CN110841104B - 一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法及在皮肤创伤修复的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及海绵支架技术领域，具体涉及一种红景天苷‑胶原蛋白海绵支架的制备方法及在皮肤创伤修复的应用。该红景天苷‑胶原蛋白海绵支架的制备方法包括：步骤一、制备胶原混合物；步骤二、注入培养板；步骤三、冷冻干燥。该制备方法是利用胶原蛋白作为天然材料和药物载体，构建红景天苷‑胶原蛋白海绵支架，所制得的红景天苷‑胶原蛋白海绵支架具有高互联性和孔隙率的优点，进而不影响药物释放，并且具有皮肤创伤修复效果好的优点。并通过动物实验证实了红景天苷‑胶原蛋白海绵支架对皮肤创伤修复的效果好，能为创伤修复的基础研究和临床应用提供参考，并且其再上皮化效果最佳，因此，红景天苷‑胶原蛋白海绵支架能够促进修复皮肤创口及皮肤再上皮化。

Description

一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法及在皮肤创伤 修复的应用
技术领域
本发明涉及海绵支架技术领域，具体涉及一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法及在皮肤创伤修复的应用。
背景技术
胶原蛋白是一种天然的高分子蛋白质，主要分布于动物的骨、肌腱、韧带、皮肤和角膜等组织中，是动物体内含量最为丰富的蛋白质。胶原蛋白提取方法主要有中性盐溶解法、酸溶法、碱溶法和酶法。商业应用的胶原溶液可以制备各种凝胶、胶原膜和支架等应用于组织工程材料、药物控释载体和伤口修复及愈合等方面。胶原蛋白作为生物医用材料已得到广泛地应用，但是，单纯的胶原蛋白存在互联性和孔隙率均较低的缺陷，容易影响药物释放。
皮肤创伤修复是一个动态复杂的过程，涉及多种细胞协同作用，任何修复过程中的失败可能导致慢性伤口和瘢痕形成，这将给患者带来极大痛苦。皮肤组织工程技术实现修复创伤和重建功能的目的，解决了自体植皮术来源受限的问题。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，具有很强的生物活性及生物功能，也是一种天然的组织支架材料，被广泛用于创伤修复，但是皮肤创伤修复的效果还是欠佳，需要不断改进。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，所制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架具有高互联性和孔隙率的优点，进而不影响药物释放，并且具有皮肤创伤修复效果好的优点。
本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
提供一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得胶原混合物；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架。
上述技术方案中，所述步骤一中，所述胶原蛋白溶液的浓度为6mg/g～10mg/g。
上述技术方案中，所述步骤一中，所述胶原蛋白溶液与所述红景天苷的质量比为30～45:0.05～0.5。
上述技术方案中，所述步骤一中，所述胶原蛋白溶液的制备方法为：将富含胶原蛋白的动物的组织采用酸酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗提取液依次经离心、盐析和超滤的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液。
上述技术方案中，所述步骤三中，所述冷冻干燥的温度为-60℃～-30℃，所述冷冻干燥的时间为48h～72h。
为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
提供上述任意一项所述的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法所制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
本发明与现有技术相比较，有益效果在于：
(1)本发明提供的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，红景天苷具有抗氧化、抗衰老，对心血管、神经、皮肤等有一定的保护作用，本发明是利用胶原蛋白作为天然材料和药物载体，构建红景天苷-胶原蛋白海绵支架，所制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架具有高互联性和孔隙率的优点，进而不影响药物释放，并且具有皮肤创伤修复效果好的优点。
(2)本发明提供的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，具有工艺过程简单、设备简易、制备过程温和、生产成本低，并能够适用于工业化大规模应用的特点。
