CN115873143B - 一种核-壳双层结构微球及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种核‑壳双层结构微球及其制备方法和应用。所述方法包括：先制备胶原蛋白微球，然后利用高碘酸钠氧化透明质酸，制备醛基化透明质酸，配制醛基化透明质酸水溶液，对胶原蛋白微球进行流化床喷雾包衣，得到核‑壳双层结构微球。本发明制备的核‑壳双层结构微球既有补水、填充功能，又有促进胶原再生的作用，使填充部位逐渐被自体组织替代，避免了以往产品降解后重复注射，从根本延缓衰老问题；且避免了注射后丁达尔现象的产生。

Description

一种核-壳双层结构微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种核-壳双层结构微球及其制备方法和应用。

背景技术

胶原蛋白是构成细胞外基质、结缔组织、韧带、肌腱、皮肤、骨和软组织重要组成部分。在机体内，胶原蛋白自发组装成有序的胶原纤维和胶原纤维束，进而形成宏观网络结构，是许多生物组织的结构框架。随着微纳米组装技术的快速发展，胶原蛋白在体外通过疏水相互作用、化学交联反应和空间结构优势互补等作用自组装形成高度有序的微观结构，制备的胶原蛋白自组装材料细胞黏附性高，具有优异的生物相容性。CN109224127A公开了一种天然组成的壳-核结构的自组装胶原刺激微球及其制备方法，利用多氨基的聚氧离子天然高分子与透明质酸间的静电作用，改变HA分子的构象，促进乳化体系中HA微球的形成。专利中并没有胶原蛋白自组装的纤维状高级结构，只是单纯的通过促沉淀制备微球。

透明质酸偏向于保持肌肤的水分和润滑度，适合缺水、角质层老化、干燥粗糙的皮肤，而胶原蛋白能有效地支撑皮肤，特别适合皮肤老化、皮肤下垂、受损等情况。皮肤的衰老过程，就是胶原蛋白流失的过程，及时补充胶原、促进胶原再生修复，才能从根本上延缓衰老。因此，同时利用好胶原蛋白和透明质酸，制备出既具有填充，又能再生的产品才更具有商业价值。目前，医美填充产品多以透明质酸为主，降解速度较快，需要不断重复注射来达到填充的目的。CN111840638A和CN111848991A分别制备了透明质酸微球和透明质酸微球与透明质酸凝胶混合填充剂用于面部填充，本质没有太大区别，功能比较单一，降解速度快，没有促胶原再生的功效。

丁达尔现象在透明质酸注射过量或者填充层次偏浅也时有发生，尤其在皮肤菲薄的部位，更容易发生丁达尔现象，外观呈浅蓝、紫色等色泽改变，影响容貌，多于注射后数日内出现，持续时间较长，直至透明质酸吸收，大大降低了患者的满意度。CN 113663126A以壳聚糖作为交联剂，交联活化处理后的透明质酸，虽然延长了透明质酸的降解时间，但是制备的微球仍呈透明状，无法避免产生丁达尔现象。

市场上常见的用于美容填充的在售产品，如：润百颜、瑞蓝、润致等，主要制备方式是透明质酸在碱性条件下与交联剂反应后形成凝胶，得到的凝胶块经机械粉碎或施压过筛网来获得不同粒径规格，这种方式制备的颗粒形态不规范，粒径不均一，用于面部填充容易引起红肿等副作用。

基于上述问题，市场上也陆续出现了透明质酸复合高分子聚合物微球制备的填充产品，CN114588310A以聚羟基脂肪酸酯复合透明质酸制备双层微球，外层透明质酸可补水，内层聚羟基脂肪酸酯起到填充的作用，虽然在一定程度上解决了部分问题，但是其原理上都是起到辅助功能，聚羟基脂肪酸酯材料本身无促胶原再生功能，没有从根本上延缓衰老问题。因此，制备一种功能齐全，再生效果好的注射填充材料是医美市场亟待解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术中的填充材料存在的不能促进胶原蛋白再生、易出现丁达尔现象、易产生副作用等缺陷，本发明提供一种核-壳双层微球及其制备方法和应用。本发明采用自组装的胶原蛋白微球为核芯结构，通过流化床包衣技术在外层包裹醛基化透明质酸，作为医美填充材料，既可达到了填充的目的，又可促进组织再生，且避免了注射后丁达尔现象的产生。

