CN109010896B - 一种耐水增强型伤口愈合薄膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种耐水增强型伤口愈合薄膜及其制备方法，其中伤口愈合薄膜包括如下质量体积浓度的原料组分：超微蛋壳粉颗粒5～10mg/L；超微壳膜粉颗粒或壳膜可溶性蛋白50～500mg/L；溶菌酶5～30mg/L；壳聚糖5～10mg/L；甘油0.05～5mg/L；高分子多糖0.1～5mg/L。本发明还提供上述耐水增强型伤口愈合薄膜的制备方法。本发明整个制备原料均为无毒、良好生物相容性的材料；原料包括蛋壳、壳膜及其可溶性混合蛋白以及残留蛋清中的溶菌酶，能使蛋壳废弃物的各个成分达到物尽所用，制得的伤口愈合薄膜具有较好的耐水性、机械性能、抑菌性、蛋白吸收能力，且降解率低。本发明方法工艺简便、实用性强，生产成本极低，有利于资源循环利用，且能耗低。

Description

一种耐水增强型伤口愈合薄膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种耐水增强型伤口愈合薄膜及其制备方法，尤其涉及一种以高分子聚合物、壳聚糖、蛋壳膜为原料制备的耐水增强型伤口愈合薄膜及其制备方法。
背景技术
中国作为最重要的禽蛋食用及加工的国家，连续二十余年人均占有量位居世界第一。为满足消费者对禽蛋产品多层次的需求，许多大型的蛋制品加工企业蓬勃发展起来。但目前这些企业主要是采用初级或深加工技术，将禽蛋内容物(蛋清和蛋黄)制成蛋液或蛋粉等产品，对蛋壳和蛋壳膜的利用却相对较少，绝大多数的蛋壳资源也只是被当做废弃物处理掉，从而造成了大量的资源浪费，出于环保和资源再利用的角度，国内外学者对蛋壳进行了许多研究。
实际上，废弃的蛋壳(残留蛋清的废弃蛋壳)有多种功能活性成分，例如蛋壳中含有丰富的碳酸钙，是一种良好的矿化产物。蛋壳膜俗称＂凤凰衣＂，位于蛋清与蛋壳之间，由2μm的纤维组成，呈网状结构，其网孔直径平均为4μm，厚度大部分在65-69μm之间。蛋壳膜含有90％的高分子蛋白质，主要以糖蛋白的形式存在，主要包括胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、溶解酵素、唾液酸糖蛋白、透明质酸、卵清蛋白、硫酸软骨素、唾液酸骨桥蛋白(OPN)等，另外蛋壳膜中还含有约3％的脂质体及2％的糖类。由于蛋壳膜有天然的生物活性基质结构，因此蛋壳膜是一种天然的生物材料。目前对于蛋壳膜的利用主要以壳膜颗粒和可溶性壳膜蛋白两种形式。蛋壳膜本身对微生物生长具有一定的抑制作用，在400多年前，中国就将壳膜用在伤口的治疗中，这一现象也早已记录在药典之中。在日本，目前相扑运动员仍然用壳膜来治愈伤口。
在打蛋过程中，部分蛋清会残留在壳膜的内表面，在实际应用或回收利用过程中，我们常将残留的蛋清洗掉，实际上残留蛋清中含有多种活性蛋白质，如溶菌酶、转铁蛋白等。如能将其经过简单处理就能加以利用，对提高禽蛋综合利用价值有重要的现实意义。由于废弃物蛋壳具有很多生物功能活性，所以以壳膜为研究对象制备相应的生物功能材料成为当前国内外的一个热门课题。
壳聚糖是一种具有良好生物相容性、成膜性、无毒、可止血、抑菌等特性的大分子聚合物。在皮肤组织工程中，因壳聚糖具有与人类细胞基质中糖蛋白(GAG)的相似的成分物质，所以壳聚糖常常被制备成促进伤口愈合及细胞增殖的生物材料。由于壳聚糖具有以上的物理及化学特性，壳聚糖被制备成多种形式的生物功能材料，例如止血海绵、伤口愈合薄膜、伤口愈合水凝胶等。
伤口的愈合是一个复杂的过程。在伤口愈合的过程中，我们往往通过避免伤口遭到外界微生物的侵染、吸收过多的伤口渗出液或止血等途径来加快伤口愈合的进程。目前良好的伤口愈合的敷料应该具有抑菌或止血等特点。除此之外，伤口愈合的敷料还应具有良好的强度、耐水性以及机械性能。
目前国内外公开发表的有关蛋壳或蛋壳膜回收利用的研究文献不少，例如，专利号为CN103898016A的文献涉及一种利用蛋壳发酵乳酸菌的方法。专利号为CN107871614A的文献利用蛋壳膜制备的染料敏化太阳能电池的方法。专利号CN105919909A的文献利用蛋壳膜制备水溶性的抗氧化保健品。上述专利或专利申请成功提高了废弃物的附加值，但这些专利主要是分别去研究蛋壳废弃物中一种(蛋壳或蛋壳膜)进行利用，忽略了蛋壳废弃物的整理综合利用，且大多数的专利或专利申请从未将残留在蛋膜表面的蛋清进行综合利用，这些研究都未更大程度的提高蛋壳废弃物的回收利用率。
