CN110404112B - 一种自体美容生物材料的制备方法及自体美容生物材料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种自体美容生物材料的制备方法及提供一种自体美容生物材料,其特征在于包括以下步骤:皮肤组织采集；成纤维细胞分离培养；制备富含血小板的血浆混合物制剂；自体美容生物材料的制备，采用该方法制备的自体美容生物材料，其制备时间短。安全性高，活性高、疗效佳。

Description

一种自体美容生物材料的制备方法及自体美容生物材料
技术领域
本发明涉及一种生物材料及其制备方法，尤其涉及一种自体美容生物材料及其制备方法。
技术背景
对于整形外科医生来说，面部软组织充填一直是个极具挑战性的课题，而注射性软组织材料的开发则是研究的难点。自1957年Wegener首次报道使用液体硅胶注射以来，注射性软组织材料的开发经历了很长的发展过程，至今未得到很好的解决。临床上使用的软组织填充材料主要为人工合成品-生物性填充材料。主要包括液体硅胶，硅胶微粒，牛胶原，纤维蛋白、玻尿酸等，这些生物材料没有生物活性，暂时驻留体内，都存在不同程度的吸收问题及或多或少的排斥反应，因此长期的临床效果都不能达到令人满意。
目前具有生物活性的软组织材料的开发对于美容界已经有了飞跃的发展。具有生物活性的软组织填充材料是指既要参与体内正常的生理代谢，又具有分泌各种生长因子和其他功能性蛋白的功能，因此也就是具有生理活性细胞的移植。目前开展类似细胞移植的研究很多，和整形外科有关的主要是脂肪干细胞，软骨细胞及成纤维细胞。但用于制作这些生物材料所需的细胞制备周期长、纯度及生物活性低，导致制备的生物材料疗效欠佳，无法满足临床需求，因此，开发出活性高、疗效好、生物相容性好的自体美容填充材料是临床所急需的。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种从耳后皮肤组织中提取成纤维细胞并将其加工成自体美容生物材料的制作方法，以及提供了一种自体美容生物材料，该制备方法克服了现有美容生物材料制备的缺点，提高了美容生物材料的活性。
为解决上述问题，本发明提供了以下技术方案。
本发明提供了一种自体美容生物材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)组织采集：从耳后皮肤部位采集样本，用含有抗生素的磷酸盐缓冲液清洗样本后液氮保存；
(2)成纤维细胞分离培养:取出组织，解冻后先用含抗生素的DMEM(Dulbecco'sModified Eagle Medium)培养基清洗1-2遍，再使用75％的酒精短时消毒，之后用不含钙和镁离子的磷酸盐缓冲液进行洗涤，然后将组织置于含有胶原酶和分散酶的组合物中进行过夜消化，去除组织块的表皮层；之后将组织剪碎，移至专用培养基中培养10-20天,当细胞融合度达到50％以上时，收获细胞，此时细胞为P0代细胞；
将P0代细胞传代到培养瓶中，再培养3-5天，当细胞融合度达到80％以上时，消化收获细胞，此时细胞为第一代细胞P1；
将第一代细胞传代到培养瓶中，再培养2-3天，当细胞融合度达到85％以上时，消化收获细胞，此时细胞为第二代细胞P2；
在细胞自动扩增系统中将第二代细胞继续扩增5-7天，在培养过程中每天检测细胞代谢物中的乳酸值，由乳酸计算值判断培养的细胞达到指数生长末期时，收获细胞，此时收获的细胞为第三代细胞P3，即成纤维细胞；
(3)制备富含血小板的血浆混合物制剂，用制备PRP(Platelet Rich Plasma，富含血小板血浆)混合物的实施装置制备富含血小板的血浆混合物。
(4)自体美容生物材料的制备：将(2)中制备的成纤维细胞与(3)中的PRP(Platelet Rich Plasma，富含血小板血浆)混合制备成自体美容生物材料。
进一步地,在步骤(2)中，通过成纤维细胞专用培养液及限制消化时间来去除上皮细胞及角质细胞，以纯化成纤维细胞。
