CN101785853B

CN101785853B - 间充质干细胞生物除皱剂及其制备方法

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Publication number: CN101785853B
Application number: CN2010101306707A
Authority: CN
Inventors: 晏泽
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-03-24
Filing date: 2010-03-24
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2030-03-24
Also published as: CN101785853A

Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞生物除皱剂及其制备方法。该除皱剂由间充质干细胞、受体血浆、生长因子、胰岛素和透明质酸均匀混合而成。制备方法包括：⑴采集、培养间充质干细胞，制得细胞浓缩液约；⑵受体血浆采集；⑶在受体血浆中添加生长因子和胰岛素；⑷以透明质酸作为生物支架，将2%透明质酸、添加生长因子和胰岛素后的血浆、间充质干细胞浓缩液在注射器内反复抽吸混匀即得所述间充质干细胞制剂。本发明方法制得的除皱剂用于皮肤除皱防皱具有见效快，维持时间长、面部表情不僵硬，增生组织不明显发硬，皮肤质地与正常皮肤一致的优点。

Description

间充质干细胞生物除皱剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及干细胞应用技术领域，尤其是用于消除皮肤皱纹的间充质干细胞生物除皱剂及其制备方法。

背景技术

皮肤老化后成纤维细胞数目减少、功能衰退，皮肤胶原、透明质酸合成减少，胶原、弹力纤维变性老化是皮肤老化萎缩变薄、出现皱纹的主要原因。针对皮肤皱纹，目前主要有两种途径，手术除皱和注射除皱。手术除皱效果确切，但风险高、并发症多，一般人接受率低。注射除皱主要有注射肉毒毒素和注射充填物两种方法。肉毒毒素通过麻痹表情肌达到除皱的目的，见效快，但有维持时间短（6个月）、面部表情僵硬等缺点。注射充填物除皱，主要制剂有透明质酸、爱贝芙、伊维兰等。透明质酸可被降解，维持时间不长。爱贝芙主要含牛胶原及微球，早期通过牛胶原来达到效果，长期效果通过微球的异物反应刺激成纤维细胞合成胶原达到除皱目的，但增生的组织明显发硬，不符合皮肤的生理特点。伊维兰的主要成份属于化学合成品，可被降解。

发明内容

本发明的任务是要克服现有技术的缺陷，提供一种不仅见效快，而且维持时间长、面部表情不僵硬，增生的组织不会明显发硬，皮肤的质地与正常皮肤一致的间充质干细胞生物除皱剂及其制备方法。

本发明的技术方案是：

一种间充质干细胞生物除皱剂，其特征是：该除皱剂由间充质干细胞、受体血浆、生长因子、胰岛素和透明质酸均匀混合而成。

其中：

所述间充质干细胞是在无菌条件下采集培养的骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或胎盘间充质干细胞；所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血管内皮生长因子。

每5ml总量的所述间充质干细胞生物除皱剂中含有1×10⁷左右个间充质干细胞，血浆2-3ml，添加1～50μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、1～30μg/L的表皮细胞生长因子、1～50μg/L的血管内皮生长因子，和1～50μM胰岛素。透明质酸为中分子量的2%透明质酸。

间充质干细胞生物除皱剂的制备方法，按制备5ml总量计算，包括下列步骤：

⑴采集、培养间充质干细胞，制成细胞混合液后，按1：3左右比例传代，使传代控制在7代以内，细胞数在10⁶～10⁸个之间，制得2～3ml细胞浓缩液；

⑵受体血浆采集：用注射器抽取受体静脉血，将受体静脉血注入有抗凝剂的无菌试管后，用离心机转动离心，然后再用注射器抽取离心后血液上面的血浆；

⑶在受体血浆中添加生长因子和胰岛素：生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血管内皮生长因子；按每5ml的总量计算，碱性成纤维细胞生长因子添加8～11μg/L、表皮细胞生长因子4～6μg/L、血管内皮生长因子添加8～12μg/L，胰岛素添加8～12μM；

⑷以透明质酸作为生物支架，作注射前混匀：将2%透明质酸、步骤⑶添加生长因子和胰岛素后的血浆、步骤⑴中的间充质干细胞浓缩液在注射器内反复抽吸混匀即得所述间充质干细胞制剂。