(3)本发明提供的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用，通过动物实验证实了红景天苷-胶原蛋白海绵支架对皮肤创伤修复的效果好，能为创伤修复的基础研究和临床应用提供参考。通过组织病理分析表明红景天苷-胶原蛋白海绵支架与胶原蛋白海绵支架和模型组相比，其再上皮化效果最佳，且与正常皮肤结构最接近，因此，红景天苷-胶原蛋白海绵支架能够促进修复皮肤创口及皮肤再上皮化。
附图说明
图1是本发明实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的外观图。
图2是本发明实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的扫描电镜图。
图3是本发明实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的孔隙率测定图。
图4是本发明实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的体外红景天苷累积释放率图。
图5是大鼠皮肤创伤修复情况对比图。
图6是大鼠皮肤创伤修复的创口愈合率对比图。
图7是大鼠皮肤创口组织切片HE染色对比图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1。
一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得胶原混合物；本实施例中，胶原蛋白溶液的浓度为8mg/g；本实施例中，胶原蛋白溶液与红景天苷的质量比为38.5:0.2；
其中，胶原蛋白溶液的制备方法为：将富含胶原蛋白的动物的组织采用酸酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗提取液依次经离心、盐析和超滤的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架。本实施例中，冷冻干燥的温度为-50℃，冷冻干燥的时间为60h。
上述一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法所制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
实施例2。
一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得胶原混合物；本实施例中，胶原蛋白溶液的浓度为6mg/g；本实施例中，胶原蛋白溶液与红景天苷的质量比为30:0.05；
其中，胶原蛋白溶液的制备方法为：将富含胶原蛋白的动物的组织采用酸酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗提取液依次经离心、盐析和超滤的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架。本实施例中，冷冻干燥的温度为-60℃，冷冻干燥的时间为48h。
上述一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法所制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
实施例3。
一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得胶原混合物；本实施例中，胶原蛋白溶液的浓度为10mg/g；本实施例中，胶原蛋白溶液与红景天苷的质量比为45:0.5；
其中，胶原蛋白溶液的制备方法为：将富含胶原蛋白的动物的组织采用酸酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗提取液依次经离心、盐析和超滤的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架。本实施例中，冷冻干燥的温度为-30℃，冷冻干燥的时间为72h。
上述一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法所制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
实施例4。
一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得胶原混合物；本实施例中，胶原蛋白溶液的浓度为7mg/g；本实施例中，胶原蛋白溶液与红景天苷的质量比为35:0.1；
其中，胶原蛋白溶液的制备方法为：将富含胶原蛋白的动物的组织采用酸酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗提取液依次经离心、盐析和超滤的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架。本实施例中，冷冻干燥的温度为-40℃，冷冻干燥的时间为52h。
