CN103223193B - 高强度丝素骨修复支架材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高强度丝素骨修复支架材料的制备方法。目前还没有一种制备条件温和，对环境无污染的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法。本发明的特点在于：该制备方法包括如下步骤：（1）将含有丝腺蛋白的昆虫中的一对中部丝腺拉出，除去中部丝腺外部的上皮组织，得丝腺蛋白；（2）将丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤1-5次，除去可溶性的丝胶蛋白，得丝素蛋白胶状物；（3）将丝素蛋白胶状物收集到双蒸水中，双蒸水浸没丝素蛋白胶状物，置于摇床上振摇0.3-4个小时得到溶液，将溶液经离心分离以去除不溶物，得丝素蛋白水溶液；（4）将丝素蛋白水溶液加工制备成多孔的高强度丝素骨修复支架材料。本发明制备条件温和，对环境无污染。

Description

高强度丝素骨修复支架材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种骨修复支架材料的制备方法，尤其是涉及一种高强度丝素骨修复支架材料的制备方法，是一种制备高强度丝素骨修复支架材料的方法，属于生物材料领域。

背景技术

家蚕丝素蛋白、柞蚕丝素蛋白和蜘蛛丝蛋白具有优良的力学性能、生物相容性、无免疫排斥或者炎症反应、可降解性以及本质是天然蛋白质的结构特点，在生物材料领域受到高度的关注。丝蛋白可用作骨组织修复、创面覆盖材料、药物缓释材料、微胶囊、人造器官等不同形状与功能的生物材料，以满足人类对生物材料的不同需求。

天然丝蛋白在昆虫体内合成、分泌，并且以高浓度(家蚕中部丝腺蛋白可达30wt%)的丝蛋白溶液的形式贮存在各种丝腺中。然而，一旦经过昆虫喷出的丝纤维凝固之后，便很难再溶于水中，只能溶于强酸、强碱、HFA、HFIP、LiBr、LiSCN等化学溶剂中，这些溶剂都属于材料制备当中的腐蚀性溶液，不仅对生物体有毒副作用，有违于相应的生物安全标准，而且废弃的溶剂对环境也有很大的污染性，溶剂的成本高。经过化学试剂处理得到的再生丝蛋白，因为其分子量大为下降，制备得到的生物支架材料机械性能也显著降低。有研究采用化学交联法来制备不溶性丝素多孔支架，但也可能带来交联剂在生物体内残留影响生物相容性。这些缺点一直以来都制约着丝蛋白材料在生物材料中的应用，如何消除生物材料中残留的化学试剂以及如何提高其力学性能，是丝蛋白多孔支架材料制备中亟待解决的难题，并对丝素蛋白在生物医学材料领域的应用具有重要意义。

现在也有一些其他方式来制备丝素蛋白材料，如公开日为2009年12月09日，公开号为CN101596327的中国专利中，公开了一种三维丝素蛋白多孔支架材料的制备方法，该制备方法是将体积浓度为2%～50WT%的丝素蛋白水溶液置于容器中，然后在20℃～80℃不断搅拌的情况下在丝素溶液中加入氯化钠，其中氯化钠颗粒的质量(单位为克)与丝素溶液的体积(单位为ML)比为1～20∶1；丝素溶液经凝胶、静置、沉淀后，取沉淀部分，继续搅拌将沉淀物混合均匀，然后将其放入所需形状的模具中，烘干；最后经蒸馏水洗去支架中的氯化钠，即得到具有三维多孔结构的丝素支架材料。该方法虽然没有使用任何有机溶剂，对生物体无毒副作用，但是制备而成的丝素支架材料的力学性能较差。又如公开日为2010年10月20日，公开号为CN101864177A的中国专利中，公开了一种多孔蚕丝丝素蛋白材料的制备方法，该制备方法将蚕丝脱胶、溶解、透析获得丝素蛋白溶液;按摩尔比，将等比例的羧酸或羧酸溶液与柠檬酸混合，加热溶解后再加入聚乙二醇，得到促胶凝剂;将丝素蛋白溶液与促胶凝剂混合后倒入模具中，得到丝素蛋白凝胶，在10～100℃的温度条件下加热干燥后得到多孔丝素蛋白材料。该方法中使用的有机溶剂对生物存在一定的毒副作用。

