JP2014030663A - 徐放性組織再生材料 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】コラーゲン及び/又はゼラチンからなる生体吸収性多孔質基材と、該生体吸収性多孔質基材に担持された血小板分解産物とからなる徐放性組織再生材料。該血小板分解産物は、濃縮されたものであることが好ましい。該生体吸収性多孔質基材は、コラーゲンとゼラチンとの複合体であることが好ましい。該徐放性組織再生材料は、生体組織が創傷や火傷によって広範囲に欠損した場合、早期に欠損部を閉鎖することができる。
【選択図】なし
Description
しかしながら、実際にPRPを含むゼラチンハイドロゲルを組織欠損部に移植しても、期待したほどには組織再生促進効果が得られないという問題があった。
以下に本発明を詳述する。
本発明者は、更に鋭意検討の結果、PRPに代えて血小板分解産物(Platelet Lysate、以下「PL」ともいう。)を用いることにより、コラーゲン及び/又はゼラチンからなる生体吸収性多孔質基材に容易に、かつ、比較的強い強度で吸着させることができ、長期に渡って徐放させることができることを見出し、本発明を完成した。
本明細書においてPLとは、血液から分離した血小板を破壊した後、遠心分離して固体成分を分離して得た上澄み分画を意味する。PLは、血小板中に含まれる血小板由来成長因子(PDGF)、トランスホーミング成長因子β(TGF−β)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、インスリン様成長因子(IGF)等の成長因子を含有する一方、血小板の細胞壁に由来する固体成分を含有しない。この点においてPRPとは明確に区別されるものである。
PRPに比べてPLが生体吸収性多孔質基材に容易に、かつ、比較的強い強度で吸着させることができる理由は不明であるが、おそらく血小板に由来する固体成分に吸着を妨げる作用があり、それを除いたPLの吸着性能が向上するためと考えられる。
また、PLは濃縮が可能であることから、容易に高濃度で生体吸収性多孔質基材に担持させることが可能である。更に、PLはPRPに比べて保存安定性にも優れるという利点もある。
上記PLの原料は血液であるが、効率の点から、成分献血により回収した血小板を用いることが好ましい。
上記血小板を破壊する方法は特に限定されず、液体窒素等を用いて凍結と溶融とを繰り返す方法や、トロンビンを用いる方法等が挙げられる。これらの方法は、血小板中に含まれる血小板由来成長因子等を活性化する効果もある。
上記遠心分離して固体成分を分離して得た上澄みは、更に、血小板に由来する固体成分を確実に除く目的で、フィルターを用いて濾過することが好ましい。
上記生体吸収性多孔質基材は、コラーゲン又はゼラチンからなるものであってもよいが、コラーゲンとゼラチンとの複合体が好適である。
上記架橋処理の方法は特に限定されず、例えば、熱架橋法、紫外線照射法、電子線照射法、X線照射法、グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いる化学架橋法等が挙げられる。そのうち、基材の全体が均一の架橋度となるように架橋できることから、熱架橋法や架橋剤を用いる化学架橋法が好適である。
含水率(%)=[(Ws−Wd)/Ws]×100(%)
式中、Wsは、組織再生用基材を25℃においてリン酸緩衝生理食塩水中に1時間浸漬したときの重量(湿潤重量)を表し、Wdは、癒着防止材を真空乾燥機を用いて完全に乾燥したときの重量(乾燥重量)を表す。
なお、上記組織再生用基材にPLを担持させた後、凍結乾燥を行うことにより、本発明の徐放性組織再生材料の保存性を著しく向上させることも可能である。
本発明の徐放性組織再生材料は、例えば、皮膚、骨、軟骨、心筋、脂肪等の生体組織の再生に好適に用いられる。なかでも、皮膚(真皮)の組織再生用、即ち人工真皮として特に好適である。
(1)PLの調製
全血液から血液成分分離装置を用いて血小板成分を採取し、濃厚血小板を調製した。得られた濃厚血小板を−80℃で一晩凍結し、37℃で急速に解凍した。この操作を2回繰り返した。解凍した濃厚血小板を遠心分離(3000g、30分)して上澄みを採取した。採取した上澄みをフィルター(孔径0.22μm、商品名「Steradisc」、倉敷紡績社製)で濾過し、非濃縮タイプのPLを調製した。
得られた非濃縮タイプのPLは、ヘパリンを2単位/mLの割合で添加したうえで、−80℃で保管した。更に、凍結保存しておいた非濃縮タイプのPLを、凍結乾燥機を用いて−30℃で凍結乾燥させて粉末PLを調製した。粉末PLは、4℃で保管した。
使用直前に、粉末PLを元の溶液量の1/4量の生理食塩水に溶解させて4倍濃縮PLを調製し、更に生理食塩水を加えてPLの2倍濃縮物を得た。
豚腱由来タイプIコラーゲンと豚皮膚由来ゼラチンとを、ゼラチンの比率が10重量%となるように混合し、蒸留水に溶解して水溶液とした。得られた水溶液を型枠に入れて−40℃で1時間凍結し、その後凍結乾燥することにより一次凍結乾燥体を得た。
