BRPI0615905A2

BRPI0615905A2 - substrato para regeneração de tecido

Info

Publication number: BRPI0615905A2
Application number: BRPI0615905-2A
Authority: BR
Inventors: Yoshito Ikada; Shigehiko Suzuki; Yoshitake Takahashi; Kenji Tomihata; Tsuguyoshi Taira
Original assignee: Gunze Kk
Priority date: 2005-09-09
Filing date: 2006-09-05
Publication date: 2011-05-31
Also published as: EP1923078A4; CA2619785A1; WO2007029677A1; JP2007068884A; AU2006288336B2; EP1923078B1; KR20080042151A; JP5008284B2; AU2006288336A1; KR101224927B1; US8889171B2; CA2619785C; CN101257933A; BRPI0615905B8; EP1923078A1; BRPI0615905B1; US20090143287A1

Abstract

SUBSTRATO PARA REGENERAçãO DE TECIDO A presente invenção refere-se a um substrato para a regeneração de tecido que tem a capacidade de liberar um fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) e fatores de crescimento de células similares em uma maneira de liberação continuada, dentro do qual as células podem entrar com facilidade, e que é usado de forma adequada para a regeneração de tecidos. Especificamente, a presente invenção refere-se um substrato para a regeneração de tecido que compreende um fator de crescimento de célula adsorvido em um substrato poroso bioabsorvível que contém coláge- no e gelatina, e um método para a produção do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SUBSTRATO PARA REGENERAÇÃO DE TECIDO".

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um substrato para a regenera-ção de tecido. Especificamente, a presente invenção refere-se a um substra-to de derme artificial, etc., para uso na regeneração de tecidos da pele emescaldaduras/queimaduras, lesões e imperfeições (defeitos) agudas da peledo mesmo tipo; e úlceras de decúbito e imperfeições (defeitos) crônicas dapele do mesmo tipo.

Antecedentes da Técnica

Se o defeito da pele cobre uma área larga, o defeito deve sertratado no estágio inicial. Um método para a regeneração da pele para a ci-catrização de um defeito envolve tecidos artificiais de derme sendo regene-rados in vivo através do implante de uma esponja de colágeno, que funcionacomo um andaime, no corpo sem a semeadura de células (isso é referidocomo um método de produção de uma derme artificial). O método de produ-ção de uma derme artificial requer enxertos de pele de espessura fina dividi-da ou o transplante de uma epiderme cultivada depois da regeneração detecidos do tipo da derme. Em ambos os casos, a regeneração dos compo-nentes da derme deve ser executada tão cedo quanto possível.

Um método de produção padrão de derme artificial envolve aobtenção de uma esponja de colágeno através de secagem por congela-mento, e com a finalidade de controlar as taxas de degradação e de absor-ção in vivo, um tratamento de reticulação é usualmente realizado.

Um método para a promoção de regeneração de tecido da peleenvolve a aplicação de um fator de crescimento, tal como um fator de cres-cimento de fibroblasto básico (bFGF), à superfície da pele. Este método éum tanto quanto efetivo devido ao fator de crescimento aplicado que podeser absorvido através da pele. No entanto, a aplicação tem que ser realizadaem todos os dias com a finalidade de manter o efeito. Por esse motivo, di-versas tentativas têm sido feitas para encontrar um método de manter o efei-to com somente a administração em uma vez pela liberação continuada dosfatores de crescimento.

Por exemplo, Kawai et al., descreve que através da infusão deuma microesfera de gelatina impregnada com bFGF em uma pele artificial, aliberação continuada de bFGF e a construção dos tecidos da pele in vivopode ser promovida (Documento Não Patente 1). Além disso, quando umacélula de uma pele cultivada do tipo semeada é preparada, a constituiçãodos tecidos é promovida através da adição de uma microesfera de gelatinaimpregnada com bFGF (Documento Não Patente 2).