在所述步骤⑴中，所述间充质干细胞是一种骨髓间充质干细胞，其是采用梯度密度离心法从无菌条件下采集的骨髓液体中获得的，10ml骨髓液体中，骨髓间充质干细胞数控制在10⁶～10⁸之间，经反复洗涤后将细胞悬液加入培养体系当中，在含有4～6%CO₂、约36.5～37.5℃的恒温箱内培养，经约40-52小时后全量换液，弃去悬浮细胞，待贴壁细胞达到约80%融合时，用0.25%EDTA胰酶消化，反复洗涤细胞，将细胞混悬液按1：（2～4）的比例进行所述传代。

在所述步骤⑴中，所述间充质干细胞还可源自脐带或胎盘，是一种脐带或胎盘间充质干细胞，其获取的方法是：无菌操作条件下，按规范切取8～12cm长脐带或胎盘，用Hank^，s液冲后，去除残留血液，并分离血管，然后将脐带或胎盘修剪成0.8～1.2mm³左右的组织块，用胰蛋白酶消化至细胞大部分分散时终止消化，过滤后，先将滤液低速离心，再用Hank^，s液离心清洗数次，加入细胞培养液，得到细胞混悬液，继而将细胞混悬液按1：（2～4）的比例进行所述传代。

本发明是采用间充质干细胞技术消除皮肤皱纹的，间充质干细胞通过诱导定向分化为成纤维细胞和血管内皮细胞，从而在皮下形成一层新生皮下组织，其又可刺激皱纹区皮肤组织细胞增殖、加强透明质酸和胶原的合成。透明质酸除了作为细胞生长的支架材料，大、中分子量的透明质酸还会对细胞分化、增殖及合成代谢有规范作用，使皮下组织的增生或再生呈现出立体式有序行为，让新生皮下组织的质地与正常皮肤组织相似。本发明制剂符合皮肤的生理学特点，能有效消除皱纹、对抗皮肤老化。实验表明，使用本发明制剂进行皮肤除皱不仅见效快，维持时间长，而且不会导致面部表情僵硬、增生的组织发硬。

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

具体实施例

一种间充质干细胞生物除皱剂，由间充质干细胞、受体血浆、生长因子、胰岛素和透明质酸均匀混合而成。

其中：间充质干细胞可以是在无菌条件下采集培养的骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或胎盘间充质干细胞。生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血管内皮生长因子。每5ml总量的间充质干细胞生物除皱剂中含有1×10⁷个左右间充质干细胞，血浆2～3ml，添加10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、5μg/L的表皮细胞生长因子、10μg/L的血管内皮生长因子，和10μM胰岛素。

⑴采集、培养间充质干细胞，制成细胞混合液后，按1：3左右比例传代，使传代控制在7代以内，细胞数在10⁶～10⁸个之间，制得2～3ml细胞浓缩液。作为最佳实施例：传代控制在4～5代以内，细胞数在为10⁷个。

⑶在受体血浆中添加生长因子和胰岛素：生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血管内皮生长因子；按每5ml的总量计算，碱性成纤维细胞生长因子添加8～11μg/L、表皮细胞生长因子4～6μg/L、血管内皮生长因子添加8～12μg/L，胰岛素添加8～12μM。作为最佳实施例：碱性成纤维细胞生长因子添加10μg/L，表皮细胞生长因子5μg/L、血管内皮生长因子添加10/L，胰岛素添加10μM。

μM为胰岛素的计量单位。2μg/L是生长因子的计量单位。

本实例1中，用于在步骤⑴的间充质干细胞是一种骨髓间充质干细胞，其是采用梯度密度离心法从无菌条件下采集的10ml骨髓液体中获得的，骨髓间充质干细胞数控制在约10⁷个，经反复洗涤后将细胞悬液加入培养体系当中，在含有5%CO₂、37℃的恒温箱内培养，经约48小时后全量换液，弃去悬浮细胞，待贴壁细胞达到约80%融合时，用0.25%EDTA胰酶消化，反复洗涤细胞，将细胞混悬液按1：3的比例进行传代。

