CN107384999A - 从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法，包括打浆去脂、复合酶酶解、等电点沉淀、二次超滤并纳滤和冷冻干燥。采用复合海洋蛋白酶作为酶解剂，并辅以超声波酶解，冷冻干燥得到的功能蛋白肽为复合多肽，其中一种多肽的氨基酸序列为SCASVCKAHCRCRARRCGYYVSVFYRGRCYCRCLRC。有益效果为：得到的功能蛋白肽与胶原蛋白之间通过分子间作用力和氢键连接，功能蛋白肽在胶原蛋白分子表面附着，将其包裹，可保护胶原蛋白不被胃酸分解，并能促进其达到动物结缔组织、软骨及皮肤真皮层。

Description

从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法
技术领域
本发明涉及蛋白肽制备领域，具体是一种从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法。
背景技术
天然存在的海洋活性多肽由于在生物体中含量低，而且提取困难，难以实现大量生产供给所需，化学人工合成多肽成本昂贵。所以，人们更多地把目光投向开发蛋白酶解产物获得活性多肽这条途径上来。由于海洋生物生存的环境与陆地生物完全不同，如高压、低温、高温和高盐等极端环境，为了适应这些极端的海洋生物环境，海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，同时，海洋生物蛋白资源无论在种类和数量上都远远大于陆地蛋白资源，并且未得到很好的开发。种类繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潜在着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就释放出有活性的肽段。海洋生物蛋白资源是21世纪人类重要的蛋白类食物及生物活性物质的重要来源。我国目前的海洋生物蛋白资源总量在世界各国名列前茅，但我国目前的蛋白类水产品中，除一部分直接食用外，大部分通过简单的加工技术制成食品进入市场，加工技术落后，产品结构单一，产品的附加值低，使得产品在国际市场上的竞争力较差。因此，我国急需对海洋生物蛋白资源进行优化利用和高值化加工。
胶原蛋白又称胶原，是由三条肽链相互缠绕形成的纤维状蛋白质，是一种糖蛋白，含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸及糖，广泛存在于动物的皮肤、骨、软骨及肌腱等组织中，是机体含量最多的一类蛋白质。胶原蛋白可用于修复皮肤疤痕、抗老、淡斑及美白等方面 , 是美容圣品，但通过食用方式补充胶原蛋白，其利用率极低，大部分会被机体分解，失去活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法，提取得到的功能蛋白肽可保护胶原蛋白不被胃酸分解，并能促进其达到动物结缔组织、软骨及皮肤真皮层。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法，包括打浆去脂、复合酶酶解、等电点沉淀、二次超滤并纳滤和冷冻干燥。复合酶酶解步骤为在去脂匀浆中加入海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶酶解，并采用超声波辅助酶解。海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，用海洋蛋白酶酶解海产品可释放出许多不同的活性肽段。采用海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶酶解巴沙鱼皮蛋白可得到能保护胶原蛋白不被胃酸分解的功能蛋白肽。目前未有采用其他蛋白酶酶解得到上述功能蛋白肽的报导。
海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶的加入量为1~2wt%，酶解温度为25~35℃，pH为7.0~9.0，酶解时间为50~70min，超声波频率为20~30kHZ，超声波功率为600~900W，超声时间为10~15min。上述酶解条件为最优选，在保证酶解效率的前提下，投入的物料和时间成本最低。