以高分子聚合物壳聚糖制备愈合伤口敷料研究文献不少，专利号为CN106215232的文献涉及其将丝素蛋白原料、生物活性玻璃原料、壳聚糖原料和聚乙烯醇原料按照一定的比例共混冷冻干燥成愈合伤口的膏状物。专利号为CN107281268A的文献涉及其将多种无毒原料壳聚糖、细辛、没药、白芷、天花粉、椿白皮、血余炭、五灵脂、薄荷、南瓜子和乳香等原料共混干燥成促进伤口愈合的壳聚糖温敏凝胶颗粒。专利号为CN107080856A的文献涉及其采用物理交联的方法将细菌纤维素、壳聚糖、锂藻土复合形成三维纳米纤维网络,制备伤口愈合的薄膜。专利号为CN107080856A的文献涉及其将糖基化壳聚糖与芦荟提取物按照一定的比例进行共混成可涂抹于伤口上液体的敷料。上述专利或专利申请多以壳聚糖为研究对象，证明了以壳聚糖为基准物制备伤口愈合敷料的可行性，但由于壳聚糖薄膜具有很弱的机械性能，在水中往往易融化降解，具有很弱的耐水性，从而限制以单一壳聚糖来制备伤口愈合的敷料。从上述专利或专利申请或者通过将壳聚糖进行纤维化或者与其他多种原料共混的方式来弥补壳聚糖的缺陷，该种敷料的制备方法或者过于复杂、原料对象多样化，或应用的技术限制了其在工业或生活上的大面积推广。
膜在制备过程中常常需要加入某些交联剂进行交联，以此提高膜的机械性能。但目前常用到的一些交联剂(如戊二醛)会产生一定的毒性作用，从而限制了膜在生物工程等领域中的使用。氯化钙作为一种天然无毒的物理交联剂，显然已经成为制备膜或凝胶的新型交联剂。专利号为CN105457094A的文献涉及将氯化钙作为交联剂制备海藻酸钠纳米纤维支架材料的方法。专利号为CN107619487A的文献涉及将氯化钙作为交联剂制备海藻酸钠电驱动膜的方法。专利号为CN106832687A的文献涉及一种空心碳酸钙交联低成本轻质电缆料的制备方法。上述专利或专利申请多以氯化钙为交联剂，证明了氯化钙交联壳聚糖膜的可行性。
此外，专利号CN107106733A公开一种愈合伤口的微粉化壳膜粉颗粒，其仅仅公开微粉化壳膜粉颗粒具有愈合伤口的作用，但却未涉及该壳膜粉应以何种形式敷在伤口处来预防伤口的二次伤害。目前也未发现以禽蛋壳膜可溶性蛋白为原料制备伤口愈合材料的专利申请。与此同时，虽然专利号CN1107043798A公开一种蛋壳回收利用的方法，其将蛋壳膜以及蛋壳在未完全分离的情况下分别利用蛋壳或壳膜提取其生物活性成分，该发明具有较好的创新性，但对于蛋壳膜和蛋壳的功能活性的利用却未提出。
本发明拟提供一种以高分子聚合物、禽蛋壳膜与壳聚糖为原料制备耐水增强型伤口愈合薄膜的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种耐水增强型伤口愈合薄膜及其制备方法，该耐水增强型伤口愈合薄膜是以高分子聚合物、禽蛋壳膜与壳聚糖为原料制得。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
首先，提供一种耐水增强型伤口愈合薄膜，所述伤口愈合薄膜包括如下质量体积浓度的原料组分：
超微蛋壳粉颗粒 5～10mg/L；
超微壳膜粉颗粒或壳膜可溶性蛋白 50～500mg/L；
溶菌酶 5～30mg/L；
壳聚糖 5～10mg/L；
甘油 0.05～5mg/L；
高分子多糖 0.1～5mg/L。
进一步地，所述超微蛋壳粉颗粒为鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋或鹅蛋其中一种来源的超微蛋壳粉颗粒。
进一步地，所述超微壳膜粉颗粒或壳膜可溶性蛋白为鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋或鹅蛋其中一种来源的超微壳膜粉颗粒或壳膜可溶性蛋白。
进一步地，所述超微蛋壳粉颗粒的粒径范围为10～1000nm。
进一步地，所述超微壳膜粉颗粒的粒径范围为10～1000nm。
本发明还提供上述耐水增强型伤口愈合薄膜的制备方法，其是一种以超微蛋壳粉颗粒、超微壳膜粉颗粒或壳膜可溶性蛋白、残留的蛋清中提取的溶菌酶以及壳聚糖为原料制备耐水增强型伤口愈合薄膜的方法，各原料组分的质量体积浓度如下：
超微蛋壳粉颗粒 5～10mg/L；