作为实施例2，在上述步骤⑴中，间充质干细胞源自脐带或胎盘，是一种脐带或胎盘间充质干细胞，其获取的方法是：无菌操作条件下，按规范切取10cm长脐带或胎盘，用Hank^，s液冲后，去除残留血液，并分离血管，燃后将脐带或胎盘修剪成1mm³左右的组织块，用胰蛋白酶消化至细胞大部分分散时终止消化，过滤后，先将滤液低速离心，再用Hank^，s液离心清洗数次，加入细胞培养液，得到细胞混悬液，继而将细胞混悬液按1：3的比例进行所述传代。

本发明培养液采用美国Stem Cell 公司提供的间充质干细胞专用培养基Mesencult^TM制成，或采用DMEM（Gibco，USA）、10%自身血清或健康人AB血清、1% glutamine （Gibco，USA）及无血清培养液制得。

本发明采用的种子细胞是间充质干细胞，不论是自体还是同种异源的间充质干细胞，一般都不会引起宿主的免疫反应。尤其是来源于脐带或胎盘的间充质干细胞活力强于成体骨髓间充质干细胞。

本发明采用的生物支架材料是透明质酸。透明质酸是广泛存在于人及动物结缔组织中的酸性粘多糖类大分子物质。透明质酸的首要功能在于构成细胞外基质和细胞间质的主要成分，从而直接参与细胞内外交流的调控，发挥物理和分子信息的过滤器作用。其次透明质酸的生理功能因分子量大小而异。大分子量透明质酸对细胞移动，增殖，分化及吞噬功能有抑制作用，中分子量有调节、平衡作用，小分子量透明质酸则有促进作用。研究发现，透明质酸在人体组织生成，组织修复，肿瘤扩散时都发挥着重要作用。随着人们年龄的增长人体合成透明质酸的能力逐渐下降。如果把20岁的人体内的透明质酸相对含量定位100%，则30、50、60岁时分别下降为65%、45%、25%。皮肤透明质酸减少是皮肤老化萎缩变薄、出现皱纹的主要原因之一。

选用交联修饰处理过的透明质酸做为种子细胞——间充质干细胞定向分化的生物支架材料，其在体内降解的时间约12月，可保证足够长时间为间充质干细胞分化、成纤维细胞合成胶原提供生物支架功能。未交联过的透明质酸也可使用，只是维持时间短些。选用大、中分子量透明质酸对细胞分化、增殖、细胞代谢有规序作用，增生皮下组织排列有序，保证皮肤组织的增生呈现生理性再生的特点；小分子量透明质酸有促进作用，也可选用。可选择目前市场上有批文的透明质酸如：瑞典生产的瑞蓝（Restylane）牌、中分子量、2%透明质酸。

由上述说明可知本发明种子细胞间充质干细胞来源于自身骨髓、异体骨髓、新生儿脐带或胎盘。可事先在体外培养、扩增，作成种子细胞冷冻保存，方便多次使用，冷冻后细胞损失小，采集方便，易于保存和运输，伦理学争议少。

在上述上述说明中，将透明质酸作为生物支架材料，间充质干细胞为种子细胞，使用时将两者在注射器里反复轻柔抽吸混匀，便于做好组织工程学的准备，方便直接补充透明质酸。

干细胞交联修饰是在注射前添加一定剂量的碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和胰岛素，作为间充质干细胞分化为成纤维细胞、血管内皮细胞的诱导条件，可同时刺激原来皮肤组织和新分化成的成纤维细胞合成、分泌胶原。

微环境的定向诱导分化：①注射层次，注射层次在皮下，在皮肤真皮层与皮下组织浅层之间，该层次存在大量成纤维细胞，组织结构较疏松，能包容一定体积的注射物，注射后为间充质干细胞分化为成纤维细胞提供足够空间，同时刺激因素（干细胞修饰活性成份和自体血浆）可刺激原来皮肤组织和新分化成的成纤维细胞合成、分泌胶原。②自体血浆创伤性诱导：自体血浆内含多种活性因子（如血小板衍生因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮细胞生长因子等）及其它活性物质，离开血管后注射进入皮下，会启动创伤修复的效应，强化皮下组织再生的效果。血浆约占血液的55%，是水，糖，脂肪，蛋白质，钾盐和钙盐的混合物。也包含了许多止血必需的血凝块形成的化学物质。血细胞和血小板组成血液的另外45%。