海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶质量比为1:2~5。上述蛋白酶质量配比，酶解得到的功能蛋白肽量最多。
打浆去脂步骤为将巴沙鱼皮打浆，再加入2~5倍体积的纯水，高速离心去除上层脂肪，得到去脂巴沙鱼皮匀浆。根据物质相似相容的特点，鱼皮中的脂肪不溶于水漂浮于水层之上。将鱼皮浆液去脂，可以酶解的效果。
等电点沉淀步骤为将酶解液过滤，调节滤液的pH值为4.5~4.8，静置后离心取沉淀。在上述pH环境下，功能蛋白肽呈电中性，微溶于水，大部分以沉淀形式从水溶液中分离出来。
二次超滤并纳滤步骤为先采用截留相对分子质量30~40kD的膜超滤，再采用截留相对分子质量4~8kD的膜超滤，最后将滤过液进行纳滤除盐。为了防止膜孔堵塞或膜损害，先采用大孔超滤膜进行超滤，再采用小孔超滤膜超滤，有效去除分子量大于4~8kD的杂质。纳滤可较彻底的去除溶液中的无机盐及分子量小于200Da的杂质，对功能蛋白肽进一步进行纯化。
冷冻干燥步骤中加入20~35wt%聚乙烯吡洛烷酮作为冻干添加剂；冷冻干燥得到的功能蛋白肽为复合多肽，其中一种多肽的氨基酸序列为SCASVCKAHCRCRARRCGYYVSVFYRGRCYCRCLRC。功能蛋白肽需要含有合适的剩余水分来保持在储存过程中性质的稳定，过度的干燥将使蛋白质分子表面的氢键和极性基团暴露而变性。冷冻干燥过程中，加入聚乙烯吡洛烷酮，可保护功能蛋白肽的蛋白伸展、四级结构，从而对功能蛋白肽活性进行保护。上述功能蛋白肽与胶原蛋白之间通过分子间作用力和氢键连接，功能蛋白肽在胶原蛋白分子表面附着， 将其包裹，可保护胶原蛋白不被胃酸分解，并能促进其达到动物结缔组织、软骨及皮肤真皮层，具体作用机理尚不明确。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1. 海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，用海洋蛋白酶酶解海产品可释放出许多不同的活性肽段。采用海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶酶解巴沙鱼皮蛋白可得到能保护胶原蛋白不被胃酸分解的功能蛋白肽。目前未有采用其他蛋白酶酶解得到上述功能蛋白肽的报导。
2. 冷冻干燥得到的功能蛋白肽为复合多肽，其中一种多肽的氨基酸序列为SCASVCKAHCRCRARRCGYYVSVFYRGRCYCRCLRC。功能蛋白肽需要含有合适的剩余水分来保持在储存过程中性质的稳定，过度的干燥将使蛋白质分子表面的氢键和极性基团暴露而变性。冷冻干燥过程中，加入聚乙烯吡洛烷酮，可保护功能蛋白肽的蛋白伸展、四级结构，从而对功能蛋白肽活性进行保护。上述功能蛋白肽与胶原蛋白之间通过分子间作用力和氢键连接，功能蛋白肽在胶原蛋白分子表面附着， 将其包裹，可保护胶原蛋白不被胃酸分解，并能促进其达到动物结缔组织、软骨及皮肤真皮层，具体作用机理尚不明确。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法，包括打浆去脂、复合酶酶解、等电点沉淀、二次超滤并纳滤和冷冻干燥。复合酶酶解步骤为在去脂匀浆中加入海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶酶解，并采用超声波辅助酶解。海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，用海洋蛋白酶酶解海产品可释放出许多不同的活性肽段。采用海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶酶解巴沙鱼皮蛋白可得到能保护胶原蛋白不被胃酸分解的功能蛋白肽。目前未有采用其他蛋白酶酶解得到上述功能蛋白肽的报导。
海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶的加入量为1~2wt%，酶解温度为25~35℃，pH为7.0~9.0，酶解时间为50~70min，超声波频率为20~30kHZ，超声波功率为600~900W，超声时间为10~15min。上述酶解条件为最优选，在保证酶解效率的前提下，投入的物料和时间成本最低。
海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶质量比为1:2~5。上述蛋白酶质量配比，酶解得到的功能蛋白肽量最多。