No entanto, esses métodos requerem a impregnação de bFGFem uma microesfera, e ainda a infusão da microesfera assim preparada nointerior de uma derme artificial em um local clínico, em uma operação com-plicada. ·

Se for possível conferir à própria pele artificial com a capacidadede liberar um fator de crescimento em uma maneira contínua, o único proce-dimento necessário em um local clínico é o da aplicação do fator de cresci-mento à derme artificial, simplificando grandemente o processo.

O fator de crescimento de célula usado de forma mais ampla noscampos clínicos atuais é o fator de crescimento de fibroblasto básico(bFGF). O bFGF tem um ponto isoelétrico de 9,6 e pode aderir a uma gelati-na que tenha um ponto isoelétrico de, por exemplo, 5,0 através de interaçãoelétrica. Pela utilização de tais características, é possível a liberação dobFGF in vivo de uma maneira continuada com o tempo utilizando uma mi-croesfera com bFGF absorvido, que pode ser preparada através da impreg-nação de uma microesfera feita de gelatina acida (que tenha um ponto isoe-létrico de 5,0) com b GFG (Documento de Patente 1, e Documento não Pa-tente 3).

No entanto, esse método requer manipulação, por exemplo, fa-zendo o bFGF ser absorvido em uma microesfera particulada, e em seguidafazendo a infusão da microesfera com o b FGF obtida dessa forma em umsubstrato. Isso torna o método complicado e difícil de ser usado em um localclínico.

Se for preparado um material de derme artificial através de fazercom que o bFGF seja absorvido em uma gelatina ácida, na qual o bFGF éabsorvido com facilidade, um substrato que tenha uma capacidade de libe-ração continuada pode ser obtido. No entanto, a gelatina é inferior ao colá-geno in vivo em termos de facilidade de infiltração de célula, etc., e por essarazão ela não é adequada para a regeneração de tecidos. Por conseqüên-cia, é procurado um substrato que possa adsorver uma quantidade adequa-da de bFGF no qual as células em torno possam entrar com facilidade.

O Documento de Patente 2 descreve um dispositivo médico quecontém gelatina e colágeno como os componentes essenciais, e que é irra-diado com ultravioleta para ser reticulado. O substrato médico é usado deforma adequada como um veículo de cultura de células, para o cultivo depele, etc.

Documento de Patente 1: Publicação de Patente Japonês NãoExaminada N5 2003-325652.

Documento de Patente 2: Publicação de Patente Japonês NãoExaminada Ns 1999-47258.

Documento Não Patente 1: K; Kawai et al., Biomaterials, Vol. 21,págs. 489 a 199 (2000).

Documento Não Patente 2: Saso et al., Japanese Journal ofBurn Injuries, Vol. 29, págs. 24 a 30.

Documento Não Patente 3: Y. Tabala et al., J. Controlled relea-se, Vol. 312, págs. 189 a 1099 (1994)

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

PROBLEMA A SER SOLUCIONADO PELA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é o de prover um substratopara a regeneração de tecido que tenha a capacidade de liberar um fator decrescimento de fibroblasto básico (bFGF) e células de fatores de crescimen-to do mesmo tipo de uma maneira contínua, dentro dos quais as célulaspossam entrar com facilidade e que sejam adequados para serem usados naregeneração de tecidos.

MEIOS PARA A SOLUÇÃO DO PROBLEMA

Os presentes inventores realizaram uma pesquisa extensa paraa solução dos problemas acima e descobriram que um substrato, que é obti-do pela fabricação de um substrato poroso bioabsorvível que contenha colá-geno e gelatina para adsorver o bFGF, é usado de forma adequada comoum substrato para a regeneração de tecidos para a regeneração de tecidosda pele, devido ao substrato exibir uma excelente capacidade de liberarbFGF de uma maneira continuada, e o substrato permitir que células entremcom facilidade no interior do mesmo. A presente invenção foi conseguidacom base nessa descoberta em estudos adicionais.

Especificamente a presente invenção proporciona os substratosde regeneração de tecidos e os processos de produção como abaixo:

Item 1. Um substrato para a regeneração de tecido compreen-dendo um substrato poroso bioabsorvível que contém colágeno e gelatina, osubstrato poroso bioabsorvível tendo um fator de crescimento de célula den-tro do mesmo.

