CN103007345B - 抗菌生物活性支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗菌生物活性支架及其制备方法,所述方法的步骤为:制备明胶微球;制备多孔明胶微球;获得载有活性因子的明胶微球;制备抗菌支架,向醋酸或丙二酸中加入胶原、壳聚糖和丝素蛋白中的至少一种以及纳米银粒子,制得混合溶液,将混合溶液注入平铺有实心明胶微球的模具中后迅速把模具放入超低温冰箱里冷冻处理,再冷冻干燥得到抗菌支架;制备抗菌生物活性支架步骤,将载有活性因子的明胶微球置于生理盐水中配制成悬浮液,将悬浮液注入抗菌支架中,室温干燥后得到抗菌生物活性支架。本发明以纯天然高分子为原料并复合纳米银粒子和生物活性因子制得支架,支架具有生物活性和抗菌能力,能有效促进新生组织的血管化,可用于皮肤损伤修复。
Description
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域,尤其是指一种抗菌生物活性支架及其制备方法。
背景技术
在日常生活、工作中,人体皮肤受到损伤时有发生。目前,皮肤的修复主要依靠血管内皮细胞和成纤维细胞的迁移、增殖和结缔组织的形成来修复真皮层,这一过程常需要通过植皮或人工皮肤的辅助才能完成。尽管皮肤移植能治愈创面,但在取皮部位却留下了新的创伤,常常导致疤痕增生,甚至因取皮过深,供皮区难以自愈,形成水疱,反复溃疡等不利因素。
胶原是皮肤、韧带、肌腱等组织及其它结缔组织的主要成分,同时也是细胞外基质(ECM)的主要成分。由于胶原具有无抗原性、良好的生物相容性、可参与组织愈合过程等特点,并且其纤维状结构利于组织培养中的细胞粘附增殖,可作为皮肤组织和骨组织的替代材料诱导组织再生修复,是理想的膜材料。但由于胶原的力学性能、降解性能、生物活性等问题,单一的胶原材料不能满足性能要求,所以胶原基复合材料成为生物材料领域研究的主要方向。
目前,利用胶原为原料的皮肤替代物产品主要有Integra®、Biobrane®等人造皮肤。Integra®是由硅、牛胶原蛋白和鲨鱼软骨组成,其用处相当于一个支架,支持人体自身细胞并促使皮肤组织的再生。Biobrane®是双层膜状物,外层是薄的硅凝胶膜,内层整合有大量的胶原颗粒,可以迅速与创面紧密贴附。国内人工皮肤产品也有突破性进展,第四军医大学金岩教授项目组开发的组织工程化人工皮肤产品进入了产业化,该人工皮肤已于2007年获得医疗器械产品注册证书,正式进入临床阶段。但是,现有的支架材料功能单一,在抗菌性和生物活性方面往往无法兼顾。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种抗菌生物活性支架,其同时具有抗菌能力和生物活性,能有效促进创面愈合。
本发明进一步所要解决的技术问题在于,提供一种抗菌生物活性支架制备方法,能以简便的步骤制备出具有抗菌能力和生物活性,并能有效促进创面愈合的生物活性支架。
为解决上述技术问题,本发明提供如下技术方案:一种抗菌生物活性支架,是由载有活性因子的多孔明胶微球的生理盐水悬浮液注入抗菌支架中而成,其原料包括支架主体材料、抗菌成分和活性因子,所述支架主体材料为如下材料成分:明胶、胶原、壳聚糖和丝素蛋白;所述抗菌成分为纳米银粒子;所述抗菌支架是由实心明胶微球与胶原、壳聚糖和丝素蛋白三者用量总和的质量比为:3-5:1的比例以及纳米银粒子制成;所述活性因子为如下生长因子中的至少一种:碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生因子和转化生长因子。
进一步地,抗菌生物活性支架还包括透明质酸和硫酸软骨素中的至少一种。