超微壳膜粉颗粒或壳膜可溶性蛋白 50～500mg/L；
溶菌酶 5～30mg/L；
壳聚糖 5～10mg/L；
甘油 0.05～5mg/L；
高分子多糖 0.1～5mg/L。
进一步地，上述方法包括如下步骤：
(1)取新鲜禽蛋，表面洗净，去除内容物，得到部分蛋清残留的带膜蛋壳；
(2)将蛋清残留的蛋壳用去离子水清洗，分别收集带膜的蛋壳以及含有蛋清的水溶液；
(3)将步骤(2)收集的含有蛋清的水溶液用酸或碱调节pH值至6～12，然后采用树脂吸附法提取得到溶菌酶；
(4)将步骤(2)收集的带膜的蛋壳烘干，然后用粉碎机初步粉碎后，将其浸泡在去离子水中，搅拌、机械分离蛋壳和蛋壳膜，根据密度的不同，分别收集蛋壳与蛋壳膜，最后将蛋壳和蛋壳膜分别超微粉碎成超微粉末颗粒，得到超微蛋壳粉颗粒、超微壳膜粉颗粒；
(5)以巯基丙酸、巯基乙酸和乙酸中任意一种为溶剂提取超微壳膜粉颗粒中的可溶性混合蛋白，冻干，制备壳膜可溶性蛋白粉末；
(6)将步骤(3)中的溶菌酶与1～5mg/L的壳聚糖乙酸溶液，按照每1L壳聚糖乙酸溶液中加入5mg～30mg溶菌酶的比例，搅拌均匀得到溶菌酶和壳聚糖的共混液一；
(7)将步骤(4)中的超微蛋壳粉颗粒与步骤(6)中的共混液一，按照每1L共混液一中加入5mg～10mg超微蛋壳粉的比例，搅拌共混，得到壳粉、溶菌酶和壳聚糖的共混液二；
(8)将步骤(4)制得的超微壳膜粉颗粒或步骤(5)制得的壳膜可溶性蛋白粉末，与步骤(7)中共混液二，按照每1L共混液二中加入50mg～500mg的超微壳膜粉颗粒，搅拌混合均匀得一级混合物；并加入一级混合物0.05％～5％体积百分比的甘油和0.1％～5％体积百分比的高分子多糖，搅拌混合均匀得混合溶液；
(9)取步骤(8)制得的混合溶液，在超声条件下使超微壳膜粉颗粒或壳膜可溶性蛋白粉末均匀分散于溶液中得悬浊液；
(10)在孔板中加入相当体积量的步骤(9)中的悬浊液，平铺，在25℃至50℃下干燥成膜，将膜从孔板上揭下来并干燥储存，即得。
进一步地，步骤(3)中调节pH的碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的一种。
进一步地，步骤(3)中所用的吸附树脂为D152阳离子交换树脂、FPC3500阳离子交换树脂、AB-8等阳离子交换树脂中的一种或几种混合，吸附树脂的添加量为0.1％～20％w/v。
进一步地，步骤(8)中高分子多糖为羧甲基纤维素、黄原胶、葡聚糖的一种或多种混合物。
进一步地，步骤(4)中在2000rpm/min～6000rpm/min搅拌2-4h机械分离蛋壳和蛋壳膜。
进一步地，步骤(6)在磁力搅拌器中搅拌6～15h得共混液一。
进一步地，步骤(7)中在2000～5000rpm/min转速条件下搅拌1～5h得共混液二。
进一步地，步骤(9)中超声方式为连续超声或间歇超声中的一种，超声强度为100W～400W，超声时间为30min～60min。
本发明的有益效果：
1、本发明能将残留在壳膜中的蛋清综合利用到蛋壳的回收利用中，增加蛋壳的回收率；而且将残留在壳膜上的蛋清与蛋壳综合利用起来，能较大程度的提高壳膜废弃物的附加值。
2、本发明还能较好地克服以壳聚糖为愈合伤口敷料薄膜的缺陷：现有技术采用壳聚糖作为伤口愈合敷料的制备过程中常常加入较多的其他生物活性物质或应用其他交联剂将壳聚糖膜进行交联，以增加壳聚糖的耐水性，但这就会造成工艺的繁琐，成本增加，且交联剂具有一定的毒性作用。本发明创造性地将废弃物蛋壳粉颗粒加入到高分子聚合物的混合溶液中，在酸性条件下(壳聚糖乙酸溶液)，形成的钙离子可作为天然无毒的交联剂，利用蛋壳中钙离子的物理交联特性，克服壳聚糖膜耐水性差的缺陷，既增强复合膜在水中的耐水性、机械性能，又可增强复合降解速率，成功地解决这一技术缺陷。
与现有技术相比，本发明整个制备原料均为无毒、良好生物相容性的材料。
4、本发明能实现多种高分子聚合物的组合，包括壳膜及其可溶性混合蛋白(抗氧化和抑菌性)、溶菌酶(抑菌性)和壳聚糖(成膜性、生物相容性以及抑菌性)等，成功制备一种耐水增强型的具有愈合伤口功能的薄膜。实现多种高分子聚合物的组合，包括壳膜及其可溶性混合蛋白、溶菌酶和壳聚糖，使蛋壳废弃物的各个成分达到物尽所用。
5、本发明以高分子聚合物、禽蛋壳膜与壳聚糖为组合原料制备的伤口愈合薄膜，与纯壳聚糖为原料制备的薄膜相比，具有如下优势：