Item 2. Um substrato para a regeneração de tecido de acordocom o Item 1, no qual o conteúdo de gelatina no substrato poroso bioabsor-vível é de 1 até 70% em peso.

Item 3. Um substrato para a regeneração de tecido de acordocom os Itens 1 ou 2, no qual o fator de crescimento de célula é um fator decrescimento de fibroblasto básico (bFGF).

Item. 4. Um substrato para a regeneração de tecido de acordocom qualquer um dos Itens de 1 a 3, no qual a quantidade do fator de cres-cimento de célula liberada para o tampão de solução salina com fosfato(PBS) depois de ser imerso no PBS a 37°C durante três dias não é maior doque 7% em peso da quantidade total de fator de crescimento de célula inici-almente contido no substrato de regeneração de tecido.

Item 5. Um substrato para a regeneração de tecido de acordocom qualquer um dos Itens de 1 a 4, no qual a quantidade do fator de cres-cimento de célula liberada para o tampão de solução salina com fosfato(PBS) depois de ser imerso no PBS a 37°C durante três dias não é maior doque 15% em peso da quantidade total de fator de crescimento de célula ini-cialmente contido no substrato de regeneração de tecido.Item 6. Um substrato para a regeneração de tecido de acordocom qualquer um dos Itens de 1 a 5, que tem poros com uma estrutura inter-conectada tendo um diâmetro médio de poros de 10 até 500 μιτι.

Item 7. Um substrato para a regeneração de tecido de acordocom qualquer um dos Itens de 1 a 6, que é degradado e absorvido in vivodentro de três semanas.

Item 8. Um método para a produção de um substrato para a re-generação de tecido que compreende as etapas de:

secagem por congelamento de uma mistura aquosa que contémcolágeno e gelatina;

submissão a substância secada por congelamento obtida dessaforma à reticulação; e

preparação da substância reticulada para conter um fator decrescimento de célula.

A presente invenção é explicada em detalhe abaixo.

I. Substrato de Regeneração de Tecido.

O substrato de regeneração de tecido da presente invençãocompreende um fator de crescimento de célula em um substrato poroso bio-absorvível contendo colágeno e gelatina. O substrato de regeneração detecido da presente invenção é um substrato amplamente usado na engenha-ria de tecidos, por exemplo, um substrato para ser usado na regeneração depele, osso, cartilagem, miocárdio e/ou gordura. Especificamente ele é usadode forma adequada como um substrato para a regeneração de tecido para apele (derme), isto é, um substrato de derme artificial.

O substrato poroso bioabsorvível usado como o substrato para aregeneração de tecido da presente invenção contém colágeno e gelatinacomo os componentes essenciais.

Não existe limitação com relação à gelatina, e os exemplos quepodem ser usados incluem aqueles derivados a partir de osso, tendão, peleetc., de gado, porcos, frangos, salmão e similares. É de preferência que agelatina tenha sido submetida a um tratamento ácido ou a um tratamentoalcalino. A gelatina com tratamento ácido tem uma carga positiva, enquantoque a gelatina com tratamento alcalino tem uma carga negativa. Com a utili-zação dessas cargas elétricas, diversos tipos de fatores de crescimento decélula podem ser imobilizados eletricamente, sem desnaturação, em umsubstrato poroso bioabsorvível que contenha gelatina com uma carga elétri-ca positiva ou negativa. Isso consegue uma liberação continuada dos fatoresde crescimento de célula (por exemplo, o bFGF).

Não existe limitação com relação ao colágeno, e os exemplosque podem ser usados incluem aqueles derivados a partir de pele, tendão,etc., de bovinos, porcos, etc. Com a finalidade de eliminar a capacidade deformação de antígenos e aumentar a segurança, o atelocolageno, que é ob-tido através do tratamento do colágeno com prótese, pepsina e enzimas si-milares para a eliminação dos telopeptídios o tanto quanto possível, é o depreferência. O atelocolageno pode ser categorizado nos tipos de I a IV, epode ser selecionado dependendo do uso do substrato. Quando o substratoé usado para pele cultivada ou curativo de lesão, o tipo I ou Il é preferível, namedida em que eles têm componentes constituintes similares àqueles daderme. Por fazer um substrato poroso bioabsorvível que contém o colágeno,as células podem entrar com facilidade no substrato.