进一步地,步骤(2)所述自动细胞扩增系统培养过程为；将第二代成纤维细胞的1-2×107个细胞转移到自动细胞扩增系统中，在5％CO2、37℃条件下进行培养。
进一步地,步骤(2)所述自动细胞扩增系统培养过程中,根据载入的细胞数量，设置不同的参数:
a.当1500万＞细胞上样量＞500万时,用25mL/min的进样速度、150mL/min循环；
b.当细胞数量大于1500万时,用25mL/min的进样速度、200mL/min循环。
进一步地,当适用a时,设置培养液进液速度为25mL/min，逆时针20mL/min循环3min。
当适用b时,设置培养液进液速度为0mL/min，逆时针200mL/min循环4min。
进一步地,在步骤(2)中，根据细胞代谢物来计算细胞扩增的理论值，当细胞乳酸检测值达到一定含量时，即可判断细胞处于指数增长末期，即可收获细胞。
进一步地,在步骤(2)中，在细胞收获时根据细胞形态的变化来判断何时终止消化,当细胞收缩,漂起的时候立即加成纤维细胞专用培养液终止消化。
进一步地,在步骤(2)中，当细胞数量达到2-8×108个细胞，并且细胞仍处于指数生长期时，使用含有EDTA(乙二胺四乙酸)的0.25％胰蛋白酶消化收获细胞，将收获的细胞在无菌PBS(磷酸盐缓冲液)中洗涤并进行细胞计数，其细胞活性＞95％，具有典型的成纤维细胞形态。
进一步地,步骤(1)中的耳后皮肤组织为完整的皮肤组织,包括表皮、真皮、皮下组织三层组成。
进一步地,步骤(4)中还包括将冷冻的第三代细胞从液氮存贮器中取出，水浴复苏。
进一步地,步骤(4)中成纤维细胞与PRP(Platelet Rich Plasma，富含血小板血浆)混合前需要分散在无菌生理盐水中。
进一步地,步骤(4)中，成纤维细胞与无菌生理盐水混合后，必须在30min内与PRP(Platelet Rich Plasma，富含血小板血浆)混匀。
本发明还提供了一种根据上述的制作方法制备的自体美容生物材料，所述自体美容生物材料包括自体成纤维细胞、生理盐水、富含自体血小板的血浆、细胞生长因子，胶原蛋白。
进一步地,所述自体美容生物材料中的第三代成纤维细胞的数量为0.5-2.0×107个/mL。
所述的自体美容生物材料中的细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子、血管内皮细胞生长因子及胰岛素样生长因子。
本发明与现有技术相比有较明显的优势和有益效果：
1.本发明提供的美容生物材料仅包含来源自体的成分，在制作过程中从未进行生物学改造或基因修饰，具有良好的安全性，完全的组织相容性，成功解决了免疫排斥问题。
2.本发明提供的制作方法所收获的细胞为第3代成纤维细胞，细胞培养的周期缩短，细胞活性高,第3代成纤维细胞的细胞含量高,纯度高,提高了产品的效果。
3.此方法中创建了自动培养体系，大大减少了人工操作，可极大的降低人工操作所带来的人为污染。
4.自体美容生物材料中含有多种高浓度的细胞生长因子，各细胞生长因子的比例与体内正常比例相符，使生长因子之间有最佳的协同作用，这在一定程度上弥补了单一生长因子刺激创面修复不佳的缺点，同时其中含有胶原蛋白及纤维蛋白，为修复细胞提供良好的支架，还可以收缩创面，刺激软组织再生。
附图说明
图1为实施例1中的成纤维细胞的流式检测结果图。
图2为本实施例1所获得的成纤维细胞在4倍显微镜下培养21d时的细胞状态图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效,以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种自体美容生物材料的制作方法，以及根据该方法制作的自体美容生物材料，其具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。
实施例一
本实施例中提供了一种自体美容生物材料的制作方法,包括以下步骤:
1.组织采集：无菌条件下用皮肤取样器(皮肤环钻)取耳后直径2-4mm圆形皮肤组织。其中，耳后皮肤组织为完整的皮肤组织,包括表皮、真皮、皮下组织三层组成。用含有抗生素的磷酸盐缓冲液清洗样本后液氮保存；
2.成纤维细胞分离培养及原代(P0)细胞培养：
取出组织，解冻后先用含有抗生素的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养基清洗1-2遍，再使用75％酒精短时消毒，随后用不含钙和镁离子的磷酸盐缓冲液进行洗涤。本实施例通过成纤维细胞专用培养液及限制消化时间来去除上皮细胞及角质细胞，以纯化成纤维细胞。将组织置于含有胶原酶和分散酶的组合物中进行过夜消化，过夜消化后，去除组织块的表皮层，随后将组织剪碎，移至专用培养基中培养10天，当细胞融合度达到50％时，收获细胞，此时细胞为P0代细胞。
需要说明的是，在其他实施例中，将组织剪碎后，移至专用培养基中也可培养15天/20天等其他天数，可以在细胞融合度达到50％以上时(例如60％或80％等)，收获细胞，此时细胞均为P0代细胞。
3.细胞纯化及传代培养：
将P0代细胞传代到T75培养瓶中，培养3天(在其他实施例中也可以培养5天)，当细胞融合度达到80％时(在其他实施例中也可以达到80％以上时)，消化收获细胞。消化收获细胞时，用显微镜观察细胞状态，根据细胞状态，当细胞收缩成圆形并漂起的时候立即加成纤维细胞专用培养液终止消化，去除仍贴壁的细胞，收获细胞，此时细胞为第一代细胞(P1)；
将第一代细胞(P1)传代到T175培养瓶中，培养2天(在其他实施例中也可以培养3天)，当细胞融合度达到85％时(在其他实施例中也可以达到85％以上即可)，消化收获细胞，此时细胞为第二代细胞(P2)；
在细胞自动扩增系统中将第二代细胞继续扩增5天(在其他实施例中也可以继续扩增7天)。自动细胞扩增系统培养过程为；将第二代成纤维细胞的1×107个细胞转移到自动细胞扩增系统中，在5％CO2、37℃条件下进行培养。
当P2代细胞融合度达到60％左右时，开启自动细胞扩增系统，并准备3-6L磷酸盐缓冲液，3-6L专用成纤维细胞培养液。
所述自动细胞扩增系统培养过程中,根据载入的细胞数量，设置参数为:
a.当1500万＞细胞上样量＞500万时,用25mL/min的进样速度、150mL/min循环；设置培养液进液速度为25mL/min，逆时针20mL/min循环3min。
根据细胞代谢物来计算细胞扩增的理论值，。
在培养过程中每天检测细胞代谢物中的乳酸值，由乳酸计算值判断培养的细胞是否达到指数生长末期，当细胞乳酸检测值达到一定含量时，即可判断细胞处于指数增长末期，即收获细胞，此时收获的细胞为第三代细胞(P3)，即成纤维细胞。
在细胞收获时根据细胞形态的变化来判断何时终止消化,当细胞收缩,漂起的时候立即加成纤维细胞专用培养液终止消化。
当细胞数量达到2×108个细胞/mL，并且细胞仍处于指数生长期时，使用含有EDTA(乙二胺四乙酸)的0.25％胰蛋白酶消化收获细胞，将收获的细胞在无菌PBS(磷酸盐缓冲液)中洗涤并进行细胞计数，其细胞活性＞95％，具有典型的成纤维细胞形态。
将获得的第三代细胞在液氮中冷冻保存或直接用于制备自体美容生物材料。所采用的的保存介质为包含DMEM、FBS和DMSO的冻存液。其中，第三代细胞在液氮中冷冻保存之前，抽取样本进行细胞计数、细胞活力和安全性检测，安全性检测包括细菌和真菌培养、支原体、内毒素检测。
经检测，获得的第三代细胞的性能如下表1：
表1存活率与安全性检测结果表
Figure BDA0001642202990000061
参见附图1，采用流式细胞仪对自动扩增系统收获的成纤维细胞所表达的表面标记物进行分析,结果显示，该细胞类型对CD73、CD105和CD26均呈阳性，而对HLA-DR呈阴性。纯度达到99％以上，这与纯成纤维细胞群高度吻合。
参见附图2,为本实施例所获得的耳后皮肤成纤维细胞在4倍显微镜下培养21d时的细胞状态图，其表现出典型成纤维细胞生长形态。
5.自体美容生物材料的制备：
