸软骨素产品,整个工艺流程图如图1所示,提取的鲨鱼硫酸软骨素产品收率为22%,纯度为93.86%。高效液相色谱(HPLC)图如图4所示,结果如表1所示。
本鲨鱼硫酸软骨素高效液相色谱试验中流动相:辛烷磺酸钠∶乙腈=90∶10;流量:0.6ml/min;浓度:0.304mg/ml;体积:20μl。
表1:本鲨鱼硫酸软骨素高效液相色谱分析结果表
从表1和图4可以看出:实施例1提取的鲨鱼硫酸软骨素的纯度为93.86%。
实施例2
选取鲨鱼尾软骨100g,鲨鱼翅软骨100g在沸水中蒸煮2-6h,冲洗干净,用乙醇或丙酮浸泡30min去除油脂。脱脂后的鲨鱼软骨打成碎片,加入1000g浓度为3%NaOH溶液和1000g浓度为2%食盐溶液,在温度为30℃的条件下间歇搅拌碱提取6h,过滤,残渣用适量蒸馏水浸泡过滤,合并两次滤液,并用HCl调pH值至9.0。
选用木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,采用普通包埋固定化方法将其制成4g固定化木瓜蛋白酶和2g固定化枯草杆菌蛋白酶,分别装柱。其中以壳聚糖和海藻酸钠为载体进行固定化。酶解过程同实施例1,不再赘述。在酶解过程中用氢氧化钠溶液调整pH为8.5。新的碱提液进入流化床式反应器开始下一轮操作。在酶解过程中用氢氧化钠溶液调整pH为8.5。酶解结束后,将滤液升温至60℃,加入0.5-5%活性炭和适量硅藻土,慢速搅拌20-40min,板框压滤。
超滤过程同实施例1,不再赘述。超滤膜截留分子量10000,过程中进料温度25℃,中空纤维超滤膜压力0.5MPa,浓缩液的体积是原体积2/5。
浓缩液用碱调pH至8.5,加入3g的双氧水,25℃氧化6h,过滤。过滤后用盐酸调节氧化后滤液pH至6.0,加入浓度为95%的乙醇结晶,最终使溶液中乙醇终浓度达70%,沉淀8-12h后离心得粗品。用蒸馏水洗涤、干燥后得到鲨鱼硫酸软骨素产品,提取的鲨鱼硫酸软骨素产品收率为20%,纯度为95.17%。
实施例3
选取鲨鱼尾软骨50g,鲨鱼脊椎软骨50g,鲨鱼翅软骨100g在沸水中蒸煮2-6h,冲洗干净,用乙醇或丙酮浸泡30min去除油脂。脱脂后的鲨鱼软骨打成碎片,加入1200g浓度为2%NaOH溶液和1200g浓度为1%食盐溶液,在温度为40℃的条件下间歇搅拌碱提取3h,过滤,残渣用适量蒸馏水浸泡过滤,合并两次滤液,并用HCl调pH值至8.5。
选用胃蛋白酶,采用普通包埋固定化方法将其制成10g固定化胃蛋白酶。其中以海藻酸钠为载体进行包埋固定化。酶解过程同实施例1,不再赘述。在酶解过程中用盐酸溶液调整pH为2.0。新的碱提液进入流化床式反应器开始下一轮操作。在酶解过程中用氢氧化钠溶液调整pH为8.5。酶解结束后,将滤液升温至60℃,加入0.5-5%活性炭和适量硅藻土,慢速搅拌20-40min,板框压滤。
超滤过程同实施例1,不再赘述。超滤膜截留分子量为8000,超滤过程中进料温度30℃,中空纤维超滤膜压力0.4MPa,浓缩液的体积是原体积1/3。
浓缩液用碱调pH至8.5,加入2g的双氧水,35℃氧化4h,过滤。过滤后用盐酸调节氧化后滤液pH至5.0,加入浓度为95%的乙醇结晶,最终使溶液中乙醇终浓度达75%,沉淀8-12h后离心得粗品。用蒸馏水洗涤、干燥后得到鲨鱼硫酸软骨素产品提取的鲨鱼硫酸软骨素产品收率为18%,纯度为93.02%。
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代,但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例,但是对本领域熟练技术人员来说,只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (6)
1.一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法,该方法包括以下步骤:
A、碱提:选择鲨鱼软骨脱脂后将其粉碎,加入碱溶液和氯化钠溶液在温度为20-60℃的条件下提取1-10小时,过滤后调滤液pH值为8.5-9.0;所述的碱溶液为浓度为2%-5%的氢氧化钠溶液,所述的氯化钠溶液的浓度为1%-3%,所述的氢氧化钠溶液和氯化钠溶液的加入量均为鲨鱼软骨重量的4-6倍;
B、酶解:将上述碱提后的滤液加入到酶反应器中,加入为软骨投料重量1.0%-5.0%的固定化酶,在pH值为2.0-9.0,温度为45-55℃的条件下酶解2-10小时;所述的固定化酶为固定化木瓜蛋白酶、固定化胰蛋白酶、固定化胃蛋白酶、固定化微生物碱性蛋白酶中的一种或多种;
C、超滤:将酶解后的滤液脱色后,在室温下超滤脱水浓缩至原体积的1/3-1/2;所述的超滤脱水采用的超滤膜截留的分子量为5,000-10,000;
D、氧化、结晶:将超滤脱水后的浓缩液调pH值为8.5-9.0,加入为软骨投料重量0.5%-3%的双氧水,在温度为15-40℃的条件下氧化3-8小时过滤,滤液调pH值为5.0-6.0,加入95%乙醇结晶,使乙醇浓度达65-75%,结晶后离心、洗涤、干燥后得到鲨鱼硫酸软骨素。
2.根据权利要求1所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法,其特征在于:步骤A中所述的鲨鱼软骨为鲨鱼头软骨、鲨鱼尾软骨、鲨鱼脊椎软骨、鲨鱼翅软骨中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法,其特征在于:步骤B中所述的酶反应器为连续搅拌釜式反应器、固定床式反应器、流化床式反应器其中的一种。
4.根据权利要求1或3所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法,其特征在于:步骤B中所述的固定化酶的固定化方法为包埋法或交联法中的一种或两种;所述的包埋法采用的载体为海藻酸钠或海藻酸钠和壳聚糖,所述的交联法采用的载体为壳聚糖,采用的交联剂为戊二醛。
5.根据权利要求1所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法,其特征在于:步骤C中所述的超滤脱水采用的超滤膜为中空纤维式超滤膜、卷式超滤膜、平板式超滤膜中一种。
6.根据权利要求1所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法,其特征在于:步骤D中所述的双氧水的用量为软骨投料量的1%-2%,氧化温度为25-35℃,氧化时间为4-6小时。
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