O conteúdo de gelatina no substrato poroso bioabsorvível é emgeral de cerca de 1% em peso até cerca de 70% em peso, de preferência decerca de 20% em peso até cerca de 60% em peso, e de mais preferência decerca de 30% em peso até 50% em peso. Se o conteúdo de gelatina é inde-vidamente grande, é difícil para os tecidos circundantes entrar no substratoporoso bioabsorvível. Em contraste, se o conteúdo de gelatina é indevida-mente pequeno, não pode ser obtida uma capacidade de liberação continu-ada suficiente uma vez que a adesão entre a gelatina e os fatores de cres-cimento de célula através da interação eletrostática se torna fraca. Se o con-teúdo de gelatina cai dentro das faixas acima, as capacidades da gelatina edo colágeno podem ser totalmente exploradas, e pode ser obtido um grandeefeito terapêutico.

Devido ao substrato poroso bioabsorvível funcionar como umsubstrato para a regeneração de tecidos tridimensionais, é de preferênciaque o substrato poroso bioabsorvível tenha uma estrutura porosa, e que te-nha muitos poros interconectados (poros pequenos contínuos) é de prefe-rência específica. Através do emprego de tal estrutura, quando as célulassão semeadas no substrato de regeneração de tecido da presente invenção,as células podem entrar e aderir aos poros pequenos e se prolongarem deforma tridimensional; e quando o substrato é implantado sem a semeadurade células no mesmo, as células circundantes podem entrar com facilidadeno substrato. Além do mais, esta estrutura torna possível suprir uma nutriçãosuficiente para as células aderentes e proliferar e diferenciar as células nor-malmente.

O diâmetro médio dos poros pequenos no substrato poroso bio-absorvível pode ser selecionado de forma adequada dependendo do tecidoou do órgão a ser regenerado, porém é de preferência de cerca de 10 μιτιaté cerca de 500 μηη, e de mais preferência de cerca de 50 μιτι até cerca de300 μιτι. Se o diâmetro médio de poros é menos do que 10 μηη, a capacida-de de adesão celular pode ser marcadamente reduzida, uma vez que as cé-lulas não podem entrar no substrato poroso bioabsorvível, ou as células ade-rentes podem não ser capazes de se prolongar de forma tridimensional. Se odiâmetro médio de poros exceder a 500 μιη, a densidade das células se tor-na muito baixa, e os tecidos ou órgão podem não ser capazes de se regenerar.

A estrutura porosa do substrato poroso bioabsorvível acimamencionada é diretamente herdada para o substrato para a regeneração detecido da presente invenção.

O substrato para a regeneração de tecido da presente invençãocompreende fatores de crescimento de célula em um substrato poroso bio-absorvível que contém colágeno e gelatina. Não existe limitação com relaçãoaos fatores de crescimento de células, contanto que eles promovam a vas-cularização e aumentem a atividade das células. Os exemplos dos mesmosincluem os fatores de crescimento de células que tenham uma ação de vas-cularização, tais como o fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF),um fator de crescimento de fibroblasto ácido (aFGF), um fator de crescimen-to de vascularização de célula endotelial (VEGF), um fator de crescimentode hapatócito (HGF), um fator de crescimento derivado do plasma (PDGF),angiopoietina, e um fator de crescimento de transformação. A modalidadepreferível da presente invenção é o bFGF.

Não existe limitação com relação ao conteúdo do fator de cres-cimento de células no substrato de regeneração de tecido da presente in-venção e pode ser selecionado de forma adequada dependendo dos tecidose similares a serem regenerados. De preferência ele cai dentro da faixa apartir de cerca de 0,1 μg até cerca de 100 μg, e de mais preferência a partirde cerca de 1 μg até cerca de 50 μg por 1 m2 do substrato.