综上所述，目前还没有一种加工工艺简单，制备条件温和，丝素支架材料的力学性能强，成本低廉，对环境无污染的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种加工工艺简单，制备条件温和，丝素支架材料的力学性能强，成本低廉，对环境无污染的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该高强度丝素骨修复支架材料的制备方法的特点在于：该制备方法包括如下步骤：

（1）将含有丝腺蛋白的昆虫中的一对中部丝腺拉出，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，该条带即为丝腺蛋白；

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤1-5次，以除去丝腺蛋白中的大部分可溶性的丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白胶状物；

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到双蒸水中，使得双蒸水浸没丝素蛋白胶状物，然后置于摇床上轻轻振摇0.3-4个小时得到溶液，再将所得溶液经过离心分离以去除不溶物，从而得到丝素蛋白水溶液；

（4）将步骤（3）得到的丝素蛋白水溶液加工制备成多孔的高强度丝素骨修复支架材料。

由此使得本发明的加工工艺简单，制备条件温和，生产过程环保，制备而成的高强度丝素骨修复支架材料的力学性能强，而且成本低廉，对环境无污染。

作为优选，本发明所述步骤（4）中，先用双蒸水将丝素蛋白水溶液的浓度调整到1wt%-20wt%，然后滴加到细胞培养板中，在25-35℃的条件下保存8-16个小时，使得丝素蛋白水溶液中的水分减少，以及丝素蛋白的二级结构向β-折叠转变，从而得到丝素蛋白；将丝素蛋白放在-30-（-10）℃的条件下冷冻1-3个小时，再经过真空冷冻干燥14-34个小时，从而得到多孔的高强度丝素骨修复支架材料。由此使得本发明制备而成的高强度丝素骨修复支架材料的力学性能更好。

作为优选，本发明将多孔的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为65-85%的酒精中8-16个小时，此过程作为后处理过程，目的是提高高强度丝素骨修复支架材料的力学性能，以及延缓高强度丝素骨修复支架材料在生物体内的降解速度。

作为优选，本发明所述步骤（1）中，含有丝腺蛋白的昆虫为家蚕、野蚕或蜘蛛。

作为优选，本发明所述步骤（3）中，将浸有丝素蛋白胶状物的双蒸水置于摇床上轻轻振摇1个小时得到溶液，再将所得溶液经过离心分离以去除不溶物，从而得到丝素蛋白水溶液，该丝素蛋白水溶液中的丝素蛋白分子量高于250kDa；所述步骤（4）中，所述高强度丝素骨修复支架材料的弹性压缩模量在5Mpa以上。

作为优选，本发明所述步骤（4）中，将步骤（3）得到的丝素蛋白水溶液通过冷冻干燥方式或盐析法加工制备成多孔的高强度丝素骨修复支架材料。

作为优选，本发明所述步骤（2）和（3）均在0℃的环境中进行。

作为优选，本发明所述步骤（4）中，先用双蒸水将丝素蛋白水溶液的浓度调整到1wt%-20wt%，然后滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板为准，在30℃的条件下保存12个小时，使得丝素蛋白水溶液中的水分减少，以及丝素蛋白的二级结构向β-折叠转变，从而得到丝素蛋白；将丝素蛋白放在-20℃的条件下冷冻2个小时，再经过真空冷冻干燥24个小时，从而得到多孔的高强度丝素骨修复支架材料。

作为优选，本发明将多孔的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为75%的酒精中12个小时。

作为优选，本发明所述家蚕为五龄第7天的家蚕幼虫。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：1、优良的机械性能：与再生家蚕丝素材料或者混合有家蚕丝素蛋白做成的多孔支架材料相比，其力学性能优良，具有很高的弹性模量。2、良好的生物相容性：材料本身或者降解产物对细胞无毒性反应，水溶性丝素蛋白具有较高的细胞粘附率和增殖率，表现出良好的生物相容性。3、操作简单，生产周期短：加工工艺简单，没有复杂繁琐的提取材料过程，时间上大为节省。4、经济环保：制备过程中未使用其它成本高的化学试剂，制备条件温和，成本低廉，相对于使用化学试剂制备的材料来说，对环境无污染。

本发明制备而成的高强度丝素骨修复支架材料的内部结构、孔径尺寸和孔隙大小均匀，连通性好，有利于骨细胞的粘附分化增殖等。而且，随着水溶性丝素蛋白浓度的增加，其孔隙率逐渐降低。本发明制备而成的高强度丝素骨修复支架材料能促进骨肉瘤细胞的生长，将该高强度丝素骨修复支架材料植入兔子的股骨头缺损部位，能促进骨组织的生长。