1)具有一定的耐水性，机械性能：在伤口模拟液(生理盐水)中浸泡1～3天后，仍然能具有完整的表观形态。
2)具有良好的物理表观特性：具有很好的柔韧性、耐折叠能力以及透明度。
3)具有良好的和蛋白吸收能力：牛血清蛋白的吸收率为60mg/g～80mg/g，显著高于纯壳聚糖的吸收率40mg/g。
4)能大大降低敷料的降解速率，缩短了该敷料的愈合伤口的时间。
5)可为伤口快速愈合提供适宜pH，创造伤口愈合的微环境。
6)能显著的抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，通过抑制微生物的生长，该敷料可有效阻止微生物侵染伤口，提高伤口愈合的速度。
综上，本发明提供的制备方法不仅制得的伤口愈合薄膜性能优越，且工艺简便、实用性强，生产成本极低，有利于资源循环利用，能耗低，而且整个制备过程都没有毒害或腐蚀性物质的涉入，对环境无污染，可大大提高禽蛋加工副产物的附加值，产生明显的经济效益和社会效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本发明耐水增强型伤口愈合薄膜的制备工艺流程图；
图2a是对比例纯壳聚糖膜样品D1样品浸泡在伤口模拟液24h后的外观形态图；
图2b是本发明耐水增强型伤口愈合薄膜S3样品浸泡在伤口模拟液24h后的外观形态图；
图3-1a、3-1b分别是纯壳聚糖膜D1样品、本发明耐水增强型伤口愈合薄膜S3样品浸泡在生理盐水1天后的外观形态图；
图3-2a、3-2b分别是纯壳聚糖膜D1样品、本发明耐水增强型伤口愈合薄膜S3样品浸泡在生理盐水2天后的外观形态图；
图3-3a、3-3b分别是纯壳聚糖膜D1样品、本发明耐水增强型伤口愈合薄膜S3样品浸泡在生理盐水3天后的外观形态图；
图4是纯壳聚糖膜D1、本发明耐水增强型伤口愈合薄膜S1～S4样品的降解率随时间的变化曲线图；
图5是纯壳聚糖膜D1、本发明耐水增强型伤口愈合薄膜S1～S4样品的牛血清蛋白吸收率；
图6是纯壳聚糖膜D1、本发明耐水增强型伤口愈合薄膜S1～S4样品愈合伤口薄膜微环境pH；
图7是纯壳聚糖膜D1、本发明耐水增强型伤口愈合薄膜S1～S4样品抑制大肠杆菌生长情况；
图8是纯壳聚糖膜D1、本发明耐水增强型伤口愈合薄膜S1～S4样品抑制大肠杆菌生长情况抑制金黄色葡萄球菌生长情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
参照图1所示流程，本实施例提供一种以高分子聚合物、禽蛋壳膜与壳聚糖为组合原料备耐水增强型伤口愈合薄膜的方法，具体包括如下步骤：
(1)取新鲜鸡蛋，表面洗净，去除内容物，得到部分蛋清残留的带膜蛋壳。
(2)将蛋清残留的蛋壳按照质量/体积比1mg：2ml放去离子水中清洗，分别收集带膜的蛋壳以及含有蛋清的水溶液。
(3)用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6，向步骤(2)收集的含有蛋清的水溶液中添加的0.1％的D152型阳离子交换树脂吸附提取溶菌酶。
(4)将步骤(2)收集的带膜的蛋壳烘干然后用粉碎机初步粉碎后，将其浸泡在去离子水中，在转速2000rpm/min条件下机械搅拌2h，静置15分钟，蛋壳膜悬浮在水相中，蛋壳由于密度大沉在烧杯底部，按照此原理，分别收集蛋壳与蛋壳膜，在50℃下干燥24h，待干燥完后，用球磨机分别将蛋壳和蛋壳膜球磨成相同孔径的100nm的超微粉末颗粒，得到超微蛋壳粉颗粒、超微壳膜粉颗粒；
(5)以乙酸为溶剂提取蛋壳膜中可溶性混合蛋白，冻干，制备壳膜可溶性蛋白粉末。
(6)将步骤(3)中的溶菌酶与1mg/L质量体积浓度的壳聚糖乙酸溶液按照质量/体积比为5mg：1L在磁力搅拌器中搅拌10h，静置一段时间，消泡，得到溶菌酶和壳聚糖的共混液一。
(7)将步骤(4)中的超微蛋壳粉颗粒与步骤(6)中的共混液一按质量/体积比为5mg：1L在2000rpm/min的转速条件下搅拌4h，共混，得到壳膜粉、溶菌酶和壳聚糖的共混液二。
(8)将步骤(4)中的超微壳膜粉颗粒或步骤(5)中的壳膜可溶性蛋白粉末与步骤(7)中共混液二按质量/体积比为50mg:1L共混，得一级混合物，并加入一级混合物体积百分比1％的甘油和一级混合液体积百分比2％的羧甲基纤维素，在3500rpm/min磁力搅拌下搅拌2h，混合均匀，得混合液；