本发明首先提供一种醛基化透明质酸的制备方法，将高碘酸钠水溶液滴加到透明质酸水溶液中，在20℃-40℃下避光搅拌进行氧化反应3-6h，加入乙二醇终止反应,反应结束后，透析、冷冻干燥，得到醛基化透明质酸；

所述透明质酸水溶液中透明质酸的质量浓度为1wt％-5wt％，高碘酸钠水溶液的质量浓度为50-150mg/mL。

本发明的另一目的在于提供一种核-壳双层结构微球的制备方法，包括如下步骤：

(1)胶原蛋白微球的制备：

将胶原蛋白的醋酸水溶液与磷酸缓冲液混合均匀，静置，制备胶原蛋白的水凝胶，然后将胶原蛋白的水凝胶加入到含有表面活性剂的油相溶液中，进行乳化，再向乳化后的混合液中滴加鞣酸进行交联反应，反应完成后进行后处理，得到胶原蛋白微球；

本发明先将胶原蛋白自组装成水凝胶，以水凝胶为水相进一步制备的胶原蛋白微球呈多孔纤维状，具有三维网络状结构，高度有序的微观结构，使细胞黏附性高，更具有优异的生物相容性，通过自组装方式形成胶原蛋白纤维的机械性能、耐酶降解性、热稳定性等方面均存在很大的优越性。

(2)采用上述方法制备醛基化透明质酸：

(3)微球的制备：

配制醛基化透明质酸水溶液，对胶原蛋白微球进行流化床喷雾包衣，得到核-壳双层结构微球。

进一步地，步骤(1)中所述胶原蛋白的醋酸水溶液中胶原蛋白的质量体积浓度为1-20mg/mL，所述胶原蛋白的醋酸水溶液与所述磷酸盐缓冲液以体积比1:(2-5)进行混合。

进一步地，所述静置的条件为：调节pH＝5-7，35℃-45℃条件下，静置2-4h，然后室温放置过夜，得到胶原蛋白的水凝胶。

进一步地，步骤(1)中所述胶原蛋白的水凝胶和所述含有表面活性剂的油相溶液的重量比为1:(5-10)。

进一步地，所述含有表面活性剂的油相溶液中表面活性剂的质量浓度为0.5wt％-2wt％，所述含有表面活性剂的油相溶液中的溶剂选自液体石蜡、正己烷、植物油、甲苯和正辛烷中的一种或多种的混合液，所述表面活性剂为司班和/或吐温。

进一步地，步骤(1)中所述乳化的步骤为：在500-1000r/min的速度下搅拌0.5-1h；所述交联反应的时间为1-6h，所述鞣酸的用量为所述胶原蛋白重量的1wt％-10wt％。本发明将胶原蛋白与鞣酸进行交联，是胶原蛋白纤维进一步加固，其中交联反应是胶原蛋白与鞣酸两者之间的多点疏水键和氢键共同作用的结果，鞣酸分子以疏水形式进入胶原蛋白质的疏水袋，然后鞣酸的酚羟基与蛋白质的极性基(主要是肽基、羟基、羰基等)发生两点氢键结合。现有技术中胶原蛋白常用的交联剂多与氨基结合，影响后续胶原蛋白与透明质酸的结合，而本发明选用鞣酸做交联剂可以保留胶原蛋白上的氨基基团，用于与醛基化透明质酸结合。此外，鞣酸具有安全无毒、抗炎、抗菌、抗氧化、清除自由基等作用，并且对胶原酶活性有抑制作用，可以减少胶原蛋白酶解，同样起到延缓衰老的作用。