本发明中丝素蛋白水溶液中的丝素蛋白分子量高于250kDa，即得到的水溶性丝素蛋白分子量高于250 kDa，与完整的丝素蛋白重链的分子量相近。本发明制备而成的高强度丝素骨修复支架材料的最大抗压强度可高达6.9±0.4MPa，具有很强的力学性能，不仅没有细胞毒性，而且对细胞具有粘附和促进作用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1。

本实施例中的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法包括如下步骤。

（1）用医用钳将五龄第7天的家蚕幼虫中的一对中部丝腺拉出，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，该条带即为丝腺蛋白。本发明也可以使用含有丝腺蛋白的其他昆虫，如野蚕或蜘蛛。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤两次，以除去丝腺蛋白中的大部分可溶性的丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白胶状物。步骤（2）在0℃的环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到双蒸水中，使得双蒸水浸没丝素蛋白胶状物，然后置于摇床上轻轻振摇1个小时得到溶液，再将所得溶液经过离心分离以去除不溶物，从而得到丝素蛋白水溶液。步骤（3）在0℃的环境中进行。

（4）先用双蒸水将步骤（3）得到的丝素蛋白水溶液的浓度调整到1wt%-20wt%，然后滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板为准，在30℃的条件下保存12个小时，使得丝素蛋白水溶液中的水分减少，以及丝素蛋白的二级结构向β-折叠转变，从而得到丝素蛋白。将丝素蛋白放在-20℃的条件下冷冻2个小时，再经过真空冷冻干燥24个小时，从而得到多孔的高强度丝素骨修复支架材料。

将多孔的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为75%的酒精中12个小时，此过程作为后处理过程，目的是提高高强度丝素骨修复支架材料的力学性能，以及延缓高强度丝素骨修复支架材料在生物体内的降解速度。

本实施例制备而成的高强度丝素骨修复支架材料能促进骨肉瘤细胞的生长，将该高强度丝素骨修复支架材料植入兔子的股骨头缺损部位，能促进骨组织的生长。

实施例2。

本实施例中的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法包括如下步骤。

（1）将含有丝腺蛋白的昆虫中的一对中部丝腺拉出，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，该条带即为丝腺蛋白。含有丝腺蛋白的昆虫可以为家蚕、野蚕或蜘蛛。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤1-5次，以除去丝腺蛋白中的大部分可溶性的丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白胶状物。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到双蒸水中，使得双蒸水浸没丝素蛋白胶状物，然后置于摇床上轻轻振摇0.3-4个小时得到溶液，再将所得溶液经过离心分离以去除不溶物，从而得到丝素蛋白水溶液。

（4）将步骤（3）得到的丝素蛋白水溶液加工制备成多孔的高强度丝素骨修复支架材料。

本实施例制备而成的高强度丝素骨修复支架材料能促进骨肉瘤细胞的生长，将该高强度丝素骨修复支架材料植入兔子的股骨头缺损部位，能促进骨组织的生长。

实施例3。

本实施例中的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法包括如下步骤。

（1）将含有丝腺蛋白的家蚕中的一对中部丝腺拉出，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，该条带即为丝腺蛋白。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤三次，以除去丝腺蛋白中的大部分可溶性的丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白胶状物。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到双蒸水中，使得双蒸水浸没丝素蛋白胶状物，然后置于摇床上轻轻振摇1.5个小时得到溶液，再将所得溶液经过离心分离以去除不溶物，从而得到丝素蛋白水溶液，该丝素蛋白水溶液中的丝素蛋白分子量高于250kDa。

（4）先用双蒸水将步骤（3）得到的丝素蛋白水溶液的浓度调整到20wt%，然后滴加到细胞培养板中，在25-35℃的条件下保存8-16个小时，使得丝素蛋白水溶液中的水分减少，以及丝素蛋白的二级结构向β-折叠转变，从而得到丝素蛋白。将丝素蛋白放在-30-（-10）℃的条件下冷冻1-3个小时，再经过真空冷冻干燥14-34个小时，从而得到多孔的高强度丝素骨修复支架材料，该高强度丝素骨修复支架材料的弹性压缩模量在5Mpa以上。