(9)取50mL的步骤(8)中的混合液，在100W的超声强度下连续超声60min，使粉末均匀分散于溶液里，得悬浊液；
(10)在12孔板中加入0.75mL的体积量的步骤(9)中的悬浊液，平铺，在37℃下干燥成膜，将膜小心揭下来，储存在干燥器，记为样品S1。
实施例2
参照图1所示流程，本实施例提供的以高分子聚合物、禽蛋壳膜与壳聚糖为组合原料备耐水增强型伤口愈合薄膜的方法，具体包括如下步骤：
(1)取新鲜鸡蛋，表面洗净，去除内容物，得到部分蛋清残留的带膜蛋壳。
(2)将蛋清残留的蛋壳按照质量/体积比1mg：5L放去离子水中清洗，分别收集带膜的蛋壳以及含有蛋清的水溶液。
(3)加1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8，向步骤(2)收集的含有蛋清的水溶液中添加的3％D152型阳离子交换树脂吸附提取溶菌酶。
(4)将步骤(2)收集的带膜的蛋壳烘干然后用粉碎机初步粉碎后，将其浸泡在去离子水中，在6000rpm/min条件下机械搅拌4h，静置15分钟，根据蛋壳膜悬浮在水相中，蛋壳由于密度大沉在烧杯底部的原理，分别收集蛋壳与蛋壳膜，在50℃下干燥24h，待干燥完后，用球磨机分别将蛋壳和蛋壳膜球磨成相同孔径的100nm的超微粉末颗粒，得到超微蛋壳粉颗粒、超微壳膜粉颗粒；
(5)以巯基丙酸为溶剂提取蛋壳膜中可溶性混合蛋白，冻干，制备壳膜可溶性蛋白粉末。
(6)将步骤(3)中的溶菌酶与1mg/L质量体积浓度的壳聚糖乙酸溶液按照质量/体积比为10mg:1L在磁力搅拌器中搅拌10h，静置一段时间，消泡，得到溶菌酶和壳聚糖的共混液一。
(7)将步骤(4)中的超微蛋壳粉颗粒与步骤(6)中的共混液一按质量/体积比为7mg:1L在3500rpm/min的转速条件下搅拌2h，共混，得到壳膜粉、溶菌酶和壳聚糖的共混液二。
(8)将步骤(4)中超微壳膜粉颗粒或步骤(5)中的壳膜可溶性蛋白粉末与步骤(7)中共混液二按质量/体积比为200mg:1L共混，得一级混合物，并加入一级混合物体积百分比2％的甘油和体积百分比2％的黄原胶，在3500rpm/min磁力搅拌下搅拌2h，混合均匀得混合液；
(9)取50mL的步骤(8)中的混合液，在200W的超声强度下连续超声45min，使粉末均匀分散于溶液里，得悬浊液；
(10)在12孔板中加入0.75mL的体积量的步骤(9)中的悬浊液，平铺，在37℃下干燥成膜，将膜小心揭下来，储存在干燥器，记为样品S2。
实施例3
参照图1所示流程，本实施例提供的耐水增强型伤口愈合薄膜的方法，具体包括如下步骤：
(1)取新鲜鸡蛋，表面洗净，去除内容物，得到部分蛋清残留的带膜蛋壳。
(2)将蛋清残留的蛋壳按照质量/体积比1mg：5L放去离子水中清洗，分别收集带膜的蛋壳以及含蛋清的水溶液。
(3)加1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至9，向步骤(2)收集的含蛋清的水溶液中添加10％D152阳离子交换树脂吸附提取溶菌酶。
(4)将步骤(2)收集的带膜的蛋壳烘干然后用粉碎机初步粉碎后，将其浸泡在去离子水中，在4000rpm/min条件下机械搅拌3h，静置15分钟，根据蛋壳膜悬浮在水相中，蛋壳由于密度大沉在烧杯底部的原理，分别收集蛋壳与蛋壳膜，在50℃下干燥24h，待干燥完后，用球磨机分别将蛋壳和蛋壳膜球磨成相同孔径的10nm的超微粉末颗粒，得到超微蛋壳粉颗粒、超微壳膜粉颗粒；
(5)以巯基乙酸为溶剂提取蛋壳膜中可溶性混合蛋白，冻干，制备壳膜可溶性蛋白粉末。
(6)将步骤(3)中的溶菌酶与3mg/L质量体积浓度的壳聚糖乙酸溶液按照质量/体积比为15mg:1L在磁力搅拌器中搅拌10h，静置一段时间，消泡，得到溶菌酶和壳聚糖的共混液一。
(7)将步骤(4)中的超微蛋壳粉颗粒与步骤(6)中的共混液一按质量/体积比为5mg:1L在4000rpm/min的转速条件下搅拌2h，共混，得到壳膜粉、溶菌酶和壳聚糖的共混液二。
(8)将步骤(4)中的超微壳膜粉颗粒或步骤(5)中的壳膜可溶性蛋白粉末与步骤(7)中共混液二按质量/体积比为500mg:1L共混，得到一级混合物，并加入一级混合物体积百分比0.05％的甘油和体积百分比0.1％的葡聚糖，在3500rpm/min磁力搅拌下搅拌2h，混合均匀，得混合液；