为了提高胶原蛋白与透明质酸之间的结合力，本发明采用将透明质酸在高碘酸钠的条件下发生氧化反应，得到醛基化透明质酸，可与胶原蛋白的氨基结合，在核与壳的界面上形成接枝层，增加两者之间的相容性和粘结力，使核-壳双层微球稳定性更好，壳层结构不易脱落，遇水后不易溶解，延长了透明质酸的降解时间，增加补水效果，同时提高了力学性能，使填充效果更好。

优选地，所述胶原蛋白的分子量为30万道尔顿，所述透明质酸的分子量为20-200万道尔顿。

进一步地，步骤(3)中所述流化床包衣的工艺参数为：所述胶原蛋白微球投料量：20g-100g；进风压力：0.05bar-0.3bar；床温：20℃-50℃；喷雾压力：0.1bar-2bar；喷液速度：0.1mL/min-5mL/min。

本发明的目的还在于提供一种所述的方法制备的核-壳双层结构微球，其中所述核-壳双层结构微球的粒径为20μm-100μm。本发明制备的核-壳双层结构微球呈球状，表面无棱角，粒径均匀，大大减少了填充面部副反应的发生；且微球本身为乳白色，注射填充后可有效的避免丁达尔现象的产生。

本发明的目的还在于提供一种所述的核-壳双层结构微球在医美填充材料中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明以自组装的胶原蛋白微球为核芯结构，通过流化床包衣技术在外层包裹醛基化透明质酸，外层透明质酸壳层结构发挥吸水特性，暂时短效性缓解肌肤症状；内层胶原蛋白微球，即刻补充胶原蛋白，长效促进自体胶原蛋白生成，达到修复的功效，且胶原蛋白在降解过程中可生成氨基酸，为细胞提供充足的营养物质。可见，本发明制备的核-壳双层结构微球既可达到填充的目的，又可促进再生，减少了患者反复注射的痛苦，根源化持续性抵御肌肤衰老。

(2)本发明选用鞣酸作为胶原蛋白的交联剂，可保留胶原蛋白的氨基基团；同时，将透明质酸醛基化，保证了胶原蛋白上的氨基与醛基化透明质酸进行核-壳接枝，增加了二者的粘接力，使核-壳结合更紧密，透明质酸壳层结构不易脱落，微球稳定性更好，从而填充效果更好。

(3)本发明制备的核-壳双层结构微球，同时具有补水、填充和促进再生的功能，并可解决临床上产生的丁达尔现象，具有多功能，多用途。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为本发明实施例1制备得到的胶原蛋白水凝胶的SEM图；

图2为本发明实施例1制备的胶原蛋白微球的显微镜图；

图3为本发明实施例1制备的胶原蛋白微球的SEM图，其中(a)为x160倍图，(b)为x950倍图；

图4为本发明实施例1制备的核-壳双层微球的结构示意图，其中COL为胶原蛋白，OHA为醛基化透明质酸；

图5为本发明实施例1制备的核-壳双层微球的显微镜图；

图6为透明质酸(HA)和本实施例步骤2制备的醛基透明质酸(OHA)的红外光谱图；

图7为组织切片观察结果图，其中(a)为空白组，(b)为阴性对照组，(c)为阳性对照组，(d)为供试组。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值不限制本发明的范围。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法应当被视为说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定；若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、或相关企业提出的标准要求进行。除非另有说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为重量百分比。

实施例1

步骤1、胶原蛋白微球的制备

1)将胶原蛋白溶解于0.1M醋酸水溶液中，8℃条件下搅拌溶解，得到胶原蛋白的醋酸水溶液，其中胶原蛋白的质量体积浓度为10mg/mL；

2)将胶原蛋白的醋酸水溶液与磷酸盐缓冲液以体积比1:3进行混合均匀，pH＝7.3，37℃条件下，静置2h，室温放置过夜，得到胶原蛋白水凝胶；

图1为本实施例制备得到的胶原蛋白水凝胶的SEM图，可以看出，自组装形成的胶原蛋白水凝胶呈现三维的网络纤维状，结构有序，且纤维的空隙结构有利用营养成分的流通，利用细胞生长。