本实施例制备而成的高强度丝素骨修复支架材料能促进骨肉瘤细胞的生长，将该高强度丝素骨修复支架材料植入兔子的股骨头缺损部位，能促进骨组织的生长。

实施例4。

本实施例中的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法包括如下步骤。

（1）将含有丝腺蛋白的昆虫中的一对中部丝腺拉出，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，该条带即为丝腺蛋白。本发明中含有丝腺蛋白的昆虫可以为家蚕、野蚕或蜘蛛，优选为五龄第7天的家蚕幼虫。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤1-5次，以除去丝腺蛋白中的大部分可溶性的丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白胶状物。步骤（2）在0℃的环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到双蒸水中，使得双蒸水浸没丝素蛋白胶状物，将浸有丝素蛋白胶状物的双蒸水置于摇床上轻轻振摇1个小时得到溶液，再将所得溶液经过离心分离以去除不溶物，从而得到丝素蛋白水溶液，该丝素蛋白水溶液中的丝素蛋白分子量高于250kDa。本发明可以将浸有丝素蛋白胶状物的双蒸水置于摇床上轻轻振摇0.3-4个小时得到溶液。步骤（3）在0℃的环境中进行。

（4）先用双蒸水将步骤（3）得到的丝素蛋白水溶液的浓度调整到1wt%，然后滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板为准，在30℃的条件下保存12个小时，使得丝素蛋白水溶液中的水分减少，以及丝素蛋白的二级结构向β-折叠转变，从而得到丝素蛋白；将丝素蛋白放在-20℃的条件下冷冻2个小时，再经过真空冷冻干燥24个小时，从而得到多孔的高强度丝素骨修复支架材料，该高强度丝素骨修复支架材料的弹性压缩模量在5Mpa以上。

再将步骤（4）制得的多孔的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为75%的酒精中12个小时，此过程作为后处理过程，目的是提高高强度丝素骨修复支架材料的力学性能，以及延缓高强度丝素骨修复支架材料在生物体内的降解速度。本发明可以将多孔的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为65-85%的酒精中8-16个小时。

本实施例制备而成的高强度丝素骨修复支架材料能促进骨肉瘤细胞的生长，将该高强度丝素骨修复支架材料植入兔子的股骨头缺损部位，能促进骨组织的生长。

当然，本发明可以先用双蒸水将步骤（3）得到的丝素蛋白水溶液的浓度调整到1wt%-20wt%，然后滴加到细胞培养板中，可以在25-35℃的条件下保存8-16个小时，使得丝素蛋白水溶液中的水分减少，以及丝素蛋白的二级结构向β-折叠转变，从而得到丝素蛋白。可以将丝素蛋白放在-30-（-10）℃的条件下冷冻1-3个小时，再经过真空冷冻干燥14-34个小时，从而得到多孔的高强度丝素骨修复支架材料。

本发明可以将步骤（3）得到的丝素蛋白水溶液通过冷冻干燥方式或盐析法加工制备成多孔的高强度丝素骨修复支架材料。

实施例5。

本实施例中的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法包括如下步骤。

（1）将含有丝腺蛋白的昆虫中的一对中部丝腺拉出，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，该条带即为丝腺蛋白。含有丝腺蛋白的昆虫可以为家蚕、野蚕或蜘蛛。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤1-5次，以除去丝腺蛋白中的大部分可溶性的丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白胶状物。步骤（2）可以在-5℃至5℃的低温环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到双蒸水中，使得双蒸水浸没丝素蛋白胶状物，然后置于摇床上轻轻振摇0.3-4个小时得到溶液，再将所得溶液经过离心分离以去除不溶物，从而得到丝素蛋白水溶液，该丝素蛋白水溶液中的丝素蛋白分子量高于250kDa。步骤（3）可以在-5℃至5℃的低温环境中进行。

（4）将步骤（3）得到的丝素蛋白水溶液通过冷冻干燥方式或盐析法加工制备成多孔的高强度丝素骨修复支架材料。再将多孔的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为65-85%的酒精中8-16个小时，此过程作为后处理过程，目的是提高高强度丝素骨修复支架材料的力学性能，以及延缓高强度丝素骨修复支架材料在生物体内的降解速度。