另一方面,本发明还提供一种如上所述的抗菌生物活性支架的制备方法,包括如下步骤:
制备明胶微球步骤,制备实心明胶微球;
制备多孔明胶微球步骤,将实心明胶微球制成多孔明胶微球;
加载活性因子步骤,将浓度为0.01-150ug/ul的活性因子水溶液滴加到多孔明胶微球上,然后在室温下静置,使活性因子溶液充分浸渍到干燥的微球上,获得载有活性因子的明胶微球;
制备抗菌支架步骤,向成分为醋酸或丙二酸的溶剂中加入胶原、壳聚糖和丝素蛋白中的至少一种以及纳米银粒子,制得混合溶液,然后,将实心明胶微球平铺在模具中,用蒸汽熏蒸10-30min,再按照实心明胶微球与胶原、壳聚糖和丝素蛋白三者用量总和的质量比为:3-5:1的比例将混合溶液注入模具中,并迅速把模具放入超低温冰箱里冷冻24-48h,再冷冻干燥得到抗菌支架;以及
制备抗菌生物活性支架步骤,将载有活性因子的明胶微球置于生理盐水中配制成悬浮液,然后将悬浮液注入抗菌支架中,室温干燥后得到抗菌生物活性支架。
进一步地,制备明胶微球步骤的具体操作如下:将明胶加入蒸馏水中,在40-50℃恒温水浴中溶解1h,配制质量百分比为2-40%的明胶溶液,同时取200-400mL油放在40-50℃恒温水浴中;然后在200-500 rpm转速下把明胶溶液滴入到油中形成均匀的混合乳液,再把混合乳液从恒温水浴的温度阶梯式逐渐降温到0℃,每降10℃恒温15min,再加入80-200mL 4℃的丙酮,转速250-800rpm下继续搅拌1h,用丙酮清洗后3000-4000rpm离心收集,最后用环氧乙烷浸泡2天,一天换三次溶剂,再用去离子水洗涤后,冷冻干燥2天,最后用筛子筛选粒径为80-400μm的实心明胶微球。
进一步地,所述方法还包括制备多孔明胶微球步骤,以将实心明胶微球制成多孔明胶微球后再进行加载活性因子步骤,制备多孔明胶微球步骤的具体操作如下:将实心明胶微球浸渍在质量百分比浓度为0.1-2%的戊二醛和吐温80的混合溶液中,在25℃- 0℃的温度条件下交联8-24h,混合溶液中,吐温80的质量百分比浓度为0.05-2%,然后置入含有质量百分比浓度为0.05-2%的甘氨酸的和质量百分比浓度为0.05-2%的吐温80的混合溶液中,在37℃的条件下静置15-30分钟后取出明胶微球,再用质量百分比0.1%吐温80溶液于4000 rpm离心处理5分钟,然后在4℃下洗涤后冷冻干燥,获得多孔明胶微球。
进一步地,制备抗菌支架步骤中,制得的混合溶液中,所加入的胶原、壳聚糖和丝素蛋白的总质量百分比浓度为0.01-1%,纳米银粒子质量百分比浓度为40-100ppm。
进一步地,制备抗菌支架步骤中,混合溶液中还加入质量百分比浓度为0.05-2.5%透明质酸和浓度为5mg/mL-40 mg/mL硫酸软骨素两者中的至少一种。
进一步地,制备抗菌支架步骤之后先进行交联步骤获得具有良好力学性能的抗菌支架后再进行制备抗菌生物活性支架步骤,交联步骤包括化学交联工艺,化学交联工艺具体如下:以戊二醛、京尼平、碳化二亚胺中的一种或多种溶于水中配制出质量百分比浓度为0.1-1%的交联剂溶液,把制备好的抗菌支架浸渍在交联剂溶液中进行室温交联8-24h,然后依次用生理盐水和蒸馏水浸泡清洗除去残留的交联剂,清洗后的抗菌支架再依次经过零下20-80℃的冷冻处理和零下40-60℃条件下的冷冻干燥。
进一步地,交联步骤还包括高温交联工艺,高温交联工艺具体如下:将抗菌支架放置在真空干燥箱中,在真空条件下,温度为105℃,高温交联24小时后恢复至室温。
进一步地,制备抗菌生物活性支架步骤中,按照0.5-2mg载有活性因子的明胶微球置于0.2-1mL生理盐水的比例配制成悬浮液,采用注射器将悬浮液注入抗菌支架。