O substrato de regeneração de tecido da presente invenção temuma excelente capacidade de liberar de forma estável os fatores de cresci-mento de célula de uma maneira continuada durante um longo período detempo. Por exemplo, o bFGF promove a vascularização e aumenta a ativi-dade das células, porém ele é instável in vivo e não pode alcançar os efeitosbiológicos esperados, quando usado em uma solução aquosa. No entanto,quando o substrato poroso bioabsorvível acima mencionado contém umaquantidade predeterminada de bFGF, a ação do bFGF pode ser mantida deforma estável através da liberação de uma maneira continuada.

O substrato de regeneração de tecido da presente invenção temuma característica distinta, por exemplo, a quantidade de fator de crescimen-to de célula liberada para o tampão salino de fosfato (PBS) depois da imer-são em PBS a 37°C durante três dias não é maior do que 7% em peso daquantidade total do fator de crescimento de célula inicialmente contido nosubstrato de regeneração de tecido (de preferência não maior do que 6% empeso). A quantidade do fator de crescimento de célula liberada para o PBSdepois de ser imerso no PBS a 37°C durante sete dias não é maior do que15% em peso da quantidade total do fator de crescimento de célula inicial-mente contido no substrato de regeneração de tecido (de preferência nãomaior do que 13% em peso). De forma específica, quando o fator de cresci-mento de célula é o bFGF, a capacidade de liberação continuada acimamencionada pode ser atingida com uma capacidade de reprodução suficien-te.

Além do mais, devido ao substrato de regeneração de tecido dapresente invenção compreender um substrato bioabsorvível que contém co-lágeno e gelatina, ele pode ser degradado e absorvido in vivo dentro de trêssemanas.

O limite mais baixo do teor de água no substrato de regeneraçãode tecido é de preferência de 90%, e o limite mais alto do mesmo é de prefe-rência de 99,8%. O teor de água do substrato poroso bioabsorvível dependedo grau de reticulação do substrato poroso bioabsorvível. Quando mais altoo grau de reticulação, mais baixo é o teor de água. Se o teor de água for demenos do que 90%, o substrato de regeneração de tecido não pode ter flexi-bilidade suficiente para ser usado em implantes. No entanto, se o teor deágua exceder a 99,8%, o substrato de regeneração de tecido obtido podenão ser capaz de manter uma resistência suficiente em uma solução de cul-tura ou de tampão. De mais preferência, o limite mais baixo do teor de águaé 95%, e o limite mais alto do mesmo é de 98%. O teor de água pode serobtido na fórmula abaixo.

Teor de água (%) = [(Ws - Wd)/Ws χ 100 (%)

Em que, Ws indica o peso (em uma base molhada) do substrato de regene-ração de tecido imerso em um a solução salina tamponada com fosfato a25°C durante uma hora, e Wd indica o peso (em uma base seca) do substra-to depois de ser completamente secado com a utilização de um secador avácuo.

II. Método para a produção de substrato para a regeneração de tecido.

O substrato para a regeneração de tecido da presente invençãoé produzido através do procedimento que compreende as etapas de secarpor congelamento uma mistura aquosa que contenha colágeno e gelatina;

reticulando a substância seca obtida dessa forma; e colocandoum fator de crescimento de célula dentro da substância reticulada.

Primeiro a gelatina e o colágeno, acima mencionados são mistu-rados para ser obtida uma solução aquosa. A solução aquosa é moldada emfluxo em um molde apropriado, e em seguida congelada a -40°C até -80°Cdurante cerca de 30 minutos até cerca de 2 horas. Essa substância congela-da é em seguida submetida à secagem por congelamento, depois do queé obtido um substrato poroso bioabsorvível esponjoso.Segundo, a substância secada por pulverização obtida dessaforma é submetida a um tratamento de reticulação para ser obtido um subs-trato poroso bioabsorvível. Não existe limitação com relação ao método paraa reticulação da substância secada por pulverização, e os exemplos dosmesmos incluem o método de reticulação por calor, método de irradiação deraios gama, método de irradiação ultravioleta, método de irradiação com fei-xe de elétrons, método de irradiação com raios-X, método de reticulaçãoquímica com a utilização de um agente de reticulação, etc. Entre esses, ométodo de reticulação química com a utilização de um agente de reticulaçãoé o de preferência específica, com a finalidade de ser alcançado um grauuniforme de reticulação através de todo o substrato.

