CN103539955A - 一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人体用长效脱敏A级胶原蛋白(细胞支架)及其制作方法，是将大西洋深海(200-800米)金目红鲷鱼刮掉鱼鳞，扒下鱼皮，然后用盐净化、异丙醇脱脂、酶解微波定位切割、离心分离、氯化钠析附、过滤和冷冻干燥后既可以得到高纯度、无污染的胶原蛋白。再将该胶原蛋白与γ-聚谷氨酸混合，同时加入四臂EPG-NHA溶液并搅拌均匀，进行第一次胶联，再重复加入γ-PGA和四臂EPG-NHA混合溶液并且搅拌均匀，进行二次胶联后，既可以得到人体用长效、脱敏、内融性的胶原蛋白。
Description
技术领域
本发明是提供一种长效脱敏、能够内外源融合的胶原蛋白细胞支架及其制造方法。
背景技术
胶原蛋白由于具备生物的可吸收性和生物的相容性，适合于做生物组织的再生材料，被广泛应用于生物医药领域。目前，胶原蛋白来源有两种，动物源和再生源。动物源胶原蛋白由于动物物种的不同，其胶原蛋白构成与组分有很大的差异性，带来如免疫原性和病原体的传播等诸多问题。再生源则由于制作材料及工艺的限制，表现出较低的机械强度，限制了其在生物组织的细胞支架方面应用。作为生物组织支架的仿生材料，其设计需要高度模仿生物细胞结构强度和最大程度确保内外源细胞融合，发挥其内源性胶原蛋白相同的生物功能。这包括不但要正确地模拟生物组织特有的刚度，同时还能够携带不溶性的生物活性分子诱导细胞分化增殖，并迁移到该胶原蛋白构成的细胞支架上。因此，多功能的仿生胶原组织支架，不仅仅提供细胞和细胞外基质物质相互接触支撑的骨架，而且作为细胞表面受体与细胞外的细胞骨架内部链接，增强细胞对其环境意识的力学性质发生反应，并将这些机械线索的化学信号进行细胞间传导。这样，粘弹性的细胞外基质即胶原蛋白能够仿生性地控制许多细胞特性，如形状、生存性能、附着力、和迁移等。
人们随着年龄的增长，其生理新陈代谢发生变化，导致肌肤发生相应老化。为减缓肌肤老化过程，效果较佳的是合成材料和生物材料。祛除皱纹，改善面部轮廓，填平凹陷瘢痕或唇部或修复受伤组织等都需要软组织填充，人们先后研究了白蜡、脂肪移植、硅树脂、凝胶等植入体内，用于软组织整形。临床应用发现，这些材料均存在着滞后硬块、瘤状肿块、吸收过快、慢性炎症等诸多问题。近年来，美国FDA相继批准了几个用于软组织填充的制品，其主要有效成分为牛胶原、透明质酸、PMMA小球等。这些材料虽然具有一定的效果，但部分使用者仍然存在使用部位红肿、过敏以及降解过快等情况。
下面表格就目前作为人体用的填充材料的存在问题进行分析：
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目在于本发明是提供一种长效脱敏、能够内外源融合的胶原蛋白(细胞支架)及其制造方法，属于实用技术型。主要设计是通过水凝胶介导热可逆的多重螺旋组合处理器，将胶原蛋白与具有四臂的聚乙二醇(PEG)合成的三维水凝胶协同γ-PGA进行两次温敏物理交联，形成多维胶联的三螺旋结构的胶原蛋白(细胞支架)。
本发明的目的是这样实现的：
一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，将深海鱼鱼皮，该深海鱼为金眼红鲷鱼，产地美国，刮去多余组织，去除脂肪，经酸碱膨胀，酶消化，离心过滤，盐析，收集下层沉淀，冷冻干燥后即可得到胶原蛋白，再将该胶原蛋白与γ-聚谷氨酸混合混合，进行第一次胶联；再加入四臂EPG-NHA进行搅拌，在进行第二次胶联，既可以得到长效型胶原蛋白，具体步骤条件为：