采用上述技术方案后,本发明至少具有如下有益效果:本发明以纯天然高分子为原料并复合纳米银粒子制备出支架,而且还加载有生物活性因子,使制得的支架具有充分的生物活性,能有效促进新生组织的血管化,而且还具有足够的抗菌能力,可用于皮肤损伤修复。而通过加入制孔剂控制多孔明胶微球的微孔孔径大小以及交联处理可提高支架的力学性能。
附图说明
图1是本发明抗菌生物活性支架制备方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互结合。
请参考图1所示,本发明提供一种抗菌生物活性支架,其原料包括支架主体材料、抗菌成分和活性因子,所述支架主体材料为如下材料成分中的至少一种:明胶、胶原、壳聚糖和丝素蛋白;所述抗菌成分为纳米银粒子;所述活性因子为如下生长因子中的至少一种:碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)和转化生长因子(TGFβ)。此外,抗菌生物活性支架还可包括透明质酸和硫酸软骨素中的至少一种。
另一方面,本发明还提供上述抗菌生物活性支架的制备方法,包括如下步骤:
制备明胶微球步骤,制备实心明胶微球;
制备多孔明胶微球步骤,将实心明胶微球制成多孔明胶微球;
加载活性因子步骤,将浓度为0.01-150ug/ul的活性因子水溶液滴加到多孔明胶微球上,活性因子水溶液的滴加量优选为每2mg多孔明胶微球滴加20ul含有活性因子水溶液,滴加完成后在室温下静置,使活性因子溶液充分浸渍到干燥的微球上,获得载有活性因子的明胶微球;
制备抗菌支架步骤,向成分为醋酸或丙二酸的溶剂中加入胶原、壳聚糖和丝素蛋白中的至少一种以及纳米银粒子,制得混合溶液,优选地,所加入的胶原、壳聚糖和丝素蛋白的总质量百分比浓度为0.01-1%,纳米银粒子质量百分比浓度为40-100ppm,此外,还可根据需要选择性地加入质量百分比浓度为0.05-2.5%透明质酸和浓度为5mg/mL-40
mg/mL硫酸软骨素两者中的至少一种,然后,将实心明胶微球平铺在模具中,用蒸汽熏蒸10-30min,再按照实心明胶微球与胶原、壳聚糖和丝素蛋白三者用量总和的质量比为:3-5:1的比例将混合溶液注入模具中,并迅速把模具放入超低温冰箱里冷冻24-48h,再冷冻干燥得到抗菌支架;
交联步骤,可以采用化学交联工艺或者化学交联和高温交联的组合进行处理,化学交联工艺具体如下:以戊二醛、京尼平、碳化二亚胺中的一种或多种溶于水中配制出质量百分比浓度为0.1-1%的交联剂溶液,把制备好的抗菌支架浸渍在交联剂溶液中进行室温交联8-24h,然后依次用生理盐水和蒸馏水浸泡清洗除去残留的交联剂,清洗后的抗菌支架再依次经过零下20-80℃的冷冻处理和零下40-60℃条件下的冷冻干燥。高温交联工艺具体如下:将抗菌支架放置在真空干燥箱中,在真空条件下,温度为105℃,高温交联24小时后恢复至室温。本步骤主要目的是使明胶与胶原形成相互贯穿的网络结构,得到具有良好力学性能的抗菌支架,获得力学性能良好的抗菌支架,对于在力学性能方面没有很高要求的支架产品也可以不进行本步骤;以及
制备抗菌生物活性支架步骤,将载有活性因子的明胶微球置于生理盐水中配制成悬浮液,优选地,按照0.5-2mg载有活性因子的明胶微球置于0.2-1mL生理盐水的比例配制成悬浮液,然后将悬浮液注入抗菌支架中,具体可采用注射器将悬浮液注入抗菌支架,室温干燥后得到抗菌生物活性支架。
其中,本发明制备明胶微球步骤的具体操作如下:将明胶加入蒸馏水中,在40-50℃恒温水浴中溶解1h,配制质量百分比为2-40%的明胶溶液,同时取200-400mL油放在40-50℃恒温水浴中,所述的油优选植物油或者硅油;然后在200-500 rpm转速下把明胶溶液滴入到油中,搅拌约10min即可形成均匀的混合乳液,再把混合乳液从恒温水浴的温度阶梯式逐渐降温到0℃,每降10℃恒温15min,再加入80-200mL 4℃的丙酮,转速250-800rpm下继续搅拌1h,用丙酮清洗后3000-4000rpm离心收集,最后用环氧乙烷浸泡2天,一天换三次溶剂,再用去离子水洗涤后,冷冻干燥2天,最后用筛子筛选粒径为80-400μm的实心明胶微球。