打浆去脂步骤为将巴沙鱼皮打浆，再加入2~5倍体积的纯水，高速离心去除上层脂肪，得到去脂巴沙鱼皮匀浆。根据物质相似相容的特点，鱼皮中的脂肪不溶于水漂浮于水层之上。将鱼皮浆液去脂，可以酶解的效果。
等电点沉淀步骤为将酶解液过滤，调节滤液的pH值为4.5~4.8，静置后离心取沉淀。在上述pH环境下，功能蛋白肽呈电中性，微溶于水，大部分以沉淀形式从水溶液中分离出来。
二次超滤并纳滤步骤为先采用截留相对分子质量30~40kD的膜超滤，再采用截留相对分子质量4~8kD的膜超滤，最后将滤过液进行纳滤除盐。为了防止膜孔堵塞或膜损害，先采用大孔超滤膜进行超滤，再采用小孔超滤膜超滤，有效去除分子量大于4~8kD的杂质。纳滤可较彻底的去除溶液中的无机盐及分子量小于200Da的杂质，对功能蛋白肽进一步进行纯化。
冷冻干燥步骤中加入20~35wt%聚乙烯吡洛烷酮作为冻干添加剂；冷冻干燥得到的功能蛋白肽为复合多肽，其中一种多肽的氨基酸序列为SCASVCKAHCRCRARRCGYYVSVFYRGRCYCRCLRC。功能蛋白肽需要含有合适的剩余水分来保持在储存过程中性质的稳定，过度的干燥将使蛋白质分子表面的氢键和极性基团暴露而变性。冷冻干燥过程中，加入聚乙烯吡洛烷酮，可保护功能蛋白肽的蛋白伸展、四级结构，从而对功能蛋白肽活性进行保护。上述功能蛋白肽与胶原蛋白之间通过分子间作用力和氢键连接，功能蛋白肽在胶原蛋白分子表面附着， 将其包裹，可保护胶原蛋白不被胃酸分解，并能促进其达到动物结缔组织、软骨及皮肤真皮层，具体作用机理尚不明确。
实施例2：
从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的最优选方法，包括以下步骤：
1）打浆去脂：将巴沙鱼皮打浆，再加入4倍体积的纯水，高速离心去除上层脂肪，得到去脂巴沙鱼皮匀浆；
2）复合酶酶解：在去脂匀浆中加入海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶酶解，并采用超声波辅助酶解。海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶的加入量为1.8wt%，酶解温度为32℃，pH为8.0，酶解时间为60min，超声波频率为26kHZ，超声波功率为800W，超声时间为13min。海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶质量比为1:4；
3）等电点沉淀：将酶解液过滤，调节滤液的pH值为4.7，静置后离心取沉淀；
4）二次超滤并纳滤：先采用截留相对分子质量30kD的膜超滤，再采用截留相对分子质量6kD的膜超滤，最后将滤过液进行纳滤除盐；
5）冷冻干燥：在纳滤除盐后的滤过液中加入32wt%聚乙烯吡洛烷酮作为冻干添加剂，进行冷冻干燥。冷冻干燥得到的功能蛋白肽为复合多肽，其中一种多肽的氨基酸序列为SCASVCKAHCRCRARRCGYYVSVFYRGRCYCRCLRC。功能蛋白肽需要含有合适的剩余水分来保持在储存过程中性质的稳定，过度的干燥将使蛋白质分子表面的氢键和极性基团暴露而变性。冷冻干燥过程中，加入聚乙烯吡洛烷酮，可保护功能蛋白肽的蛋白伸展、四级结构，从而对功能蛋白肽活性进行保护。上述功能蛋白肽与胶原蛋白之间通过分子间作用力和氢键连接，功能蛋白肽在胶原蛋白分子表面附着， 将其包裹，可保护胶原蛋白不被胃酸分解，并能促进其达到动物结缔组织、软骨及皮肤真皮层，具体作用机理尚不明确。
实施例3：
从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的最优选方法，包括以下步骤：
1）打浆去脂：将巴沙鱼皮打浆，再加入3倍体积的纯水，高速离心去除上层脂肪，得到去脂巴沙鱼皮匀浆；
2）复合酶酶解：在去脂匀浆中加入海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶酶解，并采用超声波辅助酶解。海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶的加入量为1.6wt%，酶解温度为30℃，pH为8.2，酶解时间为55min，超声波频率为25kHZ，超声波功率为800W，超声时间为13min。海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶质量比为1:3；