上述一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法所制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
实施例5。
一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得胶原混合物；本实施例中，胶原蛋白溶液的浓度为9mg/g；本实施例中，胶原蛋白溶液与红景天苷的质量比为42:0.4；
其中，胶原蛋白溶液的制备方法为：将富含胶原蛋白的动物的组织采用酸酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗提取液依次经离心、盐析和超滤的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架。本实施例中，冷冻干燥的温度为-55℃，冷冻干燥的时间为68h。
上述一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法所制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架在皮肤创伤修复的应用。
实验测试：
1.材料与方法
1.1实验动物及主要试剂、仪器
幼年SPF级雄性SD大鼠24只，体重约150g，由南方医科大学实验动物中心提供。红景天苷(道斯夫生物)；胶原蛋白(牛跟腱中提取)由本实验室自制；HE染色试剂(南京建成)；高效液相色谱仪(岛津)；真空冷冻干燥机(宁波新芝生物)。
1.2红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备
根据上述实施例1的制备方法，取38.5g的8mg/g胶原蛋白溶液与0.2g红景天苷混合，充分搅拌。将混合所得胶原混合物注入12孔培养板中，每孔2g。随后冷冻干燥，制成直径约2cm红景天苷-胶原蛋白海绵支架，每块红景天苷-胶原蛋白海绵支架约含10mg的红景天苷。
1.3扫描电子显微镜(SEM)检测红景天苷-胶原蛋白海绵支架的结构表征
将上述1.2制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架经喷金处理后，采用扫描电镜在加速电压下观察其的表面与断面结构。
1.4红景天苷-胶原蛋白海绵支架孔隙率的测定
乙醇渗透法测定支架的孔隙率。将体积为10ml的离心管装满乙醇并称重为W1，把重为Ws的支架浸入乙醇中，超声30分钟，然后再加满乙醇并称重为W2。将吸满乙醇的样品取出后，称剩余的乙醇和离心管的重量W3。同时将无药物装载的胶原蛋白海绵支架作为对照组,实验重复3次。计算公式：孔隙率＝(W2-W3-WS)/(W1-W3)X100％。
1.5红景天苷-胶原蛋白海绵支架的体外药物释放度
将红景天苷-胶原蛋白海绵支架完全浸入10ml磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，置于37℃恒温摇床。于5min、10min、20min、30min、60min、120min后分别取样保存。利用高效液相检测溶液中药物含量，计算累积释放率。实验重复3次。
1.6动物模型制备与分组
将24只SD大鼠随机分为3组，每组8只，分为模型组、胶原蛋白海绵支架组和红景天苷-胶原蛋白海绵支架组。各组大鼠以10％水合氯醛腹腔注射(0.4ml/100g)麻醉后，背部备皮并用碘伏消毒，在背部正中线两侧用手术刀各切除一个直径为2cm全层圆形皮肤创口。对照组创口不作其他处理，仅用纱布包扎，其他两组分别用胶原蛋白海绵支架组、红景天苷-胶原蛋白海绵支架组植入大鼠皮肤创面，并用医用胶布包扎。待大鼠苏醒后分笼饲养，造模后三天腹腔注射青霉素-链霉素双抗防止伤口感染。
1.7一般情况
术后观察各组大鼠存活情况、有无感染以及创口愈合情况，并用数码相机拍照记录。
1.8创伤愈合率的测量
造模后第7天、14天、21天、28天，用半透明塑料薄膜贴附于瘢痕后分别沿边缘描记、拍照，将照片扫描入计算机，通过软件image-pro-plus测算愈合面积。
愈合率(％)＝(原创面面积-现创面面积)/原创面面积×100％。
1.9常规病理组织学切片染色(HE染色)
造模后第7天、14天、21天、28天各组分别处死2只模型大鼠，取包括整个创面及周边5mm的全层组织，将组织块置于4％中性多聚甲醛中固定24小时。随后常规石蜡包埋后备用。蜡块常规脱水，包埋，切片后作HE染色，光镜下观察组织病理学变化。
1.10统计学方法
用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，采用t检验或单因素方差分析比较各组间差异，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异极具统计学意义。
2.实验结果
2.1本实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的外观图，如图1所示，海绵支架色泽洁白，柔软疏松。另外，本实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的扫描电镜图，如图2所示，通过扫描电镜图可观察到红景天苷-胶原蛋白海绵支架的内部具有高度互联的多孔结构，孔与孔之间呈紧密排列状态，孔径大小在40μm-200μm范围。