本发明制备多孔明胶微球步骤的具体操作如下:将实心明胶微球浸渍在质量百分比浓度为0.1-2%的戊二醛和吐温80的混合溶液中,在25℃- 0℃的温度条件下交联8-24h,混合溶液中,吐温80的质量百分比浓度为0.05-2%,然后置入含有质量百分比浓度为0.05-2%的甘氨酸的和质量百分比浓度为0.05-2%的吐温80的混合溶液中,在37℃的条件下静置15~30分钟后取出明胶微球,再用质量百分比0.1%吐温80溶液于4000 rpm离心处理5分钟,然后在4℃下洗涤后冷冻干燥,获得多孔明胶微球。
应当理解,制备明胶微球及对明胶微球进行多孔化处理而获得多孔明胶微球方面已有相当成熟的技术,本发明可采用现有各种技术来获得多孔明胶微球。
本发明的支架中含有纳米银粒子,可使支架具有良好的抗菌性;而加载有活性生长因子,而可使制得的支架具有充分的生物活性,能有效促进新生组织的血管化;而采用多孔明胶微球,更有利于载生物因子;明胶及胶原等天然高分子通过交联剂处理后,力学性能得到提高,同时明胶微球再清洗过程中不可能完全清洗干净,有部分残留,在交联过程中与胶原等天然高分子形成网络贯穿的结构,这样更能提高力学性能。由于明胶无毒,生物相容性好,它的残留更有利于细胞的粘附及增值。4)硫酸软骨素和透明质酸作为辅助性的添加物,根据需要而加入到混合溶液中,由于他们都是细胞外基质的必要成分,也是细胞的营养成分,这样更加模拟了细胞的生长环境。
下面通过几个具体实施例来详细说明本发明制备方法的具体过程。
实施例1
1、明胶微球的制备
取两份质量的明胶,加入八份质量的蒸馏水,配制成质量百分比浓度为20%的明胶,在42℃恒温水浴中溶解1h,同时取300mL大豆油放在42℃的水浴中,然后在450 rpm转速下把明胶溶液滴入到油中,搅拌10min形成水/油乳液,再把混合乳液从42℃逐渐降温到0℃,每降10℃恒温15min,再加入200mL、4℃的丙酮,转速调到600rpm,继续搅拌1h,用丙酮清洗在3200rpm离心收集,最后用环氧乙烷浸泡2天,一天换三次溶剂,再用去离子水洗涤后,然后冷冻干燥2天,最后用筛子筛选粒径为80-400μm的明胶微球。
2、多孔明胶微球的制备
把制备好的明胶微球浸渍在溶质的总质量百分比浓度为1%的戊二醛/吐温80的混合溶液中,其中吐温80的质量百分比为0.1%,交联温度为4℃,交联时间为12h。然后加入一定量的甘氨酸/吐温80混合溶液,甘氨酸的质量百分比为1%,其中吐温80的质量百分比为0.1%。在37℃的条件下静置一段时间,用质量百分比0.1%吐温80溶液于4000 rpm,离心5分钟,在4℃下洗涤两次,并冷冻干燥。
3、加载碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)
滴加20ul浓度为100ug/uL,含有bFGF的水溶液到2mg冻干的明胶微球上,然后在室温下静置30min,让因子溶液充分浸渍到干燥的微球上,获得活性因子溶液浸渍明胶微球。
4、抗菌胶原/透明质酸支架的制备
用醋酸配制浓度为0.6%的胶原溶液,然后配制浓度为0.1%透明质酸溶液,混合两种溶液,使混合液的粘度系数在2500cp,并加入浓度为40-100ppm纳米银粒子。取一定量的实心明胶微球平铺在模具中,用蒸汽熏蒸30min后将配制好的混合溶液注入模具中,按照明胶与胶原的质量比为4.5:1的比例注入混合溶液,然后迅速把模具放入超低温冰箱里冷冻24h,然后冷冻干燥,得到抗菌支架。