O método de reticulação química pode ser especificamente exe-cutado através de, por exemplo, imersão da substância secada por conge-lamento em uma solução que contenha glutaraldeído ou um agente de reti-culação similar. O excesso de glutaraldeído é removido por lavagem comágua, e realizando outra secagem por pulverização, se necessária, sendoobtido por meio disso um substrato poroso bioabsorvível.

Em seguida, é adicionado um fator de crescimento de célula aosubstrato reticulado obtido. Não existe limitação com relação ao método damesma, por exemplo, uma solução aquosa que contenha o fator de cresci-mento de célula pode ser adicionada gota a gota ao substrato reticulado; osubstrato reticulado pode ser impregnado com uma solução aquosa quecontenha um fator de crescimento de célula; etc. Em seguida, uma etapaadicional de secagem pode ser executada, se necessária.

EFEITO DA INVENÇÃO

O substrato de regeneração de tecido da presente invenção (es-pecificamente substrato de derme artificial) pode liberar um fator de cresci-mento de célula de forma estável de uma maneira continuada. Além domais, uma vez que as células podem ser infiltradas com facilidade, a cicatri-zação de lesões pode ser acelerada e o tempo de tratamento pode ser mar-cadamente encurtado.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

A Figura 1 é um gráfico que exibe os resultados do Exemplo deTeste 1, em que a liberação continuada do bFGF in vitro foi examinada.

A Figura 2 exibe uma imagem de um pedaço de tecido quando oconteúdo de gelatina da esponja do Exemplo de Teste 1 é de 0% em peso.

A Figura 3 exibe uma imagem de um pedaço de tecido quando oconteúdo de gelatina da esponja do Exemplo de Teste 1 é de 10% em peso.

A Figura 4 exibe uma imagem de um pedaço de tecido quando oconteúdo de gelatina da esponja do Exemplo de Teste 1 é de 30% em peso.

A Figura 5 exibe uma imagem de um pedaço de tecido quando oconteúdo de gelatina da esponja do Exemplo de Teste 1 é de 50% em peso.

A Figura 6 exibe uma imagem de um pedaço de tecido quando oconteúdo de gelatina da esponja do Exemplo de Teste 1 é de 100% em pe-so.

MELHOR MANEIRA PARA REALIZAR A INVENÇÃO

A presente invenção é explicada em detalhe abaixo com refe-rência aos Exemplos, porém o âmbito da presente invenção não está Iimita-do a esses exemplos.

Exemplo de Teste 1

(1) Produção da esponja mista de coláaeno e de gelatina

Colágeno do tipo I derivado de tendão de porco e gelatina deri-vada de pele de porco foram misturados em uma solução aquosa. A soluçãoaquosa foi colocada em um molde e congelada à -40°C durante uma hora eem seguida secada por congelamento, obtendo uma esponja.

A reticulação com calor foi realizada através do processamentodessa esponja a 110°C sob um vácuo. Depois da reticulação com calor, aesponja foi imersa em uma solução aquosa de 0,2% de glutaraldeído e 0,05N de ácido acético para realizar a reticulação química. O excesso de gluta-raldeído foi removido pela lavagem com água, e executando uma secagempor pulverização adicional, sendo obtida uma esponja de colágeno e gelatinareticulada. A esponja reticulada obtida dessa forma foi usada em um experi-mento de liberação continuada in vitro realizado na etapa que se segue.(2) Experimento de liberação continuada in vitro

As esponjas usadas no experimento tinham um conteúdo de ge-latina de 0, 10, 30 ou 50% em peso. Cada uma dessas esponjas foi formadaem um formato tendo um diâmetro de 12 mm e uma espessura de 3 mm.Uma solução aquosa de bFGF (100 μΙ) foi adicionada às esponjas gota agota de tal modo que 40 μg de bFGF foi impregnado nas mesmas.