用制备PRP混合物的实施装置制备富含血小板的血浆混合物，该实施装置包含PRP离心管套装Eclipse专用离心机。
将冷冻的第三代细胞从液氮存贮器中取出，水浴复苏，经37℃水浴锅中快速解冻后移入离心管内。
向装有成纤维细胞的离心管中加入无菌生理盐水，分散细胞，在30分钟内将成纤维细胞与生理盐水的混悬液与富含血小板的血浆混合物充分混匀，
制成自体美容生物材料；
其中，制备PRP混合物为现用现制。制备的自体美容生物材料需立即使用。
本发明提供的制作方法所收获的细胞为第3代成纤维细胞，细胞培养的周期缩短，细胞活性高,第3代成纤维细胞的细胞含量高,纯度高,提高了产品的效果。
皮肤组织酶解过程去除表皮层，降低杂细胞产生；原代培养过程所采用的培养基为成纤维细胞选择性培养基，更能保证细胞纯度；
使用本发明所述的方法，细胞培养的周期缩短，成纤维细胞的培养时间平均约为30天。较现有“堆积培养”或“滚瓶”技术等其他方法所制备成纤维细胞缩短30-40天；由于培养周期大大缩短，大大提高了细胞的活性。采用此方法制备的成纤维细胞活力平均为99.5％。相比之下，“堆积”或“滚瓶”技术培养体系培养的成纤维细胞往往低于90％。
使用本发明所述的方法获得的第三代细胞平均产量为6.0×108，此数量为其他方法传代7-10次所获得，减少细胞传代次数，提高了细胞稳定性；且本发明所述的方法的冻存细胞复苏性能稳定，成活率高。
实施例二：
本实施例中提供了一种自体美容生物材料的制作方法,其制作步骤与实施例一基本相同，不同之处在于:
在成纤维细胞分离培养及原代(P0)细胞培养中：
取出组织，解冻后先用含有抗生素的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养基清洗1-2遍，再使用75％酒精短时消毒，随后用不含钙和镁离子的磷酸盐缓冲液进行洗涤。通过成纤维细胞专用培养液及限制消化时间来去除上皮细胞及角质细胞，以纯化成纤维细胞。将组织置于含有胶原酶和分散酶的组合物中进行过夜消化，过夜消化后，去除组织块的表皮层，随后将组织剪碎，移至专用培养基中培养20天，当细胞融合度达到80％时，收获细胞，此时细胞为P0代细胞。
在细胞纯化及传代培养中：
将P0代细胞传代到T75培养瓶中，培养5天，当细胞融合度达到85％时，消化收获细胞。消化收获细胞时，用显微镜观察细胞状态，根据细胞状态，当细胞收缩变成圆形并漂起的时候立即加成纤维细胞专用培养液终止消化，去除仍贴壁的细胞，收获细胞，此时细胞为第一代细胞(P1)；
将第一代细胞(P1)传代到T175培养瓶中，培养3天，当细胞融合度达到90％时，消化收获细胞，此时细胞为第二代细胞(P2)；
在细胞自动扩增系统中将第二代细胞继续扩增7天。自动细胞扩增系统培养过程为；将第二代成纤维细胞的2×107个细胞转移到自动细胞扩增系统中，在5％CO2、37℃条件下进行培养。
当P2代细胞融合度达到60％时，开启自动细胞扩增系统，并准备3-6L磷酸盐缓冲液，3-6L专用成纤维细胞培养液。
所述自动细胞扩增系统培养过程中,根据载入的细胞数量，设置参数如下:b.当细胞数量大于1500万时,用25mL/min的进样速度、200mL/min循环。设置培养液进液速度为0mL/min，逆时针200mL/min循环4min。
根据细胞代谢物来计算细胞扩增的理论值，。
在培养过程中每天检测细胞代谢物中的乳酸值，由乳酸计算值判断培养的细胞是否达到指数生长末期，当细胞乳酸检测值达到一定含量时，即可判断细胞处于指数增长末期，即收获细胞，此时收获的细胞为第三代细胞(P3)，即成纤维细胞。
在细胞收获时根据细胞形态的变化来判断何时终止消化,当细胞收缩,漂起的时候立即加成纤维细胞专用培养液终止消化。
当细胞数量达到8×108个细胞/mL，并且细胞仍处于指数生长期时，使用含有EDTA(乙二胺四乙酸)的0.25％胰蛋白酶消化收获细胞，将收获的细胞在无菌PBS(磷酸盐缓冲液)中洗涤并进行细胞计数，其细胞活性＞95％，具有典型的成纤维细胞形态。