3)将胶原蛋白水凝胶加入到含有表面活性剂的油相溶液中，胶原蛋白水凝胶和含有表面活性剂的油相溶液的重量比为1:8；

其中油相溶液中的油相溶剂为液体石蜡，表面活性剂为司班80，司班80重量为液体石蜡的1.5wt％；

4)将步骤3)得到的混合溶液在700r/min的速度下搅拌30min，充分乳化，乳化均匀后，滴加相对于胶原蛋白重量的3wt％的鞣酸搅拌，交联反应6h，得到胶原蛋白的微球溶液；

5)将步骤4)获得的微球溶液抽滤除去油相，依次用乙醇和清水清洗两遍后，离心去除上清液，冷冻干燥得胶原蛋白微球。

图2本实施例制备的胶原蛋白微球的显微镜图，图3为本实施例制备的胶原蛋白微球的SEM图，其中(a)为x160倍图，(b)为x950倍图，可以看出，胶原蛋白微球表面无棱角，有利于后续形成流化床包衣醛基化透明质酸，进而有利于形成球状的双层微球。

步骤2、醛基化透明质酸的制备

1)称取透明质酸溶于500mL水中，磁力搅拌器搅拌溶解，得到质量浓度为1wt％的透明质酸水溶液；

2)称取高碘酸钠3g，加入30mL水中溶解，逐滴加入到步骤1)得到的透明质酸水溶液中，35℃条件下避光搅拌，氧化反应4h，然后加入200mL乙二醇反应1h，以终止氧化反应；

3)透析袋透析除去多余高碘酸钠，每天换水两次，得到的产物冷冻干燥，即得醛基化透明质酸。

步骤3、微球的制备

称取醛基化透明质酸，加水溶解，得到质量浓度为0.3wt％的醛基化透明质酸水溶液，然后对胶原蛋白微球进行流化床喷雾包衣，每间隔10min进行取样，制备得到核-壳双层结构微球，粒径为20-100μm；

其中，所述流化床包衣的工艺参数为：胶原蛋白微球投料量：30g；进风压力：0.1bar；床温：40℃；喷雾压力：0.5bar；喷液速度：0.8mL/min。

图4为本实施例制备的核-壳双层微球的结构示意图，其中COL为胶原蛋白，OHA为醛基化透明质酸，核芯的胶原蛋白微球中含有纤维状的结构，外壳为醛基化透明质酸。图5为本实施例制备的核-壳双层微球的显微镜图，可以看出，核-壳双层结构微球呈球状，表面无棱角，粒径均匀，有利于减少填充面部副反应的发生。

采用KBr压片法，取少量透明质酸(HA)和本实施例步骤2制备的醛基透明质酸(OHA)于研钵中，加入KBr粉末，压片后，利用傅里叶变换红外光谱仪在波长400-4000cm^-1范围内对样品进行表征。表征结果如图6所示，可以看出，OH A与HA的红外光谱图相似，但是在1732cm^-1处出现新的特征峰，该特征峰对应于醛基中-C＝O的伸缩振动，具有OHA的特征，表明本发明方法可成功制备醛基透明质酸(OHA)。

实施例2

步骤1、胶原蛋白微球的制备

1)将胶原蛋白溶解于0.1M醋酸水溶液中，4℃条件下搅拌溶解，得到胶原蛋白的醋酸水溶液，其中胶原蛋白的质量体积浓度为15mg/mL；

2)将胶原蛋白的醋酸水溶液与磷酸盐缓冲液以体积比1:5进行混合均匀，pH＝7，37℃条件下，静置3h，室温放置过夜，得到胶原蛋白水凝胶；

胶原蛋白水凝胶的SEM测试与图1类似，自组装形成的胶原蛋白水凝胶呈现三维的网络纤维状。

3)将胶原蛋白水凝胶加入到含有表面活性剂的油相溶液中，胶原蛋白水凝胶和含有表面活性剂的油相溶液的重量比为1:10；

其中油相溶液中的油相溶剂为液体石蜡，表面活性剂为司班80，司班80重量为液体石蜡的2wt％；

4)将步骤3)得到的混合溶液在1000r/min的速度下搅拌50min，充分乳化，乳化均匀后，滴加相对于胶原蛋白重量的2wt％的鞣酸搅拌，交联反应5h，得到胶原蛋白的微球溶液；