(1)精取纯净的深海鱼皮胶原蛋白
一次脱脂，将原料洗净破碎后，先后用10-15倍的净水和5％NaCl溶液沉淀处理，分别除去水溶性和盐溶性的杂质，经过8-12小时的盐吸沉淀，进行离心，离心速度控制在4000-6000转/分钟，离心15分钟，重复以上步骤两次，取沉淀既可得到胶原蛋白粗品，
二次脱脂，将胶原蛋白粗品采用五倍量的99.9％的异丙淳24小时脱脂，进行离心，离心速度控制在4000-6000转/分钟，15分钟，重复以上步骤两次，既可以得到五脂的粗制的胶原蛋白，
(2)蛋白酶水解分三个过程
首先将脱脂肪的粗制胶原蛋白和水的比例1∶3的比例加入罐中，搅拌成浆液，反应温度控制在50-55摄氏度，将料液的Ph值控制在8-8.5范围，碱性蛋白酶A0.05-0.3％；搅拌1-3小时；
其次，将料液的酸碱度控制在中性，pH＝7，加入中性蛋白酶B0.1-0.3％，搅拌水解2-5小时；
最后反应结束后升温，温度升到92-95摄氏度，持续20-30分钟，进行灭酶。
(3)去杂质纯化
将灭酶后的浆液温度控制在60-78摄氏度，加入溶质量的20％活性碳，加压过滤，通过过滤泵进入纳滤系统，
(4)纳滤精选大分子蛋白
以低压力为推动力，通过介于反渗透和超滤之间的滤膜，有较高的截流率。可精选到220000-300000万之间的大分子蛋白，
(5)胶原蛋白凝胶强度最大化
等电使胶原蛋白改变性质，凝胶强度增加一倍，pH5.9-pH6.1高强度胶联，以上鱼皮胶原蛋白配制成1％，pH8.用0.1％的盐酸，调制到pH5.9-6.1，
由于胶原蛋白是一种酸，碱两性电解质，因此，通过改变酸碱度即可以改变其分子胶联蛋白的凝胶强度将为最大，
(6)多维三螺立体温敏胶联(温度敏感的折叠)温度调制介导的三螺旋的多维立体物理交联凝胶多维立体合成的水凝胶的peg-胶原蛋白，PEG-胶原蛋白的配合物的合成反应n-hydroxysuccinimide-activated四臂聚乙二醇，即peg-nhs和胶原蛋白和聚谷氨酸即γ-PGA，在1∶5∶3摩尔比肽、peg-nhs和胶原蛋白混合装入容器内，反应混合物被放置在一个75℃，孵化36小时期间，PEG-胶原蛋白-PGA反应的发生。
上述一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，其中该有机脱脂溶剂为异丙醇有机溶剂。
上述一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，其中该等电点Ph值范围Ph5.9-Ph6.1
上述一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，其中季戊四醇四或琥珀酰亚胺羧基戊基平均聚氧乙烯分子量11000Da。
上述一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，其中孵化温度70-80度。
上述一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，PEG-胶原蛋白-的水凝胶含有三螺旋多维交联。
上述一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，PEG-胶原蛋白的配合物的合成反应n-hydroxysuccinimide-activated四臂聚乙二醇即peg-nhs、胶原蛋白和聚谷氨酸即γ-PGA，其配比浓度在1∶5∶1。