(9)取50mL的步骤(8)中的混合液，在300W的超声强度下连续超声30min，使粉末均匀分散于溶液里得悬浊液；
(10)在12孔板中加入0.75mL的体积量的步骤(9)中的悬浊液，平铺，在37℃下干燥成膜，将膜小心揭下来，储存在干燥器，记为样品S3。
实施例4
参照图1所示流程，本实施例提供的耐水增强型伤口愈合薄膜的方法，具体包括如下步骤：
(1)取新鲜鸡蛋，表面洗净，去除内容物，得到部分蛋清残留的带膜蛋壳。
(2)将蛋清残留的蛋壳按照质量/体积比1mg：10ml放去离子水中清洗，分别收集带膜的蛋壳以及含蛋清的水溶液。
(3)加1mol/L的氢氧化钾调节pH至12，向步骤(2)收集的含蛋清的水溶液中添加20％的FPC3500树脂吸附提取溶菌酶。
(4)将步骤(2)收集的带膜的蛋壳烘干然后用粉碎机初步粉碎后，将其浸泡在去离子水中，在3500rpm/min条件下机械搅拌4h，静置15分钟，蛋壳膜悬浮在水相中，蛋壳由于密度大沉在烧杯底部，按照此原理，分别收集蛋壳与蛋壳膜，在50℃下干燥24h，待干燥完后，用球磨机分别将蛋壳和蛋壳膜球磨成相同孔径的1000nm的超微粉末颗粒，得到超微蛋壳粉颗粒、超微壳膜粉颗粒；
(5)以巯基丙酸为溶剂提取蛋壳膜中可溶性混合蛋白，冻干，制备壳膜可溶性蛋白粉末。
(6)将步骤(3)中的溶菌酶与5mg/L质量体积浓度的壳聚糖乙酸溶液按照质量/体积比为10mg:1L在磁力搅拌器中搅拌10h，静置一段时间，消泡，得到溶菌酶和壳聚糖的共混液一。
(7)将步骤(4)中的超微蛋壳粉颗粒与步骤(6)中的共混液一按质量/体积比为10mg:1L在5000rpm/min的转速条件下搅拌2h，共混，得到壳膜粉、溶菌酶和壳聚糖的共混液二。
(6)将步骤(4)中的超微壳膜粉颗粒或步骤(5)中的壳膜可溶性蛋白粉末与步骤(7)中共混液二按质量/体积比为50mg:1L共混，得到一级混合物，并加入一级混合物体积百分比5％的甘油和体积百分比5％的羧甲基纤维素，在3500rpm/min磁力搅拌下搅拌2h，混合均匀，得混合液；
(9)取50mL的步骤(8)中的混合液，在400W的超声强度下连续超声30min，使粉末均匀分散于溶液里得悬浊液；
(10)在12孔板中加入0.75mL的体积量的步骤(9)中的悬浊液，平铺，在37℃下干燥成膜，将膜小心揭下来，储存在干燥器，记为样品S4。
对比例1
本对比例将单纯的壳聚糖为原料制备的薄膜作为对比例样品，具体包括如下步骤：
(1)将市面上买来的壳聚糖粉末按照1mg/L质量浓度(w/v)加入乙酸溶液中在磁力搅拌器中搅拌10h，静置一段时间，消泡，得到壳聚糖乙酸溶液的共混液一。
(2)向步骤(1)中的共混液一中加入共混液一体积百分比1％的甘油和共混液体积百分比2％的羧甲基纤维素，在3500rpm/min磁力搅拌下搅拌2h，混合均匀，得混合液。
(3)在12孔板中加入0.75mL的体积量的步骤(2)中的混合液，平铺，在37℃下干燥成膜，将膜小心揭下来，储存在干燥器，记为样品D1。
将上述实施例和对比例得到的伤口愈合薄膜S1～S4样品和纯壳聚糖膜D1样品的物理特性、PH、降解率、耐水性以及其抑制微生物的生长等性能进行如下实验比对：
(1)耐水性实验
取本发明S3样品与D1样品做如下实验：
a、将本发明S3样品和纯壳聚糖膜D1样品浸泡在伤口模拟液中，24h后观察样品的完整性；
b、将本发明S3样品和纯壳聚糖膜D1样品浸泡在生理盐水中1天、2天、3天后，观察样品的完整性。
如图2a、2b所示，从感官上来看，对比样品D1有软化(融化)的感觉，而样品S3则还是比较坚韧、完整且呈现出较好的透明度。
如图3-1a，3-1b；3-2a，3-2b；3-2a，3-2b，本发明S3样品和纯壳聚糖膜D1样品在水中浸泡1天、2天、3天后的形态，其表明：本发明S3样品愈合伤口薄膜都比壳聚糖膜D1呈现更好的完整性和耐水性。
(2)降解率实验
将纯壳聚糖膜样品D1和样品S1～S4裁剪至统一尺寸(12×12mm)，并对此膜进行称重，记为初始膜重(W0)。然后在37℃条件下，将膜浸泡在含有1mg/mL的溶菌酶/PBS缓冲液密封烧杯中一段时间。选取不同的时间段，用滤纸将膜表面多余的水分吸去，最后测定膜的湿重，记为Wi。则降解率(Wu)测定公式为：
Figure GDA0002774172690000121