本实施例制备而成的高强度丝素骨修复支架材料能促进骨肉瘤细胞的生长，将该高强度丝素骨修复支架材料植入兔子的股骨头缺损部位，能促进骨组织的生长。

实施例6。

本实施例中高强度丝素骨修复支架材料制备方法依次包括如下步骤。

（1）用医用钳将五龄第7天家蚕幼虫解剖后取出中部丝腺。除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，即为丝腺蛋白。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤两次，以除去大部分的可溶性的丝胶蛋白，得到丝素蛋白胶状物，此过程在0℃环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到含有10mL双蒸水的烧杯中，当解剖的家蚕数量为20条时，作为一批实验的量。在摇床上轻轻振摇1.1小时，所得溶液经过离心分离去除不溶物后，即得到丝素蛋白水溶液，此过程在0℃环境中进行。

（4）步骤（3）得到丝素蛋白分子量高于250kDa。

（5）将步骤（4）中的丝素蛋白水溶液用双蒸水调整到2wt%浓度，滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板。30℃保存12小时，使丝素蛋白水溶液中的水分减少，及丝素蛋白的二级结构向β-折叠转变。

（6）将步骤（5）中的丝素蛋白放在-20℃冰箱中冷冻2个小时，之后真空冷冻干燥24小时，得到高强度丝素骨修复支架材料。

（7）将步骤（6）中的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为75%的酒精中12个小时，此过程作用为后处理过程，目的是提高高强度丝素骨修复支架材料的力学性能，及延缓支架材料在生物体内的降解速度。

（8）步骤（7）得到的高强度丝素骨修复支架材料的弹性压缩模量达5Mpa以上。

实施例7。

（1）用医用钳将五龄第7天家蚕幼虫解剖后取出中部丝腺。除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，即为丝腺蛋白。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤三次，以除去大部分的可溶性的丝胶蛋白，得到丝素蛋白胶状物，此过程在0℃环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到含有10mL双蒸水的烧杯中，当解剖的家蚕数量为20条时，作为一批实验的量。在摇床上轻轻振摇1小时，所得溶液经过离心分离去除不溶物后，即得到丝素蛋白水溶液，此过程在0℃环境中进行。

（4）步骤（3）得到丝素蛋白分子量高于250kDa。

（5）将步骤（4）中的丝素蛋白水溶液用双蒸水调整到2wt%浓度，滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板。30℃保存12小时，使丝素蛋白水溶液中的水分减少，及丝素蛋白的二级结构向β-折叠转变。

（6）将步骤（5）中的丝素蛋白放在-20℃的冰箱中冷冻2个小时，之后真空冷冻干燥24小时，得到高强度丝素骨修复支架材料。

（7）将步骤（6）中的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为75%的酒精中12个小时，此过程作用为后处理过程，目的是提高高强度丝素骨修复支架材料的力学性能，及延缓支架材料在生物体内的降解速度。

（8）将步骤（7）得到的高强度丝素骨修复支架材料能促进骨肉瘤细胞的生长。

实施例8。

（1）用医用钳将五龄第7天家蚕幼虫解剖后取出中部丝腺。除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，即为丝腺蛋白。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤两次，以除去大部分的可溶性的丝胶蛋白，得到丝素蛋白胶状物，此过程在0℃环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到含有10mL双蒸水的烧杯中，当解剖的家蚕数量为20条时，作为一批实验的量。在摇床上轻轻振摇1.2小时，所得溶液经过离心分离去除不溶物后，即得到丝素蛋白水溶液，此过程在0℃环境中进行。

（4）步骤（3）得到丝素蛋白分子量高于250kDa。

（5）将步骤（4）中的丝素蛋白水溶液用双蒸水调整到2wt%浓度，滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板。30℃保存12小时，使丝素蛋白水溶液中的水分减少及丝素蛋白的二级结构向β-折叠转变。

（6）将步骤（5）中的丝素蛋白放在-20℃冰箱中冷冻2个小时，之后真空冷冻干燥24小时，得到高强度丝素骨修复支架材料。

（7）将步骤（6）中的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为75%的酒精中12个小时，此过程作用为后处理过程，目的是提高高强度丝素骨修复支架材料的力学性能，及延缓支架材料在生物体内的降解速度。

（8）将步骤（7）得到的高强度丝素骨修复支架材料植入兔子的股骨头缺损部位，能促进骨组织的生长。

实施例9。

（1）用医用钳将五龄第7天家蚕幼虫解剖后取出中部丝腺，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，即为丝腺蛋白。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤三次，以除去大部分的可溶性的丝胶蛋白，得到丝素蛋白胶状物，此过程在0℃环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到含有10mL双蒸水的烧杯中，当解剖的家蚕数量为21条时，作为一批实验的量。在摇床上轻轻振摇1小时，所得溶液经过离心分离去除不溶物后，即得到丝素蛋白水溶液，此过程在0℃环境中进行。