胶原蛋白生物材料，尤其是动物源胶原蛋白，已被广泛用于生物医学。动物源胶原蛋白具有的生物可吸收性是它用来做细胞支架的基本特性，其生物相容性使它作为一个适合的生物材料用于组织再生。胶原蛋白是一种经济实惠的生物材料，可以控制性地制备相应的孔隙度，增强细胞迁移或扩散的生物活性因子。由于动物源胶原蛋白构成的固有问题，如免疫原性和病原体的传播。此外，再生胶原凝胶表现出低的机械强度，限制了胶原蛋白在组织工程支架的应用。这些缺点，强调需要制定人工支架模仿的结构和在细胞外基质的天然胶原蛋白生物功能的能力。人工支架的设计带来了许多挑战包括正确地模拟组织刚度和将不溶性生物活性分子诱导细胞分化增殖，并迁移到细胞的脚手架。因此，创建生物功能和有效的合成胶原组织支架，需要一个坚实的理解之间的相互作用细胞和细胞外基质。细胞表面受体的细胞外基质蛋白细胞骨架的内部链接，使细胞对他们的环境意识的力学性质和反应将这些机械线索的化学信号。鉴于现代人体注射用胶原蛋白的存在的问题，存留时间短和具有生物毒性等弊端，本发明人依据相关生物学及物理学进行设计，从以下两个方面入手解决问题：
1.长效，复合刚性多维物理胶联结构
本发明，设计合成的三维水凝胶具有四个臂聚乙二醇(PEG)协同γ-PGA与胶原蛋白，通过物理交联水凝胶介导热可逆的多重螺旋组装多核处理器。在这里，我们提出的各种制造PEG-胶原蛋白和γ-PGA的多维水凝胶及其局部力学性能的粒子跟踪确定微流变学。结果表明，胶原蛋白介导的物理交联可以通过改变温度促成凝胶三螺旋的形成。这样两个本体通过局部刚度或刚度梯度调制成PEG-胶原蛋白-PGA水凝胶，该种新型胶原蛋白具有提供细胞生物生长或黏住的特有物理化学信号的生物组织脚手架的潜力。
物理胶联材料的分子式及分子量：
1).γ-PGA(γ-聚麸胺酸)分子量5万-50万Da
2).PEG(多聚乙二醇)分子量400-8000Da
季戊四醇四(琥珀酰亚胺，羧基戊基)聚氧乙烯(Four-arm PEG-NHS)
分子量：11，000Da
2.绿色无毒产品
本发明的另一个目的是提供无毒的生物胶原蛋白，是利用四臂PGA透过胶原蛋白形成多维胶联结构支架，同时具有较佳的生物适应的胶原蛋白，以解决传统的使用胶原蛋白与戊二醛的胶联造成体内高能度毒性物质的残留，以及戊二醛及丙酮等有害物质给健康带来的过敏，中毒等危害。
附图说明
图1为工艺流程图
具体实施方式
本发明是一种长效、无毒高弹性型胶原蛋白及其制备方法。首先制备高纯度无任何毒性化学添加；其次，调节等电点，达到最高天然凝胶强度；而后，与胶原蛋白形成多维立体物理化学胶联结构，制造成人工支架。因为受到人体体内酵素降解的高抵抗性影响，可大幅度减缓胶原蛋白在人体内的降解速度。本发明的长效、多维立体无毒无害的胶原蛋白的制造是依据以下步骤进行的：
实施例1.胶原蛋白的制作
步骤一，新鲜或冷冻深海鱼皮拨取脂肪后，该深海鱼为金眼红鲷鱼，产地美国，称取新鲜的鱼皮5000克搅碎；
步骤二，用5倍量(25000克)5％盐水中搅拌4小时，沉淀后离心(5000转/分钟)；
步骤三，再脱脂。99.9％的异丙醇4胶原蛋白量每次搅拌2小时，两次脱脂；
步骤四，酶解。在10倍鱼皮蛋白的溶液量，加0.1％碱性酶A和0.1％碱性酶B，pH调成8.5。在50度下，1小时搅拌。
步骤五，紧急速冻排酸，-40度24小时。
步骤六，过滤。
步骤七，冷冻干燥
2.等电点物理胶联
步骤八，等电点成胶，1％胶原蛋白，调制到pH5.9-6.1，放置24小时。
3.多维立体温敏化学物理胶联