本发明是通过皮肤组织在皮下发生的生理性增生或生理性再生的机理来除皱的。与单纯使用生物材料充填方式除皱或使用化学物质刺激皮肤组织发生异物样增生的方式除皱有本质区别，不仅见效快，而且维持时间长、面部表情不僵硬，增生的组织不会明显发硬。

本发明除皱剂的使用方法是：

无菌条件下将上述生物制剂均匀注射到皱纹区皮下，1cm²的皮肤面积注射量约为0.1-0.3ml。6个月后可重复进行，方法、用量与第一次一致。

具体效果是：

每次注射后早期通过透明质酸达到除皱的目的，随着透明质酸的降解，间充质干细胞定向分化为成纤维细胞，成纤维细胞胶原合成增加，3-6个月时皮肤皮下出现了一层生理性再生的组织，达到除皱目的。6月后效果比较稳定，如需多次治疗，6个月后就可进行第二次治疗。

细小或浅的皱纹一次治疗后就基本消除或明显减轻，深的要经过2-3次的治疗。疗程完全结束后，皮肤皱纹能基本消除或明显减轻，效果持久。最长已观察到5年，效果保持确切。不但达到除皱的目的，皮肤的质地与正常皮肤一致。

本发明之除皱剂产品除了用于消除皮肤皱纹外，也可用于治疗皮肤萎缩、皮肤凹陷充填、面部五官充填式塑形等方面。因此，本发明要求保护的范围不限于其名称所定义的除皱剂，还应包括在上述方面的应用。

Claims

1.一种间充质干细胞生物除皱剂，其特征是：该除皱剂由间充质干细胞、受体血浆、生长因子、胰岛素和透明质酸均匀混合而成；所述间充质干细胞是在无菌条件下采集培养的骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或胎盘间充质干细胞；所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血管内皮生长因子；

每5ml总量的所述间充质干细胞生物除皱剂中含有1×10⁷左右个间充质干细胞，血浆2-3ml，添加1～50μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、1～30μg/L的表皮细胞生长因子、1～50μg/L的血管内皮生长因子，和1～50μM胰岛素，透明质酸为中分子量的2%透明质酸。

2.间充质干细胞生物除皱剂的制备方法，按制备5ml总量计算，包括下列步骤：

(2)受体血浆采集：将以注射器抽取的受体静脉血注入有抗凝剂的无菌试管后，用离心机转动离心，然后再用注射器抽取离心后血液上面的血浆；

3.依照权利要求2所述的间充质干细胞生物除皱剂的制备方法，其特征在于：在所述步骤⑴中，所述间充质干细胞是一种骨髓间充质干细胞，其是采用梯度密度离心法从无菌条件下采集的骨髓液体中获得的，10ml骨髓液体中，骨髓间充质干细胞数控制在10⁶～10⁸之间，经反复洗涤后将细胞悬液加入培养体系当中，在含有4～6%CO₂、36.5～37.5℃的恒温箱内培养，经40-52小时后全量换液，弃去悬浮细胞，待贴壁细胞达到约80%融合时，用0.25%EDTA胰酶消化，反复洗涤细胞，将细胞混悬液按1：（2～4）的比例进行所述传代。

4.依照权利要求2所述的间充质干细胞生物除皱剂的制备方法，其特征在于在所述步骤⑴中，所述间充质干细胞源自脐带或胎盘，是一种脐带或胎盘间充质干细胞，其获取的方法是：无菌操作条件下，按规范切取8～12cm长脐带或胎盘，用Hank^，s液冲后，去除残留血液，并分离血管，然后将脐带或胎盘修剪成0.8～1.2mm³的组织块，用胰蛋白酶消化至细胞大部分分散时终止消化，过滤后，先将滤液低速离心，再用Hank^，s液离心清洗数次，加入细胞培养液，得到细胞混悬液，继而将细胞混悬液按1：（2～4）的比例进行所述传代。

5.依照权利要求2所述的间充质干细胞生物除皱剂的制备方法，其特征在于：使所述传代控制在4-5代以内，所述细胞数为10⁷个。

6.依照权利要求5所述的间充质干细胞生物除皱剂的制备方法，其特征在于：所述透明质酸为中分子量的2%透明质酸。