5、交联处理
配制交联剂的浓度为1%的戊二醛溶液,把制备好的抗菌支架浸渍在交联剂溶液中进行室温交联12h,然后再生理盐水中浸泡24小时,不断清洗,最后用蒸馏水进行清洗24小时,不断换水;除去样品中残留的交联剂。再进行清洗完样品后在零下20-80℃冷冻2小时,然后在零下40-60℃条件下冷冻干燥得具有良好力学性能的抗菌支架。
6、载bFGF生长因子抗菌胶原生物活性支架的制备
把0.5mg载bFGF的明胶微球置于1mL的生理盐水中,配制载因子明胶微球的悬浮液,然后用2mL注射器把悬浮液注入到抗菌支架中,然后室温干燥24h。
实施例2
1、明胶微球的制备
取四份质量的明胶,加入六份质量的蒸馏水,配制成质量百分比为40%的明胶溶液,在50℃恒温水浴中溶解1h,同时取300mL硅油放在50℃的水浴中,然后在450 rpm转速下把明胶溶液滴入到油中,搅拌10min形成水/油乳液,再把混合乳液从50℃逐渐降温至0℃,每降10℃恒温15min,再加入200mL、4℃的丙酮,转速调到600rpm,继续搅拌1h,用丙酮清洗在3200rpm离心收集,最后用环氧乙烷浸泡2天,一天换三次溶剂;再用去离子水洗涤后,然后冷冻干燥2天,最后用筛子筛选粒径为80-400μm的明胶微球。
2、加载血管内皮细胞生长因子(VEGF)
滴加20ul浓度为50ug/uL含有VEGF的水溶液到2mg冻干的明胶微球上,然后在室温下静置30min,让因子溶液充分浸渍到干燥的微球上,最终可获得活性因子溶液浸渍明胶微球。
3、抗菌胶原/透明质酸/硫酸软骨素支架的制备
用醋酸配制浓度为0.8%的胶原溶液,配制浓度0.1%为透明质酸溶液,同时配制浓度为5mg/mL的硫酸软骨素溶液,混合三种溶液使混合液的粘度系数在2000cp,并加入浓度为40-100ppm纳米银粒子;将一定量的实心明胶微球平铺在模具中,然后用蒸汽熏蒸30min,然后将配制好的混合溶液注入模具中,按照明胶与胶原的质量比为4:1的比例注入混合溶液,迅速把模具放入超低温冰箱里冷冻24h,然后冷冻干燥得到抗菌支架。
4、交联处理
把制备的支架放置在真空干燥箱中,在真空条件下,温度为105℃,高温交联24小时;然后配制交联剂的浓度为0.5%的京尼平溶液,把制备好的支架材料浸渍在交联剂溶液中进行室温化学交联12h,然后再生理盐水中浸泡24小时,不断清洗,最后用蒸馏水进行清洗24小时,不断换水;除去样品中残留的交联剂。再进行清洗完样品后在零下20-80℃冷冻2小时,然后在零下40-60℃条件下冷冻干燥得抗菌生物活性支架。
5、载VEGF生长因子抗菌胶原生物活性支架的制备
把1mg载VEGF的明胶微球置于1mL的生理盐水中,配制载因子明胶微球的悬浮液,然后用2mL注射器把悬浮液注入到抗菌支架中,然后室温干燥24h。
实施例3
制备明胶微球及多孔明胶微球的具体实施步骤同实施例1中的步骤。其他步骤如下:
1、加载转化生长因子(TGFβ)
滴加20ul浓度为50ug/uL含有TGFβ的水溶液到2mg冻干的明胶微球上,然后在室温下静置30min,让因子溶液充分浸渍到干燥的微球上,获得活性因子溶液浸渍明胶微球。
2、抗菌丝素蛋白复合硫酸软骨素支架的制备
用醋酸配制浓度为1%的丝素蛋白溶液,同时配制浓度为5mg/mL的硫酸软骨素溶液,混合三种溶液使混合液的粘度系数在2500cp,并加入浓度为40-100ppm纳米银粒子。将一定量的实心明胶微球平铺在模具中,然后用蒸汽熏蒸30min,然后将配制好的混合溶液注入模具中,迅速把模具放入超低温冰箱里冷冻24h,然后冷冻干燥,其中明胶与丝素蛋白质量比为5:1。
3、交联处理