将获得的第三代细胞在液氮中冷冻保存或直接用于制备自体美容生物材料。所采用的的保存介质为包含DMEM、FBS和DMSO的冻存液。其中，第三代细胞在液氮中冷冻保存之前，抽取样本进行细胞计数、细胞活力和安全性检测，安全性检测包括细菌和真菌培养、支原体、内毒素检测。
经检测，获得的第三代细胞的性能如下表2。
表2存活率与安全性检测结果表
Figure BDA0001642202990000081
Figure BDA0001642202990000091
采用流式细胞仪对自动扩增系统收获的成纤维细胞所表达的表面标记物进行分析,结果显示，该细胞类型对CD73、CD105和CD26均呈阳性，而对HLA-DR呈阴性。纯度达到99％以上，这与纯成纤维细胞群高度吻合。
在4倍显微镜下培养21d时的细胞状态图，其表现出典型成纤维细胞生长形态。
实施例三：
本实施例中提供了一种采用实施例一中所述的自体美容生物材料的制作方法制备的自体美容生物材料，该自体美容生物材料为包括成纤维细胞、生理盐水、富含自体血小板的血浆、细胞生长因子，胶原蛋白。
第三代成纤维细胞的数量为0.5*107个。
第三代成纤维细胞的纯度为99.7％。
第三代成纤维细胞的活性为99.5％。
所述1ml自体美容生物材料中自体血浆含量为0.8mL。
所述1ml自体美容生物材料中生理盐水含量约为0.2mL。
所述的自体美容生物材料中的细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子、血管内皮细胞生长因子及胰岛素样生长因子。
将本实施例所制备的自体美容生物材料组合物平均分装入1mL注射器内，随后被注射入受影响区域的皮下真皮层。在注射时可采取多点斜面或是线性注射。可同时进行多个部位注射。注射体积主要取决于以下因素，如治疗区域的皮肤尺寸和数量，皮肤受损的程度，以及受试者期望获得治疗结果的迫切性。
实施例四：
本实施例中提供了一种采用实施例二中所述的自体美容生物材料的制作方法制备的自体美容生物材料，该自体美容生物材料为包括成纤维细胞、生理盐水、富含自体血小板的血浆、生长因子，细胞因子，胶原蛋白。
第三代成纤维细胞的数量为2.0×107个/mL。
第三代成纤维细胞的纯度为99.3％。
第三代成纤维细胞的活性为99.5％。
所述1mL自体美容生物材料中自体血浆含量为0.85mL。
所述1mL自体美容生物材料中生理盐水含量约为0.15mL。
所述的自体美容生物材料中的细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子、血管内皮细胞生长因子及胰岛素样生长因子。
需要说明的是，本发明仅用于非治疗目的。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (13)

1.一种自体美容生物材料的制备方法,其特征在于包括以下步骤：
(1)组织采集：从耳后皮肤部位采集样本，用含有抗生素的磷酸盐缓冲液清洗样本后液氮保存；
(2)成纤维细胞分离培养:取出组织，解冻后先用含抗生素的DMEM清洗1-2遍，再使用75％的酒精短时消毒，之后用不含钙和镁离子的磷酸盐缓冲液进行洗涤，然后将组织置于含有胶原酶和分散酶的组合物中进行过夜消化，去除组织块的表皮层；之后将组织剪碎，移至专用培养基中培养10-20天,当细胞融合度达到50％以上时，收获细胞，此时细胞为P0代细胞；
将P0代细胞传代到培养瓶中，再培养3-5天，当细胞融合度达到80％以上时，消化收获细胞，此时细胞为第一代细胞P1；
将第一代细胞传代到培养瓶中，再培养2-3天，当细胞融合度达到85％以上时，消化收获细胞，此时细胞为第二代细胞P2；
将第二代成纤维细胞的1-2×107个细胞转移到自动细胞扩增系统中，在5％CO2、37℃条件下将第二代细胞继续扩增5-7天，其中所述自动细胞扩增系统培养过程中,根据载入的细胞数量，设置不同的参数:
a.当1500万＞细胞上样量＞500万时,用25mL/min的进样速度、150mL/min循环；