O experimento de liberação continuada foi executado de umamaneira tal que cada uma das esponjas foi imersa no PBS a 379C e a quan-tidade de bFGF liberada no PBS foi avaliada através de ELISA, 1, 3, 5, 7 e 9dias depois da iniciação da impregnação.

A Tabela 1 e a Figura 1 mostram a mudança na taxa de libera-ção do bFGF com a passagem do tempo quando o peso do bFGF contidoem cada esponja imediatamente depois da imersão foi determinado como100, isto é, taxa de eluição do bFGF (%).

Tabela 1

<table>table see original document page 13</column></row><table>

(3) Teste de implantação

As esponjas usadas no experimento tinham um conteúdo de ge-latina de 0, 10, 30, 50 ou 100% em peso. Cada uma dessas esponjas foiformada em um formato tendo um diâmetro de 12 mm e uma espessura de 3mm. Uma solução aquosa de bFGF (100 μΙ) foi adicionada às esponjas gotaa gota de tal modo que 40 μg de bFGF foi impregnado nas mesmas. Essaesponja foi implantada em uma imperfeição de espessura total da pele nodorso de uma cobaia (porquinho da índia).As Figuras de 2 a 6 exibem imagens de pedaços de tecido de-pois da implantação.

Na esponja que tinha um conteúdo de gelatina de 100% em pe-so foi observada pouca infiltração dos tecidos circundantes dentro das célu-Las, e uma imagem de "crescimento para baixo", isto é, as células entrandopor baixo da esponja, também foi observado. Quanto mais alto o conteúdode colágeno, maior a infiltração das células e excelente regeneração do teci-do pode ser observada. No entanto, quando o conteúdo de colágeno foi de100% em peso, a capacidade de liberação continuada dos fatores de cres-cimento de célula foi reduzida. Com a finalidade de exibir uma capacidadede liberação continuada do fator de crescimento de célula suficiente, semimpedir a infiltração dos tecidos circundantes, é essencial ter um teor de ge-latina apropriado.

Claims

1. Substrato de regeneração de tecido compreendendo um subs-trato poroso bioabsorvível que contenha colágeno e gelatina, o substratoporoso bioabsorvível tendo dentro dele um fator de crescimento de célula.

2. Substrato de regeneração de tecido de acordo com a reivindi-cação 1, em que o conteúdo de gelatina no substrato poroso bioabsorvível éde 1 até 70% em peso.

3. Substrato de regeneração de tecido de acordo com a reivindi-cação 1, em que o fator de crescimento de célula é um fator de crescimentode fibroblasto básico (bFGF).

4. Substrato de regeneração de tecido de acordo com a reivindica-ção 1, em que a quantidade do fator de crescimento de célula liberada para otampão de solução salina com fosfato (PBS) depois de ser imerso no PBS a-37°C durante três dias não é maior do que 7% em peso da quantidade total defator de crescimento de célula inicialmente contido no substrato de regeneração.

5. Substrato de regeneração de tecido de acordo com a reivindica-ção 1, em que a quantidade do fator de crescimento de célula liberada para otampão de solução salina com fosfato (PBS) depois de ser imerso no PBS a-37°C durante três dias não é maior do que 15% em peso da quantidade total defator de crescimento de célula inicialmente contido no substrato de regeneração.

6. Substrato para a regeneração de tecido de acordo com a rei-vindicação 1, que tem poros com uma estrutura interconectada tendo umdiâmetro médio de poros de 10 até 500 μηι.

7. Substrato para a regeneração de tecido de acordo com a rei-vindicação 1, que é degradado e absorvido in vivo dentro de três semanas.

8. Método para a produção de um substrato de regeneração detecido, que compreende as etapas de:secagem por congelamento de uma mistura aquosa que contémcolágeno e gelatina;submetendo a substância secada por congelamento obtida des-sa forma a reticulação; efazendo a substância reticulada para conter um fator de cresci-mento de célula.