把制备的支架放置在真空干燥箱中,在真空条件下,温度为105℃,高温交联24小时;然后配制交联剂的浓度为1%的戊二醛溶液,把制备好的支架材料浸渍在交联剂溶液中进行室温化学交联12h,然后再生理盐水中浸泡24小时,不断清洗,最后用蒸馏水进行清洗24小时,不断换水;除去样品中残留的交联剂。再进行清洗完样品后在零下20-80℃冷冻2小时,然后在零下40-60℃条件下冷冻干燥得抗菌生物活性支架。
4、载血转化生长因子(TGFβ)生长因子抗菌胶原生物活性支架的制备
把1mg载TGFβ因子的明胶微球置于0.5mL的生理盐水中,配制载因子明胶微球的悬浮液,然后用2mL注射器把悬浮液注入到抗菌支架中,然后室温干燥24h。
实施例4
制备明胶微球及多孔明胶微球的具体实施步骤同实施例1中的步骤。其他步骤如下:
1、加载血小板衍生因子(PDGF)和转化生长因子(TGFβ)
滴加20ul浓度为50ug/uL含有PDGF和TGFβ(PDGF:TGFβ=1:1)的水溶液到2mg冻干的明胶微球上,然后在室温下静置30min,让因子溶液充分浸渍到干燥的微球上,获得活性因子溶液浸渍明胶微球。
2、抗菌胶原-壳聚糖复合硫酸软骨素支架的制备
用丙二酸配制浓度为0.8%的胶原溶液和浓度为2%的壳聚糖溶液,同时配制浓度为5mg/mL的硫酸软骨素溶液,混合三种溶液使混合液的粘度系数在2000cp,并加入浓度为40-100ppm纳米银粒子;将一定量的实心明胶微球平铺在模具中,然后用蒸汽熏蒸30min,然后按照明胶与胶原-壳聚糖的质量比为4.5:1的比例将配制好的混合溶液注入模具中,迅速把模具放入超低温冰箱里冷冻24h,然后冷冻干燥得到抗菌支架。
3、交联处理
配制交联剂的浓度为1%的戊二醛溶液,把制备好的支架材料浸渍在交联剂溶液中进行室温化学交联12h,然后再生理盐水中浸泡24小时,不断清洗,最后用蒸馏水进行清洗24小时,不断换水,以除去样品中残留的交联剂;样品清洗完后在零下20-80℃冷冻2小时,然后在零下40-60℃条件下冷冻干燥。然后再将冷冻干燥后的抗菌支架放置在真空干燥箱中,在真空条件下,温度为105℃,高温交联24小时后恢复至室温,即得到具有良好力学性能的抗菌支架。
4、载血小板衍生因子(PDGF)和转化生长因子(TGFβ)生长因子抗菌胶原生物活性支架的制备
把2mg载PDGF 和TGFβ的明胶微球置于0.2mL的生理盐水中配制悬浮液,然后用2mL注射器把悬浮液注入到抗菌支架中,然后室温干燥24h。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同范围限定。
Claims (10)
1.一种抗菌生物活性支架,其特征在于,是由载有活性因子的多孔明胶微球的生理盐水悬浮液注入抗菌支架中而成;其原料包括支架主体材料、抗菌成分和活性因子,所述支架主体材料为明胶、胶原、壳聚糖和丝素蛋白;所述抗菌成分为纳米银粒子;所述抗菌支架是由实心明胶微球与胶原、壳聚糖和丝素蛋白三者用量总和的质量比为:3-5:1的比例以及纳米银粒子制成;所述活性因子为如下生长因子中的至少一种:碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生因子和转化生长因子。
2.如权利要求1所述的抗菌生物活性支架,其特征在于,抗菌生物活性支架还包括透明质酸和硫酸软骨素中的至少一种。
3.一种如权利要求1或2所述的抗菌生物活性支架的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
制备明胶微球步骤,制备实心明胶微球;
制备多孔明胶微球步骤;
加载活性因子步骤,将浓度为0.01-150ug/ul的活性因子水溶液滴加到多孔明胶微球上,然后在室温下静置,使活性因子溶液充分浸渍到干燥的微球上,获得载有活性因子的明胶微球;