步骤九，反应n-hydroxysuccinimide-activated四臂聚乙二醇(peg-nhs；1000克)和胶原蛋白(5000克)和聚谷氨酸(γ-PGA；1000克)，在1∶5∶1摩尔比例，peg-nhs和胶原蛋白混合装入在50mM NaHCO3缓冲溶液容器内，在4℃条件下，反应混合物加温，被放置在一个76℃保温箱里孵化36小时，PEG-胶原蛋白-PGA。
步骤十，进行第二次胶联，重复步骤九，完成胶联后，即可以得到长效，无毒多维立体高弹性的胶原蛋白。
以下检测步骤证明长效蛋白的确有抗降解的效果：
1，BCA检测和动物皮下试验
可以解决胶原蛋白的存留时间短的缺点，15-24个月。
2，毒性试验：
1)粒线体酵素活性(MTT)；发现等细胞活性。
2)乳酸脱氢酶(LDH)：检测出该细胞检测高存活率
3)总DNA含量A，B，C等细胞数量。
4)半乳口甘酶(B-Galactosidase)：A，B，C等细胞衰老。
5)染色体畸变(Chromosome Aberration)：A，B，C等细胞畸形。
由此证明：本发明产品无毒无害，故具有适用性和长效型。
实施例2.胶原蛋白的制作
步骤一，新鲜或冷冻深海鱼皮拨取脂肪后，该深海鱼为金眼红鲷鱼，产地美国，称取新鲜的鱼皮5000克搅碎；
步骤二，用5倍量(25000克)5％盐水中搅拌4小时，沉淀后离心(6000转/分钟)；
步骤三，再脱脂。99.9％的异丙醇4-6胶原蛋白量每次搅拌2小时，两次脱脂；
步骤四，酶解。在10倍鱼皮蛋白的溶液量，加0.5％碱性酶A和0.5％碱性酶B，pH调成8.5。在53度下，3小时搅拌。
步骤五，紧急速冻排酸，-40度24小时。
步骤六，过滤。
步骤七，冷冻干燥
2.等电点物理胶联
步骤八，等电点成胶，1％胶原蛋白，调制到pH6.1，放置24小时。
3.多维立体温敏化学物理胶联
步骤九，反应n-hydroxysuccinimide-activated四臂聚乙二醇(peg-nhs；1000克)和胶原蛋白(5000克)和聚谷氨酸(γ-PGA；1000克)，在1∶5∶1摩尔比例，peg-nhs和胶原蛋白混合装入在50mM NaHCO3缓冲溶液容器内，在4℃条件下，反应混合物加温，被放置在一个76℃保温箱里孵化36小时，PEG-胶原蛋白-PGA。
步骤十，进行第二次胶联，重复步骤九，完成胶联后，即可以得到长效，无毒多维立体高弹性的胶原蛋白。
以下检测步骤证明长效蛋白的确有抗降解的效果：
1，BCA检测和动物皮下试验
可以解决胶原蛋白的存留时间短的缺点，15-24个月。
2，毒性试验：
1)粒线体酵素活性(MTT)；发现等细胞活性。
2)乳酸脱氢酶(LDH)：检测出该细胞检测高存活率
3)总DNA含量A，B，C等细胞数量。
4)半乳口甘酶(B-Galactosidase)：A，B，C等细胞衰老。
5)染色体畸变(Chromosome Aberration)：A，B，C等细胞畸形。
由此证明：本发明产品无毒无害，故具有适用性和长效型。
Claims (7)
1.一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，其特征在于：将深海鱼鱼皮，该深海鱼为金眼红鲷鱼，产地美国，刮去多余组织，去除脂肪，经酸碱膨胀，酶消化，离心过滤，盐析，收集下层沉淀，冷冻干燥后即可得到胶原蛋白，再将该胶原蛋白与γ-聚谷氨酸混合混合，进行第一次胶联；再加入四臂EPG-NHA进行搅拌，在进行第二次胶联，既可以得到长效型胶原蛋白，具体步骤条件为：
(1)精取纯净的深海鱼皮胶原蛋白
一次脱脂，将原料洗净破碎后，先后用10-15倍的净水和5％NaCl溶液沉淀处理，分别除去水溶性和盐溶性的杂质，经过8-12小时的盐吸沉淀，进行离心，离心速度控制在4000-6000转/分钟，离心15分钟，重复以上步骤两次，取沉淀既可得到胶原蛋白粗品，