5)将步骤4)获得的微球溶液抽滤除去油相，依次用乙醇和清水清洗两遍后，离心去除上清液，冷冻干燥得胶原蛋白微球。

本实施例制备的胶原蛋白微球的显微镜和SEM结果与图2类似，胶原蛋白微球成球状，表面无棱角，有利于后续形成流化床包衣醛基化透明质酸，进而有利于形成球状的双层微球。

步骤2、醛基化透明质酸的制备

1)称取透明质酸溶于500mL水中，磁力搅拌器搅拌溶解，得到质量浓度为2wt％的透明质酸水溶液；

2)称取高碘酸钠4g，加入40mL水中溶解，逐滴加入到步骤1)得到的透明质酸水溶液中，40℃条件下避光搅拌，氧化反应6h，然后加入300mL乙二醇反应1h，以终止氧化反应；

3)透析袋透析除去多余高碘酸钠，每天换水两次，得到的产物冷冻干燥，即得醛基化透明质酸。

步骤3、微球的制备

称取醛基化透明质酸，加水溶解，得到质量浓度为0.5wt％的醛基化透明质酸水溶液，然后对胶原蛋白微球进行流化床喷雾包衣，每间隔10min进行取样，制备得到核-壳双层结构微球，粒径为20-100μm；

其中，所述流化床包衣的工艺参数为：胶原蛋白微球投料量：50g；进风压力：0.15bar；床温：40℃；喷雾压力：0.9bar；喷液速度：1mL/min。

本实施例制备的核-壳双层微球的结构示意图如图4所示，显微镜观察结果与图5类似，核-壳双层结构微球呈球状，表面无棱角，粒径均匀，有利于减少填充面部副反应的发生。

对比例1

本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于：

省略步骤2的醛基化透明质酸的制备，且步骤3中以透明质酸替代醛基化透明质酸对胶原蛋白微球进行流化床包衣，制得核-壳双层结构微球，粒径为20-100μm。

对比例2

本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于：

步骤1第4)步中以戊二醛替代鞣酸；

其他步骤均相同。

试验例1：机械性能测试

以实施例1-2和对比例1-2制备的核-壳双层结构微球进行粒径、溶胀度和粘弹性测试，测试方法如下：

1)粒径分析：采用激光粒度仪分析测定各实施例和对比例制备的核-壳双层结构微球的粒径分布，以空气为载体，采用干法测定模式。

2)溶胀度测定：将核-壳双层结构微球在80℃的温度下烘干至恒重，滴加水至充分膨胀后，分别测得烘干后质量m₁与遇水膨胀后质量m₂：

3)粘弹性：使用混合型流变仪进行双层微球的粘弹性测定，温度25℃，0.2％的应变进行震荡测试，以扫描频率为横坐标，记录1Hz位置对应的G’值及G”值。

上述性能测试的结果如表1所示：

表1

从表1可以看出，实施例1-2制备得到的双层微球的溶胀度高于对比例1-2，说明实施例1-2制备的双层微球的外层醛基化透明质酸与核芯的胶原蛋白结合紧密，充分发挥补水作用。G’及G”反应了微球的机械性能，实施例1-2制备的双层微球的G’大于300，G”小于40，表明微球具有较好的机械性能。对比例1的透明质酸没有醛基化，将未醛基化的透明质酸机械的喷涂在胶原蛋白微球的外层，不能与胶原蛋白紧密的结合；而对比例2中戊二醛结合胶原蛋白的氨基，发生交联，导致醛基化透明质酸无法与胶原蛋白微球的氨基结合，导致外层的醛基透明质酸遇水易脱落，两组对比例1得到的双层微球均达不到理想的机械性能。