（4）步骤（3）得到丝素蛋白分子量高于250kDa。

（5）将步骤（4）中的丝素蛋白水溶液用双蒸水调整到5wt%浓度，将超饱和的氯化钠溶液与丝素蛋白水溶液混合均匀，滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板，20℃风干24小时。

（6）将步骤（5）中的丝素蛋白支架放入大量去离子水中，将氯化钠溶解到去离子水中，得到高强度丝素骨修复支架材料。

（7）将步骤（6）中的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为75%的酒精中12个小时，此过程作用为后处理过程，目的是提高高强度丝素骨修复支架材料的力学性能，及延缓支架材料在生物体内的降解速度。

（8）步骤（7）得到的高强度丝素骨修复支架材料的弹性压缩模量达5Mpa以上。

实施例10。

（1）用医用钳将五龄第7天家蚕幼虫解剖后取出中部丝腺，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，即为丝腺蛋白。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤两次，以除去大部分的可溶性的丝胶蛋白，得到丝素蛋白胶状物，此过程在0℃环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到含有10mL双蒸水的烧杯中，当解剖的家蚕数量为22条时，作为一批实验的量。在摇床上轻轻振摇1.1小时，所得溶液经过离心分离去除不溶物后，即得到丝素蛋白水溶液，此过程在0℃环境中进行。

（4）步骤（3）得到丝素蛋白分子量高于250kDa。

（5）将步骤（4）中的丝素蛋白水溶液用双蒸水调整到5wt%浓度，将超饱和的氯化钠溶液与丝素蛋白水溶液混合均匀，滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板，20℃风干24小时。

（6）将步骤（5）中的丝素蛋白支架放入大量去离子水中，将氯化钠溶解到去离子水中，得到高强度丝素骨修复支架材料。

（7）将步骤（6）中的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为75%的酒精中12个小时，此过程作用为后处理过程，目的是提高高强度丝素骨修复支架材料的力学性能，及延缓支架材料在生物体内的降解速度。

（8）将步骤（7）得到的高强度丝素骨修复支架材料能促进骨肉瘤细胞的生长。

实施例11。

（1）用医用钳将五龄第7天家蚕幼虫解剖后取出中部丝腺，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，即为丝腺蛋白。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤两次，以除去大部分的可溶性的丝胶蛋白，得到丝素蛋白胶状物，此过程在0℃环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到含有10mL双蒸水的烧杯中，当解剖的家蚕数量为21条时，作为一批实验的量。在摇床上轻轻振摇1.2小时，所得溶液经过离心分离去除不溶物后，即得到丝素蛋白水溶液，此过程在0℃环境中进行。

（4）步骤（3）得到丝素蛋白分子量高于250kDa。

（5）将步骤（4）中的丝素蛋白水溶液用双蒸水调整到5wt%浓度，将超饱和的氯化钠溶液与丝素蛋白水溶液混合均匀，滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板，20℃风干24小时。

（6）将步骤（5）中的丝素蛋白支架放入大量去离子水中，将氯化钠溶解到去离子水中，得到高强度丝素骨修复支架材料。

（7）将步骤（6）中的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为75%的酒精中12个小时，此过程作用为后处理过程，目的是提高高强度丝素骨修复支架材料的力学性能，及延缓支架材料在生物体内的降解速度。

（8）将步骤（7）得到的高强度丝素骨修复支架材料植入兔子的股骨头缺损部位，能促进骨组织的生长。

实施例12。

（1）用医用钳将五龄第7天家蚕幼虫解剖后取出中部丝腺，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，即为丝腺蛋白。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤两次，以除去大部分的可溶性的丝胶蛋白，得到丝素蛋白胶状物，此过程在0℃环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到含有10mL双蒸水的烧杯中，当解剖的家蚕数量为18条时，作为一批实验的量。在摇床上轻轻振摇0.95小时，所得溶液经过离心分离去除不溶物后，即得到丝素蛋白水溶液，此过程在0℃环境中进行。

（4）步骤（3）得到丝素蛋白分子量高于250kDa。

（5）将步骤（4）中的丝素蛋白水溶液用双蒸水调整到10wt%浓度，将超饱和的氯化钠溶液与丝素蛋白水溶液混合均匀，滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板，20℃风干24小时。