将不同时间段的降解率绘制成图，如图4所示，样品都是从1h的时候开始降解，样品D1的降解速度显著高于样品S1-S4，当降解96h(4天)后，本发明S1～S4样品愈合伤口薄膜的降解率都显著低于纯壳聚糖膜样品D1，尤其以样品S2、S3的降解率(降解约20％)最低，远远低于纯壳聚糖膜样品(D1)的降解率(降解70％)。
(3)牛血清蛋白的吸收率实验
分别取30mg的纯壳聚糖膜样品D1和样品S1～S4膜碎片，分别放置于24孔板中，经PBS缓冲液浸泡2-3小时后，将膜碎片放在0.75mL的10mg/L浓度的牛血清蛋白溶液中培养24h。培养后，用酶标仪测定膜碎片浸泡前后的牛血清蛋白溶液中蛋白的浓度。通过前后蛋白浓度差确定膜吸收牛血清蛋白的能力。
如图5所示，本发明S1～S4样品愈合伤口薄膜的牛血清蛋白的吸收率(60mg/g～80mg/g)远远高于纯壳聚糖膜样品D1(46mg/g)。其中以样品S3的吸收率最佳，为80mg/g。
(4)pH实验
在室温，将纯壳聚糖膜样品D1和样品S1～S4膜碎片浸泡于生理盐水中24h，培养24h后，用pH计测定浸泡液的pH。
如图6所述，薄膜(S1～S4)和纯壳聚糖膜(D1)在生理盐水的pH均为弱酸性，可为伤口的愈合提供适宜的微环境。
(5)抑菌性实验
将灭菌后的纯壳聚糖膜样品D1和样品S1～S4浸泡在1.5mL的稀释后的菌液中，菌液中含E.coli(大肠杆菌)和Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)，起始菌液OD值为0.07。以未经膜浸泡的同等稀释倍数的菌液为对照组(control)，并在37℃条件下，培养24h。经24h的培养后，在无菌条件下，吸取200μL的菌液，用酶标仪分别测定其菌液的浊度。OD值代表菌的浊度，OD值越高代表经24小时的培养后细菌的浓度越低，膜起到的抑菌作用越强。
实验结果如图7、8所示：图7显示，本发明S1～S4样品愈合伤口薄膜浸泡后的大肠杆菌的菌液的浊度明显低于对照组和纯壳聚糖组(D1)，说明本发明的S1～S4样品对大肠杆菌具有很好的抑制性。尤其以样品S3的浊度最低，其抑菌性最佳。
图8显示，本发明S1～S4样品愈合伤口薄膜浸泡后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液的浊度也明显低于对照组和纯壳聚糖组(D1)，体现薄膜具有很好的抑菌性。尤其以样品S3的浊度最低，说明其抑菌性最佳。
综上，本发明以高分子聚合物、禽蛋壳膜与壳聚糖为组合原料制备的伤口愈合薄膜，与纯壳聚糖为原料制备的薄膜相比，具有如下优势：
1)具有一定的耐水性，机械性能：在伤口模拟液(生理盐水)中浸泡1～3天后，仍然能具有完整的表观形态。
2)具有良好的物理表观特性：具有很好的柔韧性、耐折叠能力以及透明度。
3)具有良好的蛋白吸收能力：牛血清蛋白的吸收率为60mg/g～80mg/g，显著高于纯壳聚糖的吸收率40mg/g。
4)薄膜降解速率大大降低，能缩短该薄膜敷料愈合伤口的时间。
5)可为伤口快速愈合提供适宜的pH，创造伤口愈合的微环境。
6)能显著的抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，通过抑制微生物的生长，有效阻止微生物侵染伤口，提高伤口愈合的速度。
由于鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋或鹅蛋的蛋壳及壳膜的成分基本相同，本文不一一罗列、赘述，可以将上述关于鸡蛋壳的方案及结论推及至鸭蛋、鹌鹑蛋或鹅蛋的对应方案。
以上所述为本发明的具体实施方式，但不能对本发明构成任何限制，因此需特别指出，凡是以本发明为基础，做得任何修改与改进均落在本发明保护范围之内。

Claims (10)

1.一种耐水增强型伤口愈合薄膜，其特征在于，所述伤口愈合薄膜包括如下质量体积浓度的原料组分：
Figure FDA0002825038570000011
原料组分超微蛋壳粉颗粒、超微壳膜粉颗粒或壳膜可溶性蛋白、溶菌酶均来自新鲜禽蛋去除内容物得到的部分蛋清残留的带膜蛋壳，其中：所述溶菌酶提取自残留的蛋清中，超微蛋壳粉颗粒由带膜蛋壳分离的蛋壳制得，超微壳膜粉颗粒由带膜蛋壳分离的蛋壳膜制得，壳膜可溶性蛋白由超微壳膜粉颗粒中提取制得。