试验例2

将实施例1-2制备的核-壳双层结构微球与空白对照组(空白培养基)进行如下细胞毒性检测：选用L929细胞，各组供试品加入含血清培养基，在37℃条件下浸提24h，浸提液加入细胞中培养24h，采用MTT法进行细胞毒性检测(n＝3)，检测结果如表2所示：

表2

从表2可以看出，与空白对照组相比，实施例1和2样品组细胞存活率分别为91.90％和90.39％，无潜在细胞毒性。

试验例3

皮内刺激实验：通过兔皮内注射法检测样品导致皮内刺激的潜在性。6只健康成年新西兰白兔，雌雄不限，体重2kg左右，两组实施例各3只。实验前24h在兔脊柱两侧各剪5cm×15cm区域的兔毛，避免皮肤损伤。将灭菌处理后的微球按照0.2g/mL的比例，加入生理盐水及植物油浸提72h，无致热源生理盐水和植物油作为空白对照。用75％乙醇清洁暴露皮肤，在每只兔脊柱左侧上面5个点皮内注射0.2mL 0.9％氯化钠注射液制备的浸提供试液。左侧下面5个点注射0.2mL0.9％氯化钠对照液。脊柱右侧上面5个点注射0.2mL植物油制备的浸提供试液，右侧下面5个点注射0.2mL植物油对照液。注射后24h、48h、72h，观察注射局部及其周围皮肤组织反应。按照16886.10-2017刺激与皮肤致敏试验记分标准评价试验样品的刺激与皮肤致敏性，其中表3为皮肤反应程度判定标准，表4为皮内刺激评价分值表。

表3皮肤反应程度判定标准

表4皮内刺激评价分值表

可以看出，两组实施例样品及对照试验兔24h，48h，72h皮肤均未出现水肿，在(72±2)h评分后，分别将每只动物试验样品或空白对照的(24±2)h，(48±2)h和(72±2)h的全部红斑与水肿记分相加，再除以15(记分时间点数×试验样品或空白对照注射点数)，计算出每只动物试验样品或空白对照的记分。3只动物记分相加后除以3得出每一试验样品和相应空白对照的总平均记分。试验样品记分减去空白对照记分可得出试验样品最终记分。试验品最终记分不大于1.0，符合要求。

试验例4

体外降解试验检测：各称取实施例1-2和对比例1-2制备得到的双层微球0.5g置于9个离心管中，分别加入5mL的PBS溶液，将离心管置于37℃培养箱中，每个时间点取出3个样品进行称重，并计算平均重量，每三天更换PBS。降解率计算如下：

式中：Wa为充分溶胀后微球初始质量，Wb为不同时间点测得微球的质量。

表5降解率检测结果

组别	降解1个月质量损耗％	降解3个月质量损耗％	降解6个月质量损耗％
				对比例1	21.35	43.32	70.14
对比例2	20.07	39.15	78.95
				实施例1	10.78	26.87	62.46
实施例2	11.97	28.99	64.95

可以看出，对比例1和2制备的微球1个月后显示降解严重，说明壳层与内核结合不紧密，透明质酸遇水溶解；实施例1和2的双层微球的稳定效果较好，6个月后，仍具有填充效果，整体具有较长的降解周期。

试验例5

有效实验：由环境因素引起的皮肤老化，以紫外线的作用最大，又称为光老化。构成光老化主要为长波紫外线(UVA)和中波紫外线(UVB)，光老化皮肤中，成熟胶原纤维数量减少。

取40只SD大鼠，随机分成4组：1)空白组，皮下注射生理盐水，不做紫外照射处理；2)阴性对照组：皮下注射生理盐水，UVA+UVB照射；3)阳性对照组：皮下注射Vc，UVA+UVB照射；4)供试组：皮下注射生理盐水中分散的双层微球(实施例1制备)，UVA+UVB照射；诱导条件为20J/cm²UVA+40J/mlcm²UVB。