（6）将步骤（5）中的丝素蛋白支架放入大量去离子水中，将氯化钠溶解到去离子水中，干燥后得到高强度丝素骨修复支架材料。

（7）将步骤（6）得到的高强度丝素骨修复支架材料植入兔子的股骨头缺损部位，能促进骨组织的生长。

实施例13。

（1）用医用钳将五龄第7天家蚕幼虫解剖后取出中部丝腺，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，即为丝腺蛋白。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤两次，以除去大部分的可溶性的丝胶蛋白，得到丝素蛋白胶状物，此过程在0℃环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到含有10mL双蒸水的烧杯中，当解剖的家蚕数量为20条时，作为一批实验的量。在摇床上轻轻振摇1小时，所得溶液经过离心分离去除不溶物后，即得到丝素蛋白水溶液，此过程在0℃环境中进行。

（4）步骤（3）得到丝素蛋白分子量高于250kDa。

（5）将步骤（4）中的丝素蛋白水溶液用双蒸水调整到10wt%浓度，将超饱和的氯化钠溶液与丝素蛋白水溶液混合均匀，滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板，20℃风干24小时。

（6）将步骤（5）中的丝素蛋白支架放入大量去离子水中，将氯化钠溶解到去离子水中。干燥后得到高强度丝素骨修复支架材料。

（7）将步骤（6）得到的高强度丝素骨修复支架材料能促进骨肉瘤细胞的生长。

实施例14。

本实施例中的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法包括如下步骤。

（1）将含有丝腺蛋白的昆虫中的一对中部丝腺拉出，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，该条带即为丝腺蛋白。含有丝腺蛋白的昆虫可以为家蚕、野蚕或蜘蛛。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤3次，以除去丝腺蛋白中的大部分可溶性的丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白胶状物，此过程在0.1℃环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到含有10mL双蒸水的烧杯中，使得双蒸水浸没丝素蛋白胶状物，然后置于摇床上轻轻振摇1.3个小时得到溶液，再将所得溶液经过离心分离以去除不溶物，从而得到丝素蛋白水溶液，该丝素蛋白水溶液中的丝素蛋白分子量高于250kDa。此过程在0.1℃环境中进行。

（4）将步骤（3）得到的丝素蛋白水溶液通过冷冻干燥方式加工制备成多孔的高强度丝素骨修复支架材料，再将多孔的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为70%的酒精中12.5个小时，此过程作为后处理过程，目的是提高高强度丝素骨修复支架材料的力学性能，以及延缓高强度丝素骨修复支架材料在生物体内的降解速度。

本实施例制备而成的高强度丝素骨修复支架材料能促进骨肉瘤细胞的生长，将该高强度丝素骨修复支架材料植入兔子的股骨头缺损部位，能促进骨组织的生长。

实施例15。

本实施例中高强度丝素骨修复支架材料制备方法依次包括如下步骤。

（1）用医用钳将野蚕幼虫解剖后取出中部丝腺，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，即为丝腺蛋白。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤一次，以除去大部分的可溶性的丝胶蛋白，得到丝素蛋白胶状物，此过程在0℃环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到含有10mL双蒸水的烧杯中，当解剖的家蚕数量为25条时，作为一批实验的量。在摇床上轻轻振摇1.1小时，所得溶液经过离心分离去除不溶物后，即得到丝素蛋白水溶液，此过程在1℃环境中进行。

（4）步骤（3）得到丝素蛋白分子量高于250kDa。

（5）将步骤（4）中的丝素蛋白水溶液用双蒸水调整到13wt%浓度，滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板。30℃保存12.2小时，使丝素蛋白水溶液中的水分减少，及丝素蛋白的二级结构向β-折叠转变。

（6）将步骤（5）中的丝素蛋白放在-20℃冰箱中冷冻2个小时，之后真空冷冻干燥24小时，得到高强度丝素骨修复支架材料。

（7）将步骤（6）中的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为75%的酒精中12个小时，此过程作用为后处理过程，目的是提高高强度丝素骨修复支架材料的力学性能，及延缓支架材料在生物体内的降解速度，得到的高强度丝素骨修复支架材料的弹性压缩模量达5Mpa以上。

实施例16。

（1）用医用钳将蜘蛛解剖后取出中部丝腺，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，即为丝腺蛋白。