b.当细胞数量大于1500万时,用25mL/min的进样速度、200mL/min循环；
在培养过程中每天检测细胞代谢物中的乳酸值，由乳酸计算值判断培养的细胞达到指数生长末期时，收获细胞，此时收获的细胞为第三代细胞P3，即成纤维细胞；
(3)制备富含血小板的血浆混合物制剂：用制备富含血小板血浆混合物的实施装置制备富含血小板的血浆混合物；
(4)自体美容生物材料的制备：将(2)中制备的成纤维细胞与(3)中的富含血小板血浆混合制备成自体美容生物材料。
2.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法,其特征在于步骤(2)中，通过成纤维细胞专用培养液及限制消化时间来去除上皮细胞及角质细胞，以纯化成纤维细胞。
3.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法，其特征在于:
当适用a时,设置培养液进液速度为25mL/min，逆时针20mL/min循环3min；
当适用b时,设置培养液进液速度为0mL/min，逆时针200mL/min循环4min。
4.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法,其特征在于在步骤(2)中，根据细胞代谢物来计算细胞扩增的理论值，当细胞乳酸检测值达到一定含量时，即可判断细胞处于指数增长末期，即可收获细胞。
5.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法,其特征在于在步骤(2)中，在细胞收获时根据细胞形态的变化来判断何时终止消化,当细胞收缩,漂起的时候立即加成纤维细胞专用培养液终止消化。
6.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法,其特征在于在步骤(2)中，当细胞数量达到2-8×108个细胞，并且细胞仍处于指数生长期时，使用含有EDTA的0.25％胰蛋白酶消化收获细胞，将收获的细胞在无菌磷酸盐缓冲液中洗涤并进行细胞计数，其细胞活性＞95％，具有典型的成纤维细胞形态。
7.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法,其特征在于步骤(1)中的耳后皮肤组织为完整的皮肤组织,包括表皮、真皮、皮下组织三层组成。
8.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法，其特征在于步骤(4)中还包括将冷冻的第三代细胞从液氮存贮器中取出，水浴复苏。
9.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法，其特征在于步骤(4)中成纤维细胞与富含血小板血浆混合前需要分散在无菌生理盐水中。
10.根据权利要求1所述的自体美容生物材料的制备方法，其特征在于步骤(4)中，成纤维细胞与无菌生理盐水混合后，必须在30min内与富含血小板血浆混匀。
11.一种根据权利要求1-10任意一项所述的制作方法制备的自体再生生物材料，其特征在于所述自体再生生物材料包括自体成纤维细胞、生理盐水、富含自体血小板的血浆、细胞生长因子及胶原蛋白中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的自体再生生物材料,其特征在于所述自体再生生物材料中的第三代成纤维细胞的数量为0.5-2.0×107个/mL，第三代成纤维细胞的纯度≥99％，第三代成纤维细胞的活性≥95％。
13.根据权利要求12所述的自体再生生物材料，其特征在于所述的自体再生生物材料中的细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子、血管内皮细胞生长因子及胰岛素样生长因子中的至少一种。
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