二次脱脂，将胶原蛋白粗品采用五倍量的99.9％的异丙淳24小时脱脂，进行离心，离心速度控制在4000-6000转/分钟，15分钟，重复以上步骤两次，既可以得到五脂的粗制的胶原蛋白，
(2)蛋白酶水解分三个过程
首先将脱脂肪的粗制胶原蛋白和水的比例1∶3的比例加入罐中，搅拌成浆液，反应温度控制在50-55摄氏度，将料液的Ph值控制在8-8.5范围，碱性蛋白酶A0.05-0.3％；搅拌1-3小、时；
其次，将料液的酸碱度控制在中性，pH＝7，加入中性蛋白酶B0.1-0.3％，搅拌水解2-5小时；
最后反应结束后升温，温度升到92-95摄氏度，持续20-30分钟，进行灭酶。
(3)去杂质纯化
将灭酶后的浆液温度控制在60-78摄氏度，加入溶质量的20％活性碳，加压过滤，通过过滤泵进入纳滤系统，
(4)纳滤精选大分子蛋白
以低压力为推动力，通过介于反渗透和超滤之间的滤膜，有较高的截流率。可精选到220000-300000万之间的大分子蛋白，
(5)胶原蛋白凝胶强度最大化
等电使胶原蛋白改变性质，凝胶强度增加一倍，pH5.9-pH6.1高强度胶联，以上鱼皮胶原蛋白配制成1％，pH8.用0.1％的盐酸，调制到pH5.9-6.1，
由于胶原蛋白是一种酸，碱两性电解质，因此，通过改变酸碱度即可以改变其分子胶联蛋白的凝胶强度将为最大，
(6)多维三螺立体温敏胶联(温度敏感的折叠)温度调制介导的三螺旋的多维立体物理交联凝胶多维立体合成的水凝胶的peg-胶原蛋白，PEG-胶原蛋白的配合物的合成反应n-hydroxysuccinimide-activated四臂聚乙二醇，即peg-nhs和胶原蛋白和聚谷氨酸即γ-PGA，在1∶5∶3摩尔比肽、peg-nhs和胶原蛋白混合装入容器内，反应混合物被放置在一个75℃，孵化36小时期间，PEG-胶原蛋白-PGA反应的发生。
2.根据权利要求1所述的一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，其特征在于：其中该有机脱脂溶剂为异丙醇有机溶剂。
3.根据权利要求1所述的一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，其特征在于：其中该等电点Ph值范围Ph5.9-Ph6.1。
4.根据权利要求1所述的一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，其特征在于：其中季戊四醇四或琥珀酰亚胺羧基戊基平均聚氧乙烯分子量11000Da。
5.根据权利要求1所述的一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，其特征在于：其中孵化温度70-80度。
6.根据权利要求1所述的一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，其特征在于：PEG-胶原蛋白-的水凝胶含有三螺旋多维交联。
7.根据权利要求1所述的一种人体注射用长效、脱敏、内融型胶原蛋白细胞支架及其制作方法，其特征在于：PEG-胶原蛋白的配合物的合成反应n-hydroxysuccinimide-activated四臂聚乙二醇即peg-nhs、胶原蛋白和聚谷氨酸即γ-PGA，其配比浓度在1∶5∶1。
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