CN114470330B - 用于组织填充的重组胶原蛋白凝胶微粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于组织填充的重组胶原蛋白凝胶微粒及其制备方法。所述的重组胶原蛋白凝胶微粒由重组胶原蛋白在一定条件下交联后，经过切块、透析、除水、粉碎、离心、灭菌、灌装等工艺制得。本发明制备的重组胶原蛋白凝胶微粒，粒径为50～1000微米，可通过注射针头直接挤出；渗透压350～400mosm，pH 5～7；交联剂残留在0.1～10μmol/L，符合药典规定；稳定性好，高温高压处理后不改变凝胶微粒的性状；抗酶解能力强；具有可注射性和一定的可塑性；无免疫原性，生物安全型高；可被胶原酶完全降解，降解产物为氨基酸和水，可作为填充物用于组织填充中，适用于医美领域。

Description

用于组织填充的重组胶原蛋白凝胶微粒及其制备方法

技术领域

本发明属于植入类医疗器械领域，涉及一种用于组织填充的重组胶原蛋白凝胶微粒及其制备方法。

背景技术

“重组胶原蛋白”是基于类人胶原蛋白的主要功能序列的特性，利用生物基因工程技术，把胶原蛋白中的一部分mRNA逆转录，得到合适的cDNA序列后，再优选合适的载体表达，经过双酶切处理后，转移到各种宿主细胞中诱导表达得到高分子蛋白，并经过分离、复性、纯化后获得所需要的生物蛋白。与传统天然胶原蛋白相比，具有以下优点：(1)加工性强：重组胶原蛋白可形成三重复螺旋结构，具有更好的可加工性；(2)质量可控：基因工程技术可表达特定分子量的类人胶原片段，而提取的胶原蛋白所获得的是分子量广泛分布的产物，不利于质量控制；(3)水溶性：通过构建和结构改造，重组胶原蛋白蛋白能溶于水，具有更高的开发价值；(4)较低的排异反应：类人胶原蛋白是以人体胶原蛋白基因为基础构建，其免疫排异反应比动物来源的胶原蛋白小。重组胶原蛋白作为一种新型的、可吸收降解的生物材料，凭借其独特的生物安全性以及优异的促进组织再生能力，在生物医疗领域将会得到越来越广泛的应用。

申请人在先专利CN102443057B公开了一种重组人源胶原蛋白，是利用毕赤酵母作为宿主表达的一种III型重组胶原蛋白，分子量为55-110Kda，水溶性优异。但是，正是由于其低分子量和水溶性强的特性，导致其自身无法形成凝胶，需要借助化学手段增大其分子量，从而形成具有一定强度的水凝胶。

中国专利申请CN101107270A、CN101056891 A和CN102558600 A均采用二乙烯基砜作为透明质酸钠交联剂，通过羧基与羟基的酯化反应进行交联，制备透明质酸钠水凝胶，然而该方法制得的产品中引入了醚键，增加了生物风险。中国专利CN1301139C公开了一种交联透明质酸钠内酯的制备方法，但交联反应需要在有机溶剂中进行，且产物在丙酮中沉淀获得，不仅具有有机溶解残留的风险，且工艺步骤较为复杂，制备周期较长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于组织填充的重组胶原蛋白凝胶微粒及其制备方法。本发明的重组胶原蛋白凝胶微粒可通过注射针头植入到软组织中，给皮肤补充营养物质的同时，促进皮肤自身胶原蛋白合成，起到纠正皱纹、填充凹陷等作用。

实现本发明目的的技术方案如下：

用于组织填充的重组胶原蛋白凝胶微粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)在不断搅拌下，用氢氧化钠溶液调节重组胶原蛋白溶液pH至5～6.5，然后逐滴加入交联剂碳化二亚胺类溶液，继续搅拌反应一段时间，停止搅拌后迅速将反应溶液转移到模具中，室温静置，得到交联度为4％～15％、重组胶原蛋白浓度为6％～18％的凝胶；所述的重组胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵所产生；

(2)将凝胶切成小块，搅拌透析除去交联剂，直至交联剂残留量≤10μmol/L，干燥除去凝胶中吸收的多余水分；

(3)二步法制备凝胶微粒：第一步，用分散机把凝胶块打碎成小颗粒，同时补加生理盐水或PBS；第二步，用均质机进一步把小颗粒粉碎成细小微粒，直至可通过注射针头挤出，所述的细小微粒的粒径为50～1000微米；