3）等电点沉淀：将酶解液过滤，调节滤液的pH值为4.6，静置后离心取沉淀；
4）二次超滤并纳滤：先采用截留相对分子质量30kD的膜超滤，再采用截留相对分子质量6kD的膜超滤，最后将滤过液进行纳滤除盐；
5）冷冻干燥：在纳滤除盐后的滤过液中加入30wt%聚乙烯吡洛烷酮作为冻干添加剂，进行冷冻干燥。冷冻干燥得到的功能蛋白肽为复合多肽，其中一种多肽的氨基酸序列为SCASVCKAHCRCRARRCGYYVSVFYRGRCYCRCLRC。功能蛋白肽需要含有合适的剩余水分来保持在储存过程中性质的稳定，过度的干燥将使蛋白质分子表面的氢键和极性基团暴露而变性。冷冻干燥过程中，加入聚乙烯吡洛烷酮，可保护功能蛋白肽的蛋白伸展、四级结构，从而对功能蛋白肽活性进行保护。上述功能蛋白肽与胶原蛋白之间通过分子间作用力和氢键连接，功能蛋白肽在胶原蛋白分子表面附着， 将其包裹，可保护胶原蛋白不被胃酸分解，并能促进其达到动物结缔组织、软骨及皮肤真皮层，具体作用机理尚不明确。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 浦江县泰如食品科技有限公司
<120> 从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Ser Cys Ala Ser Val Cys Lys Ala His Cys Arg Cys Arg Ala Arg Arg
1 5 10 15
Cys Gly Tyr Tyr Val Ser Val Phe Tyr Arg Gly Arg Cys Tyr Cys Arg
20 25 30
Cys Leu Arg Cys
35

Claims (7)

1.从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法，包括打浆去脂、复合酶酶解、等电点沉淀、二次超滤并纳滤和冷冻干燥，其特征在于：所述的复合酶酶解步骤为在去脂匀浆中加入海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶酶解，并采用超声波辅助酶解。
2.根据权利要求1所述的从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法，其特征在于：所述的海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶的加入量为1~2wt%，酶解温度为25~35℃，pH为7.0~9.0，酶解时间为50~70min，超声波频率为20~30kHZ，超声波功率为600~900W，超声时间为10~15min。
3.根据权利要求1所述的从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法，其特征在于：所述的海洋氧化短杆菌产碱性蛋白酶和裙带菜蛋白酶质量比为1:2~5。
4.根据权利要求1所述的从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法，其特征在于：所述的打浆去脂步骤为将巴沙鱼皮打浆，再加入2~5倍体积的纯水，高速离心去除上层脂肪，得到去脂巴沙鱼皮匀浆。
5.根据权利要求1所述的从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法，其特征在于：所述的等电点沉淀步骤为将酶解液过滤，调节滤液的pH值为4.5~4.8，静置后离心取沉淀。
6.根据权利要求1所述的从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法，其特征在于：所述的二次超滤并纳滤步骤为先采用截留相对分子质量30~40kD的膜超滤，再采用截留相对分子质量4~8kD的膜超滤，最后将滤过液进行纳滤除盐。
7.根据权利要求1所述的从巴沙鱼皮提取功能蛋白肽的方法，其特征在于：所述的冷冻干燥步骤中加入20~35wt%聚乙烯吡洛烷酮作为冻干添加剂；冷冻干燥得到的功能蛋白肽为复合多肽，其中一种多肽的氨基酸序列为SCASVCKAHCRCRARRCGYYVSVFYRGRCYCRCLRC。
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