2.根据权利要求1所述的一种耐水增强型伤口愈合薄膜，其特征在于，
所述超微蛋壳粉颗粒为鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋或鹅蛋其中一种来源的超微蛋壳粉颗粒；
所述超微壳膜粉颗粒或壳膜可溶性蛋白为鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋或鹅蛋其中一种来源的超微壳膜粉颗粒或壳膜可溶性蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种耐水增强型伤口愈合薄膜，其特征在于，
所述高分子多糖为羧甲基纤维素、黄原胶、葡聚糖的一种或多种混合物。
4.如权利要求1-3任一项所述的耐水增强型伤口愈合薄膜的制备方法，其特征在于，
其是一种以超微蛋壳粉颗粒、超微壳膜粉颗粒或壳膜可溶性蛋白、溶菌酶以及壳聚糖为原料制备耐水增强型伤口愈合薄膜的方法，具体包括如下步骤：
(1)取新鲜禽蛋，表面洗净，去除内容物，得到部分蛋清残留的带膜蛋壳；
(2)将蛋清残留的蛋壳用去离子水清洗，分别收集带膜的蛋壳以及含有蛋清的水溶液；
(3)将步骤(2)收集的含有蛋清的水溶液用酸或碱调节pH值至6～12，然后采用树脂吸附法提取得到溶菌酶；
(4)将步骤(2)收集的带膜的蛋壳烘干，然后用粉碎机初步粉碎后，将其浸泡在去离子水中，搅拌、机械分离蛋壳和蛋壳膜，根据密度的不同，分别收集蛋壳与蛋壳膜，最后将蛋壳和蛋壳膜分别超微粉碎成超微粉末颗粒，得到超微蛋壳粉颗粒、超微壳膜粉颗粒；
(5)以巯基丙酸、巯基乙酸和乙酸中任意一种为溶剂提取超微壳膜粉颗粒中的可溶性混合蛋白，冻干，制备壳膜可溶性蛋白粉末；
(6)将步骤(3)中的溶菌酶与1～5mg/L的壳聚糖乙酸溶液，按照每1L壳聚糖乙酸溶液中加入5mg～30mg溶菌酶的比例，搅拌均匀得到溶菌酶和壳聚糖的共混液一；
(7)将步骤(4)中的超微蛋壳粉颗粒与步骤(6)中的共混液一，按照每1L共混液一中加入5mg～10mg超微蛋壳粉的比例，搅拌共混，得到壳粉、溶菌酶和壳聚糖的共混液二；
(8)将步骤(4)制得的超微壳膜粉颗粒或步骤(5)制得的壳膜可溶性蛋白粉末，与步骤(7)中共混液二，按照每1L共混液二中加入50mg～500mg的超微壳膜粉颗粒，搅拌混合均匀得一级混合物；并加入一级混合物0.05％～5％体积百分比的甘油和0.1％～5％体积百分比的高分子多糖，搅拌混合均匀得混合溶液；
(9)取步骤(8)制得的混合溶液，在超声条件下使超微壳膜粉颗粒或壳膜可溶性蛋白粉末均匀分散于溶液中得悬浊液；
(10)将步骤(9)所得悬浊液干燥成膜即得。
5.根据权利要求4所述的一种耐水增强型伤口愈合薄膜的制备方法，其特征在于，步骤(10)具体如下：
在孔板中加入相当体积量的步骤(9)中的悬浊液，平铺，在25℃至50℃下干燥成膜，将膜从孔板上揭下来并干燥储存，即得。
6.根据权利要求5所述的一种耐水增强型伤口愈合薄膜的制备方法，其特征在于，
步骤(3)中调节pH的碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的一种。
7.根据权利要求5或6所述一种耐水增强型伤口愈合薄膜的制备方法，其特征在于，
步骤(3)中所用的吸附树脂为D152阳离子交换树脂、FPC3500阳离子交换树脂、AB-8阳离子交换树脂中的一种或几种混合，吸附树脂的添加量为0.1％～20％w/v。
8.根据权利要求5或6所述的一种耐水增强型伤口愈合薄膜的制备方法，其特征在于，
步骤(8)中高分子多糖为羧甲基纤维素、黄原胶、葡聚糖的一种或多种混合物。
9.根据权利要求5或6所述的一种耐水增强型伤口愈合薄膜的制备方法，其特征在于，
步骤(4)中在2000rpm/min～6000rpm/min搅拌2～4h机械分离蛋壳和蛋壳膜；
步骤(6)在磁力搅拌器中搅拌6～15h得共混液一；
步骤(7)中在2000～5000rpm/min转速条件下搅拌1～5h得共混液二。
10.根据权利要求4所述的一种耐水增强型伤口愈合薄膜的制备方法，其特征在于，步骤(9)中超声方式为连续超声或间歇超声中的一种，超声强度为100W～400W，超声时间为30min～60min。
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