(4)对细小微粒进行离心，弃去上清，得到凝胶微粒半成品；

(5)对凝胶微粒进行灭菌，灌装，制得重组胶原蛋白凝胶微粒成品。

本发明采用的重组胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵所产生，已在中国专利CN102443057B充分公开。

本发明步骤(1)中，水溶性碳化二亚胺类为常用的化学交联剂，包括但不限于二环己基碳二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐等。

本发明步骤(1)中，交联度是指交联剂与重组胶原蛋白的质量比。作为优选，交联度为5％～10％。

优选地，步骤(1)中，反应时间为30s～8min。

优选地，步骤(2)中，凝胶块的体积为0.5～5立方厘米。

优选地，步骤(2)中，透析过程中采用的透析液为蒸馏水、纯化水或生理盐水；搅拌转速为200～500rpm；每次透析时间为1～2小时，透析次数为4～8次；透析液体积与凝胶块重量的比例为10～20:1，ml：g。

优选地，步骤(2)中，干燥温度为40～80℃。

优选地，步骤(3)中，分散机转速为2000～5000rpm，分散次数为3～6次；均质机转速为6000～10000rpm，均质次数为5～10次。

优选地，步骤(3)中，注射针头规格为27G或30G，优选27G。

优选地，步骤(4)中，离心转速为1000～3000rpm，离心次数为1～5次，离心时间为5～10分钟/次。

优选地，步骤(5)中，采用高温高压湿热灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为10～20分钟。

优选地，步骤(5)中，凝胶微粒半成品中，重组胶原蛋白的含量为6％～9％。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明采用的重组人源胶原蛋白，无免疫原性，生物安全性高；吸水能力强，锁水能力高，在体内可完全降解。

(2)选用碳二亚胺类作为交联剂，可以促进胶原蛋白自身发生羧基与氨基的反应，形成稳定的酰胺键；同时，交联剂转化成脲类衍生物，随透析液排出，几乎无残留。

(3)通过控制交联剂的用量得到不同交联度的重组胶原蛋白凝胶，不仅稳定性大大提高，而且可以耐受高温灭菌，为工业化生产提供保障。

(4)本发明交联胶原蛋白方法与传统方法不同，不需要N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的参与，而且在室温即可完成交联形成凝胶，既避免杂质引入又不需要低温等条件的限制；另外，采用机械方式制备凝胶微粒，粒径分布可控，均质性极好，操作简单，满足工艺转化和大批量生产。

(5)首次将重组胶原蛋白类作为填充剂使用，重组胶原蛋白不仅可以为细胞再生提供三维结构，而且其在机体内的最终降解产物氨基酸和水也成为了细胞的营养物质，因此重组胶原蛋白凝胶微粒在作为组织填充剂的同时也为组织再生提供了优异条件。

附图说明

图1为对比例2没有形成凝胶的结果图。

图2为实施例1形成凝胶的结果图。

图3为实施例1凝胶微粒粒径图，放大倍数10×。

图4为实施例1凝胶微粒挤出后的实物图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述。

对比例1

1.配制20％重组胶原蛋白溶液，称取5g重组胶原蛋白粉末，加蒸馏水25g搅拌溶解，待用；配制浓度20％碳二亚胺溶液，称取1g碳二亚胺粉末，加蒸馏水4g溶解；

2.量取20g重组胶原蛋白溶液，用1M氢氧化钠溶液调整pH至7.5，加入4g蒸馏水，充分搅拌；在不断搅拌情况下，逐滴加入1g碳二亚胺溶液，使重组胶原的浓度为16％，交联度为5％；

3.反应1分钟后，停止搅拌；然后，迅速将反应溶液转移到模具中，室温静置，观察其能否形成水凝胶。

对比例2

1.配制20％重组胶原蛋白溶液，称取5g重组胶原蛋白粉末，加蒸馏水25g搅拌溶解，待用；配制浓度20％碳二亚胺溶液，称取1g碳二亚胺粉末，加蒸馏水4g溶解；

2.量取18g重组胶原蛋白溶液，用1M氢氧化钠溶液调整pH至5.2，加入4.14g蒸馏水，充分搅拌；在不断搅拌情况下，逐滴加入0.36g碳二亚胺溶液，使重组胶原的浓度为16％，交联度为2％；