得られた一次凍結乾燥体を真空下、110℃で処理することにより熱架橋を行った。更に熱架橋後、0.2%グルタルアルデヒドを含む0.05N酢酸水溶液に浸漬し、化学架橋を行った。水洗にて余剰のグルタルアルデヒドを除去し、再度凍結乾燥することにより架橋された生体吸収性多孔質基材を得た。
PLの2倍濃縮物150μLを、1cm×1.5cm、厚さ3mmに成形した上記生体吸収性多孔質基材に滴下して、徐放性組織再生材料を得た。
実施例1と同様の方法により粉末PLを調製した。
使用直前に、粉末PLを元の溶液量の1/4量の生理食塩水に溶解させて4倍濃縮PLを調製し、更に生理食塩水を加えてPLの3倍濃縮物を得た。
得られたPLの3倍濃縮物を用いた以外は実施例1と同様にして徐放性組織再生材料を得た。
(1)PRPの調製
採血により得られた抹消血末梢血30mLを50mLの遠心管に入れ、遠心機を用いて2400rpmで10分間遠心した後、更に3600rpmで10分間遠心するダブルスピン法によりPRPを調製した。
実施例1と同様の方法により調製した1cm×1.5cm、厚さ3mmに成形した生体吸収性多孔質基材に、得られたPRPを150μL含浸させて、徐放性組織再生材料を得た。
実施例及び比較例で得られた徐放性組織再生材料について、以下の方法により評価を行った。
実施例及び比較例で得られた徐放性組織再生材料を、コラゲナーゼを用いて生体吸収性多孔質基材を完全に溶解した溶液を得た。得られた溶液について、ELISA法によりトランスホーミング成長因子β(TGF−β)の含有量を測定し、徐放性組織再生材料1cm3に担持されたTGF−β量を算出した。また、後述する徐放性の評価における積算値から、徐放性組織再生材料1cm3に担持されたPDGF量を算出した。結果を表1に示した。(ただし、比較例1についてのTGF−β量は未測定。)
実施例及び比較例で得られた徐放性組織再生材料を、37℃のリン酸緩衝液中に浸漬し、0.5、1、2、4、6、8、12、24、24.5、25、26、28、30、32、36、48時間毎にリン酸緩衝液中に放出されたPDGF量をELISA法により測定した。得られた測定値をもとに、各時間までに放出された徐放性組織再生材料中のPDGFの積算量(%)を求めた。結果を表2に示した。また、表2をもとに各徐放性組織再生材料からのPDGFの徐放性を比較した図を、図1に示した。
これに対して、PRPを担持させた比較例1の徐放性組織再生材料では、浸漬後の早い時間にほぼ100%のPDGFが放出されてしまった。PRPは、ほとんど生体吸収性多孔質基材には吸着されておらず、ごく初期の段階でほとんどが流出してしまうものと考えられる。
実施例1で調製した生体吸収性多孔質基材を直径8mm、厚さ3mmの円盤状に成形し、実施例と同様の方法にて調製したPL(濃縮なし)、PLの2倍濃縮物、PLの3倍濃縮物及びPLの4倍濃縮物を150μL含浸させて、徐放性組織再生材料を作製した。
麻酔薬を腹腔投与して麻酔した後に、C57マウスの背部に直径8mmの全層皮膚欠損層を作製した。得られた徐放性組織再生材料を全層皮膚欠損層に移植し、5−0ナイロン縫合糸を用いて固定した。
Claims (3)
- コラーゲン及び/又はゼラチンからなる生体吸収性多孔質基材と、該生体吸収性多孔質基材に担持された血小板分解産物とからなることを特徴とする徐放性組織再生材料。
- 血小板分解産物は、濃縮されたものであることを特徴とする請求項1記載の徐放性組織再生材料。
- 生体吸収性多孔質基材は、コラーゲンとゼラチンとの複合体であることを特徴とする請求項1又は2記載の徐放性組織再生材料。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11564943B2 (en) | 2015-01-21 | 2023-01-31 | Edvin Turkof | Platelet concentrate for increase of cell regeneration and cell growth |
EP4154923A1 (en) | 2021-09-22 | 2023-03-29 | Prolabin & Tefarm S.r.l. | Proactive scaffold for the loading of active principles |
Citations (3)
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JPH0759840A (ja) * | 1993-08-23 | 1995-03-07 | Terumo Corp | 創傷治癒材 |
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2012
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