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤两次，以除去大部分的可溶性的丝胶蛋白，得到丝素蛋白胶状物，此过程在0℃环境中进行。

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到含有10mL双蒸水的烧杯中，当解剖的家蚕数量为20条时，作为一批实验的量。在摇床上轻轻振摇1.3小时，所得溶液经过离心分离去除不溶物后，即得到丝素蛋白水溶液，此过程在0℃环境中进行。

（4）步骤（3）得到丝素蛋白分子量高于250kDa。

（5）将步骤（4）中的丝素蛋白水溶液用双蒸水调整到13wt%浓度，将超饱和的氯化钠溶液与丝素蛋白水溶液混合均匀，滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板，20℃风干24小时。

（6）将步骤（5）中的丝素蛋白支架放入大量去离子水中，将氯化钠溶解到去离子水中，干燥后得到高强度丝素骨修复支架材料，得到的高强度丝素骨修复支架材料能促进骨肉瘤细胞的生长。

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高强度丝素骨修复支架材料的制备方法，其特征在于：该制备方法包括如下步骤：

（1）将含有丝腺蛋白的昆虫中的一对中部丝腺拉出，除去中部丝腺外部的上皮组织，可见一段清澈透明的条带，该条带即为丝腺蛋白；

（2）将步骤（1）中的丝腺蛋白浸渍在双蒸水中洗涤1-5次，以除去丝腺蛋白中的大部分可溶性的丝胶蛋白，从而得到丝素蛋白胶状物；

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白胶状物收集到双蒸水中，使得双蒸水浸没丝素蛋白胶状物，然后置于摇床上轻轻振摇0.3-4个小时得到溶液，再将所得溶液经过离心分离以去除不溶物，从而得到丝素蛋白水溶液；所述丝素蛋白水溶液中的丝素蛋白分子量高于250kDa；

（4）将步骤（3）得到的丝素蛋白水溶液加工制备成多孔的高强度丝素骨修复支架材料。

2.根据权利要求1所述的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中，先用双蒸水将丝素蛋白水溶液的浓度调整到1wt%-20wt%，然后滴加到细胞培养板中，在25-35℃的条件下保存8-16个小时，使得丝素蛋白水溶液中的水分减少，以及丝素蛋白的二级结构向β-折叠转变，从而得到丝素蛋白；将丝素蛋白放在-30-（-10）℃的条件下冷冻1-3个小时，再经过真空冷冻干燥14-34个小时，从而得到多孔的高强度丝素骨修复支架材料。

3.根据权利要求1或2所述的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法，其特征在于：将多孔的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为65-85%的酒精中8-16个小时，此过程作为后处理过程，目的是提高高强度丝素骨修复支架材料的力学性能，以及延缓高强度丝素骨修复支架材料在生物体内的降解速度。

4.根据权利要求1所述的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，含有丝腺蛋白的昆虫为家蚕、野蚕或蜘蛛。

5.根据权利要求1所述的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，将浸有丝素蛋白胶状物的双蒸水置于摇床上轻轻振摇1个小时得到溶液，再将所得溶液经过离心分离以去除不溶物，从而得到丝素蛋白水溶液，该丝素蛋白水溶液中的丝素蛋白分子量高于250kDa；所述步骤（4）中，所述高强度丝素骨修复支架材料的弹性压缩模量在5Mpa以上。

6.根据权利要求1所述的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中，将步骤（3）得到的丝素蛋白水溶液通过冷冻干燥方式或盐析法加工制备成多孔的高强度丝素骨修复支架材料。

7.根据权利要求1所述的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）和（3）均在0℃的环境中进行。

8.根据权利要求2所述的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中，先用双蒸水将丝素蛋白水溶液的浓度调整到1wt%-20wt%，然后滴加到48孔细胞培养板中，每孔加入的量为浸没48孔板为准，在30℃的条件下保存12个小时，使得丝素蛋白水溶液中的水分减少，以及丝素蛋白的二级结构向β-折叠转变，从而得到丝素蛋白；将丝素蛋白放在-20℃的条件下冷冻2个小时，再经过真空冷冻干燥24个小时，从而得到多孔的高强度丝素骨修复支架材料。

9.根据权利要求3所述的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法，其特征在于：将多孔的高强度丝素骨修复支架材料浸泡于体积百分比为75%的酒精中12个小时。

10.根据权利要求4所述的高强度丝素骨修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述家蚕为五龄第7天的家蚕幼虫。