3.反应1分钟后，停止搅拌；然后，迅速将反应溶液转移到模具中，室温静置，观察其能否形成水凝胶。

对比例3

1.配制20％重组胶原蛋白溶液，称取5g重组胶原蛋白粉末，加蒸馏水20g搅拌溶解，待用；配制浓度20％碳二亚胺溶液，称取1g碳二亚胺粉末，加蒸馏水4g溶解；

2.量取9g重组胶原蛋白溶液，用1M氢氧化钠溶液调整pH至5.2，加入50.46g蒸馏水，充分搅拌；在不断搅拌情况下，逐滴加入0.54g碳二亚胺溶液，使重组胶原的浓度为3％，交联度为6％；

3.反应1分钟后，停止搅拌；然后，迅速将反应溶液转移到模具中，室温静置，观察其能否形成水凝胶。

对比例1、对比例2和对比例3的结果均是不能形成凝胶。

实施例1

1.配制20％重组胶原蛋白溶液，称取8g重组胶原蛋白粉末，加蒸馏水32g搅拌溶解，待用；配制浓度20％碳二亚胺溶液，称取1g碳二亚胺粉末，加蒸馏水4g溶解；

2.量取10g重组胶原蛋白溶液，调整pH至5.0，加入1.9g蒸馏水，充分搅拌；在不断搅拌情况下，逐滴加入0.6g碳二亚胺溶液，使重组胶原的浓度为16％，交联度为6％；反应1分钟后，停止搅拌；然后，迅速将反应溶液转移到模具中，室温静置，待其形成水凝胶；

3.把凝胶切成形状大小为1x1x0.6cm立方块，按照凝胶重量(g)：透析液体积(ml)＝1:20比例加入清洗液，搅拌透析；具体方式是先用蒸馏水清洗2次，2h/次；再用0.9％氯化钠溶液清洗2次，2h/次；转速均为3000rpm。

4.将透析后凝胶转移干燥箱中，温度40℃，时间2h，除去透析时凝胶吸收的多余水分；

5.二步法制备凝胶微粒：第一步，用分散机把凝胶块打碎成小颗粒，同时补加一定量生理盐水、PBS或其他平衡溶液，转速3000rpm，共5次；第二步，用均质机进一步把小颗粒粉碎成细小微粒，转速9000rpm，共8次；直至可通过注射针头挤出；

6.对细小微粒进行离心，弃去上清，得到凝胶微粒半成品；通过重量计算，凝胶微粒中重组胶原蛋白含量为8.89％。

7.最后，对凝胶微粒进行灭菌，灌装，即得成品。

实施例2

1.配制20％重组胶原蛋白溶液，称取8g重组胶原蛋白粉末，加蒸馏水32g搅拌溶解，待用；配制浓度20％碳二亚胺溶液，称取1g碳二亚胺粉末，加蒸馏水4g溶解；

2.量取10g重组胶原蛋白溶液，调整pH至5.19，加入1.265g蒸馏水，充分搅拌；在不断搅拌情况下，逐滴加入0.5g碳二亚胺溶液，使重组胶原的浓度为17％，交联度为5％；反应1分钟后，停止搅拌；然后，迅速将反应溶液转移到模具中，室温静置，待其形成水凝胶；

3.把凝胶切成形状大小为1x1x0.6cm立方块，按照凝胶重量(g)：透析液体积(ml)＝1:20比例加入清洗液，搅拌透析；具体方式是先用蒸馏水清洗2次，2h/次；再用0.9％氯化钠溶液清洗2次，2h/次；转速均为3000rpm。

4.将透析后凝胶转移干燥箱中，温度40℃，时间2h，除去透析时凝胶吸收的多余水分；

5.二步法制备凝胶微粒：第一步，用分散机把凝胶块打碎成小颗粒，同时补加一定量生理盐水、PBS或其他平衡溶液，转速2500rpm，共4次；第二步，用均质机进一步把小颗粒粉碎成细小微粒，转速9000rpm，共7次；直至可通过注射针头挤出；

6.对细小微粒进行离心，弃去上清，得到凝胶微粒半成品；通过重量计算，凝胶微粒中重组胶原含量为7％。

7.最后，对凝胶微粒进行灭菌，灌装，即得成品。

实施例3

1.配制20％重组胶原蛋白溶液，称取8g重组胶原蛋白粉末，加蒸馏水32g搅拌溶解，待用；配制浓度20％碳二亚胺溶液，称取1g碳二亚胺粉末，加蒸馏水4g溶解；

2.量取10g重组胶原蛋白溶液，调整pH至6.5，加入1.165g蒸馏水，充分搅拌；在不断搅拌情况下，逐滴加入0.6g碳二亚胺溶液，使重组胶原的浓度为17％，交联度为6％；反应45s后，停止搅拌；然后，迅速将反应溶液转移到模具中，室温静置，待其形成水凝胶；