各组大鼠饲养3天后，背部脱毛，露出4×4cm²的皮肤，选取上、下、左、右四个注射点，按照如上分组每日进行注射，各点注射体积为0.1mL，阳性组浓度为25μg/mL，供试组为50μg/mL。老鼠饲养3个月后处死老鼠，取下皮肤，甲醛固定，做组织切片，观察结果，如图7所示，其中(a)为空白组，(b)为阴性对照组，(c)为阳性对照组，(d)为供试组。

由图7可以看出：1)与空白组相比，阴性组的胶原纤维明显减少，说明造模成功。2)与阴性对照组相比，供试组的双层微球组纤维含量有显著提升，与阳性对照组基本相似，说明本发明制备的核-壳双层结构微球对胶原蛋白纤维的再生有明显的促进作用。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要如权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (9)

1.一种核-壳双层结构微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)胶原蛋白微球的制备：

将胶原蛋白的醋酸水溶液与磷酸缓冲液混合均匀，静置，制备胶原蛋白的水凝胶，然后将胶原蛋白的水凝胶加入到含有表面活性剂的油相溶液中，进行乳化，再向乳化后的混合液中滴加鞣酸进行交联反应，反应完成后进行后处理，得到胶原蛋白微球；所述胶原蛋白的醋酸水溶液中胶原蛋白的质量体积浓度为1-20mg/mL，所述胶原蛋白的醋酸水溶液与所述磷酸盐缓冲液以体积比1:(2-5)进行混合；

(2)制备醛基化透明质酸：将高碘酸钠水溶液滴加到透明质酸水溶液中，在20℃-40℃下避光搅拌进行氧化反应3-6h，加入乙二醇终止反应,反应结束后，透析、冷冻干燥，得到醛基化透明质酸；所述透明质酸水溶液中透明质酸的质量浓度为1wt％-5wt％，高碘酸钠水溶液的质量浓度为50-150mg/mL；

(3)微球的制备：

配制醛基化透明质酸水溶液，对胶原蛋白微球进行流化床喷雾包衣，得到核-壳双层结构微球。

2.根据权利要求1所述的一种核-壳双层结构微球的制备方法，其特征在于，所述静置的条件为：调节pH＝5-7，35℃-45℃条件下，静置2-4h，然后室温放置过夜，得到胶原蛋白的水凝胶。

3.根据权利要求1所述的一种核-壳双层结构微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述胶原蛋白的水凝胶和所述含有表面活性剂的油相溶液的重量比为1:(5-10)。

4.根据权利要求3所述的一种核-壳双层结构微球的制备方法，其特征在于，所述含有表面活性剂的油相溶液中表面活性剂的质量浓度为0.5wt％-2wt％，所述含有表面活性剂的油相溶液中的溶剂选自液体石蜡、正己烷、植物油、甲苯和正辛烷中的一种或多种的混合液，所述表面活性剂为司班和/或吐温。

5.根据权利要求1所述的一种核-壳双层结构微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述乳化的步骤为：在500-1000r/min的速度下搅拌0.5-1h；所述交联反应的时间为1-6h，所述鞣酸的用量为所述胶原蛋白重量的1wt％-10wt％。

6.根据权利要求1所述的一种核-壳双层结构微球的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白的分子量为30万道尔顿，所述透明质酸的分子量为20-200万道尔顿。

7.根据权利要求1所述的一种核-壳双层结构微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述流化床包衣的工艺参数为：所述胶原蛋白微球投料量：20g-100g；进风压力：0.05bar-0.3bar；床温：20℃-50℃；喷雾压力：0.1bar-2bar；喷液速度：0.1mL/min-5mL/min。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的方法制备的核-壳双层结构微球，其特征在于，所述核-壳双层结构微球的粒径为20μm-100μm。

9.一种权利要求8所述的核-壳双层结构微球在医美填充材料中的应用。