2.2本实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的孔隙率测定图，如图3所示，从图3中可见装载红景天苷的胶原蛋白海绵支架与单纯胶原蛋白海绵支架的孔隙率相比，并没有明显差异。
2.3本发明实施例1制得的红景天苷-胶原蛋白海绵支架的体外红景天苷累积释放率图，如图4所示，由图4可知，红景天苷-胶原蛋白海绵支架中的红景天苷能够在短时间内释放，说明胶原蛋白海绵支架并不影响红景天苷药物释放。从另一方面验证了该红景天苷-胶原蛋白海绵支架的高孔隙率结构。
2.4大鼠皮肤创伤修复及创口愈合率检测：其中，大鼠皮肤创伤修复情况对比图，如图5所示，其中，A代表模型组，B代表胶原蛋白海绵支架组，C代表红景天苷-胶原蛋白海绵支架组。其中，大鼠皮肤创伤修复的创口愈合率对比图，如图6所示，与模型组相比，**P<0.01，***P<0.001；与胶原海绵支架组相比，#P<0.01。从上图5和图6可知，皮肤创伤造模后，在第7、14、21、28天测量并记录创面愈合情况。随着时间推移，三组的创口面积都呈减小的趋势，两种海绵支架组创口面积明显小于模型组，在第28天两种海绵支架组创口基本愈合完全。但红景天苷-胶原蛋白海绵支架组在促进创口愈合作用更优于胶原蛋白海绵支架组，在第7、14、21天其愈合率均与模型组相比，差异极具统计学意义(***P<0.001)，并在第14天其比海绵支架组愈合速度更快(#P<0.01)。
2.5大鼠皮肤创伤愈合的HE染色：其中，大鼠皮肤创口组织切片HE染色对比图，如图7所示，其中，A代表正常皮肤，B代表模型组，C代表胶原蛋白海绵支架组，D代表红景天苷-胶原蛋白海绵支架组。从图7可知，HE染色可见第7天三组创面主要表现炎症细胞渗出伴随肉芽组织生成，在第14天，各组新生组织出现再上皮化,真皮层内可见肉芽组织生长活跃，成纤维细胞及新生血管增多，胶原蛋白海绵支架组和红景天苷-胶原蛋白海绵支架组中的炎症细胞较模型组少，成纤维细胞较模型组多，再上皮化程度较模型组高。第21天，模型组表皮继续增厚，未达完全再上皮化，新生上皮下仍有肉芽组织填充，有少量炎症细胞浸润。胶原蛋白海绵支架组和红景天苷-胶原蛋白海绵支架组基本完全再上皮化，偶见炎症细胞浸润，但红景天苷-胶原蛋白海绵支架组真皮层内的新生胶原纤维排列较整齐。第28天三组达完全再上皮化，表皮和真皮分界明显，新生表皮各层分化良好。但红景天苷-胶原蛋白海绵支架组修复效果最佳，其再上皮化形成的新生上皮结构厚度接近正常皮肤，真皮层内新生胶原纤维排列较其他两组整齐，有附属器形成。
3.讨论
伤口愈合是一个动态复杂的组织再生和生长的过程，生物活性支架可作为细胞黏附和增殖的载体，促进新生组织的形成。近来，随着对药用植物生物活性提取物的应用研究不断深入，越来越多的研究者改进复合伤口敷料，应用于急慢性的创口愈合。本发明研究装载具有抗氧化能力的红景天苷的海绵支架对创伤愈合的效果。实验结果显示，红景天苷-胶原蛋白海绵支架具有高互联性和高孔隙率结构，用于大鼠背部全层皮肤缺损创面后，缩短了创面的愈合时间，提高了愈合质量，有促进创面愈合及再上皮化的作用。创伤愈合的生理过程涉及止血期、炎症反应期、增殖期、创面收缩和组织重塑期。红景天苷-胶原蛋白海绵支架提供一个保护屏障，保护伤口免受外界湿度和微生物的影响，允许气体交换，也提供了ECM成分，其多孔结构有利于细胞的黏附和增殖，符合愈合特性。同时作为载体，释放具有抗氧化和对损伤修复有一定作用的植物提取物红景天苷，发挥其生物特性。与单纯的胶原蛋白支架相比，它的愈合时间和愈合质量更佳，HE染色结果显示其修复效果最接近正常皮肤，提示红景天苷对皮肤创伤愈合有一定的修复作用。综上所述，本发明构建的红景天苷-胶原蛋白海绵支架具有修复皮肤创口及促皮肤再上皮化的潜力，通过进一步研究和优化能获得理想的皮肤创伤修复支架材料。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一、制备胶原混合物：将胶原蛋白溶液与红景天苷混合均匀，制得胶原混合物；
步骤二、注入培养板：将步骤一制得的胶原混合物注入培养板中；
步骤三、冷冻干燥：将步骤二中注入了培养板中的胶原混合物进行冷冻干燥，即制得所述红景天苷-胶原蛋白海绵支架；
所述步骤一中，所述胶原蛋白溶液的浓度为6mg/g～10mg/g；
所述步骤一中，所述胶原蛋白溶液与所述红景天苷的质量比为30～45:0.05～0.5。
2.根据权利要求1所述的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，所述胶原蛋白溶液的制备方法为：将富含胶原蛋白的动物的组织采用酸酶结合方法进行提取，得到粗提取液，然后粗提取液依次经离心、盐析和超滤的纯化处理后，即得到纯胶原蛋白溶液。
3.根据权利要求1所述的一种红景天苷-胶原蛋白海绵支架的制备方法，其特征在于：所述步骤三中，所述冷冻干燥的温度为-60℃～-30℃，所述冷冻干燥的时间为48h～72h。
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