3.把凝胶切成形状大小为1x1x0.6cm立方块，按照凝胶重量(g)：透析液体积(ml)＝1:20比例加入清洗液，搅拌透析；具体方式是先用蒸馏水清洗2次，2h/次；再用0.9％氯化钠溶液清洗2次，2h/次；转速均为3000rpm。

4.将透析后凝胶转移干燥箱中，温度40℃，时间2h，除去透析时凝胶吸收的多余水分；

5.二步法制备凝胶微粒：第一步，用分散机把凝胶块打碎成小颗粒，同时补加一定量生理盐水、PBS或其他平衡溶液，转速2500rpm，共4次；第二步，用均质机进一步把小颗粒粉碎成细小微粒，转速9000rpm，共7次；直至可通过注射针头挤出；

6.对细小微粒进行离心，弃去上清，得到凝胶微粒半成品；通过重量计算，凝胶微粒中重组胶原蛋白含量为6.7％。

7.最后，对凝胶微粒进行灭菌，灌装，即得成品。

表征实验

交联剂残留量测定按照药典中3206碳二亚胺残留量测定法的方法进行检测，具体是依据二甲基巴比妥酸与碳二亚胺反应形成紫红色络合物，采用紫外-可见分光光度法(通则0401)测定碳二亚胺含量；选择实施例1透析3次和4次时结果进行实验，结果见下表1。从表1可以看出，透析次数在4次以上时，EDC残留量能够满足≤10μmol/L的要求。

表1碳二亚胺残留量测定结构

透析次数	3次	4次
			吸光度	0.092	0.034
EDC残留量umol/L	21.5	7.0

重组胶原蛋白凝胶微粒的粒径通过显微镜拍照观察，随机选取6个视野进行拍照，通过标尺比对，可以看出凝胶微粒直径在20-1000μm；如图3所示。

渗透压结果通过冰点渗透压仪(德国罗泽(LOSER)OM819.C)测试得到，经测试，实施例1的渗透压范围是369mosm，接近人体渗透压。

Claims (8)

1.用于组织填充的重组胶原蛋白凝胶微粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在不断搅拌下，用氢氧化钠溶液调节重组胶原蛋白溶液pH至5~6.5，然后逐滴加入交联剂碳化二亚胺类溶液，继续搅拌反应30s~8min，停止搅拌后迅速将反应溶液转移到模具中，室温静置，得到交联度为4%~15%、重组胶原蛋白浓度为6%~18%的凝胶；所述的重组胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵所产生，所述的水溶性碳化二亚胺类为二环己基碳二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺或1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；

（2）将凝胶切成小块，搅拌透析除去交联剂，直至交联剂残留量≤10 μmol/L，干燥除去凝胶中吸收的多余水分，凝胶块的体积为0.5~5立方厘米；透析过程中采用的透析液为蒸馏水、纯化水或生理盐水；搅拌转速为200~500rpm，每次透析时间为1~2小时，透析次数为4~8次，透析液体积与凝胶块重量的比例为10~20:1，ml：g；

（3）二步法制备凝胶微粒：第一步，用分散机把凝胶块打碎成小颗粒，同时补加生理盐水或PBS；第二步，用均质机进一步把小颗粒粉碎成细小微粒，直至可通过注射针头挤出，所述的细小微粒的粒径为50~1000微米；

（4）对细小微粒进行离心，弃去上清，得到凝胶微粒半成品；

（5）对凝胶微粒进行灭菌，灌装，制得重组胶原蛋白凝胶微粒成品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，交联度为5%~10%。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，干燥温度为40~80℃。

4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，分散机转速为2000~5000rpm，分散次数为3~6次；均质机转速为6000~10000 rpm，均质次数为5~10次；注射针头规格为27G或30G。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，离心转速为1000~3000rpm，离心次数为1~5次，离心时间为5~10分钟/次。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，采用高温高压湿热灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为10~20分钟。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，凝胶微粒半成品中，重组胶原蛋白的含量为6%~9%。

8.根据权利要求1至7任一所述的制备方法制得的重组胶原蛋白凝胶微粒。

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