制备抗菌支架步骤,向成分为醋酸或丙二酸的溶剂中加入胶原、壳聚糖和丝素蛋白以及纳米银粒子,制得混合溶液,然后,将实心明胶微球平铺在模具中,用蒸汽熏蒸10-30min,再按照实心明胶微球与胶原、壳聚糖和丝素蛋白三者用量总和的质量比为:3-5:1的比例将混合溶液注入模具中,并迅速把模具放入超低温冰箱里冷冻24-48h,再冷冻干燥得到抗菌支架;
进行交联处理的步骤,以获得具有良好力学性能的抗菌支架;以及
制备抗菌生物活性支架步骤,将载有活性因子的明胶微球置于生理盐水中配制成悬浮液,然后将悬浮液注入抗菌支架中,室温干燥后得到抗菌生物活性支架。
4.如权利要求3所述的抗菌生物活性支架制备方法,其特征在于,制备明胶微球步骤的具体操作如下:将明胶加入蒸馏水中,在40-50℃恒温水浴中溶解1h,配制质量百分比为2-40%的明胶溶液,同时取200-400mL油放在40-50℃恒温水浴中;然后在200-500 rpm转速下把明胶溶液滴入到油中形成均匀的混合乳液,再把混合乳液从恒温水浴的温度阶梯式逐渐降温到0℃,每降10℃恒温15min,再加入80-200mL 4℃的丙酮,转速250-800rpm下继续搅拌1h,用丙酮清洗后3000-4000rpm离心收集,最后用环氧乙烷浸泡2天,一天换三次溶剂,再用去离子水洗涤后,冷冻干燥2天,最后用筛子筛选粒径为80-400μm的实心明胶微球。
5.如权利要求3或4所述的抗菌生物活性支架制备方法,其特征在于,制备多孔明胶微球步骤的具体操作如下:将实心明胶微球浸渍在质量百分比浓度为0.1-2%的戊二醛和吐温80的混合溶液中,在25℃- 0℃的温度条件下交联8-24h,混合溶液中,吐温80的质量百分比浓度为0.05-2%,然后置入含有质量百分比浓度为0.05-2%的甘氨酸的和质量百分比浓度为0.05-2%的吐温80的混合溶液中,在37℃的条件下静置15-30分钟后取出明胶微球,再用质量百分比0.1%吐温80溶液于4000 rpm离心处理5分钟,然后在4℃下洗涤后冷冻干燥,获得多孔明胶微球。
6.如权利要求3所述的抗菌生物活性支架制备方法,其特征在于,制备抗菌支架步骤中,制得的混合溶液中,所加入的胶原、壳聚糖和丝素蛋白的总质量百分比浓度为0.01-1%,纳米银粒子质量百分比浓度为40-100ppm。
7.如权利要求3或6所述的抗菌生物活性支架制备方法,其特征在于,制备抗菌支架步骤中,混合溶液中还加入质量百分比浓度为0.05-2.5%透明质酸和浓度为5mg/mL-40 mg/mL硫酸软骨素两者中的至少一种。
8.如权利要求3所述的抗菌生物活性支架制备方法,其特征在于,制备抗菌支架步骤之后的交联处理步骤包括化学交联工艺,化学交联工艺具体如下:以戊二醛、京尼平、碳化二亚胺中的一种或多种溶于水中配制出质量百分比浓度为0.1-1%的交联剂溶液,把制备好的抗菌支架浸渍在交联剂溶液中进行室温交联8-24h,然后依次用生理盐水和蒸馏水浸泡清洗除去残留的交联剂,清洗后的抗菌支架再依次经过-20~-80℃的冷冻处理和-40~-60℃条件下的冷冻干燥。
9.如权利要求8所述的抗菌生物活性支架制备方法,其特征在于,交联步骤还包括高温交联工艺,高温交联工艺具体如下:将抗菌支架放置在真空干燥箱中,在真空条件下,温度为105℃,高温交联24小时后恢复至室温。
10.如权利要求3所述的抗菌生物活性支架制备方法,其特征在于,制备抗菌生物活性支架步骤中,按照0.5-2mg载有活性因子的明胶微球置于0.2-1mL生理盐水的比例配制成悬浮液,采用注射器将悬浮液注入抗菌支架。
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