CN107326005B - 一种无外源支架的真皮构建方法及培养液 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例提供一种无外源支架的真皮构建方法及培养液，涉及组织工程技术领域，通过优化培养体系，在其中添加一些能够促进成纤维细胞增殖和ECM分泌的活性成分，构建出一种细胞密度高、厚度大、稳定性好的无外源支架的真皮替代物。无外源支架的真皮由成纤维细胞及其自身分泌的细胞外基质构成，该无外源支架的真皮构建方法包括：步骤一：成纤维细胞的分离培养；步骤二、真皮层构建。

Description

一种无外源支架的真皮构建方法及培养液
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种无外源支架的真皮构建方法及培养液。
背景技术
组织工程皮肤是指将体外培养的皮肤种子细胞（主要是角质形成细胞和成纤维细胞），与天然细胞外基质、复合或合成的可降解生物相容性材料相结合，形成细胞-材料复合物，在体外进行一段时间的培养后，可用于临床治疗或化妆品的体外检测的人工皮肤。组织工程化皮肤按照不同的标准可以分为：组织工程化表皮、组织工程化真皮和组织工程化复合皮肤。
真皮替代物在皮肤重建过程中具有重要作用，可增加创面愈合后的皮肤弹性、柔软性及机械耐磨性，减少瘢痕增生，控制痉挛，而且有些真皮替代物中存在的活性成纤维细胞可促进表皮生长分化，诱导基底膜形成。因此，目前皮肤组织工程学中的热点是再造真皮基质。真皮替代物可基本分为两大类，含外源支架的真皮替代物（天然支架或人工支架）和无外源支架的真皮替代物。
目前，使用外源性支架材料构建人工真皮的报道较多，并且应用广泛，但是使用外源性的支架材料或多或少都有一定的免疫原性，同时也不能完全排除存在某些未知的毒性作用。并且，用支架材料和活细胞构建的皮肤模型在培养过程中伴随着活细胞自身胶原的分泌以及支架材料的降解，易导致人工皮肤组织的收缩现象。
专利CN201510183861.2采用无外源支架，仅依靠成纤维细胞自身分泌细胞外基质作为支架的方式构建了一种具有成纤维细胞组成的真皮层和表皮细胞组成的表皮层的全层皮肤模型，适用于化妆品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、皮肤接触性材料等的测试评价。但是该方法构建的无外源支架的人工真皮还存在真皮厚度相对较小，细胞密度低，培养时间长等缺点。
发明内容
本发明实施例提供了一种无外源支架的真皮构建方法及培养液，针对目前无外源支架的人工真皮厚度小，细胞密度低，培养时间长等缺点，通过优化培养体系，在其中添加一些能够促进成纤维细胞增殖和ECM分泌的活性成分，构建出一种细胞密度高、厚度大、稳定性好的无外源支架的真皮替代物。此真皮替代物可用于组织工程全层皮肤的构建。
为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：
本发明实施例提供一种无外源支架的真皮构建方法，无外源支架的真皮由成纤维细胞及其自身分泌的细胞外基质构成，无外源支架的真皮构建方法包括以下步骤：
步骤一：成纤维细胞的分离培养
将已去除脂肪和结缔组织的1mm3的皮肤组织置于培养液Ⅰ中，放置于4℃过夜；加入等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；以每毫升2×105～4×105个细胞接种于培养液Ⅱ，5％CO2、37℃条件下培养；经传代后，取第5~7代细胞；
步骤二、真皮层构建
获取步骤一所得的第5～7代成纤维细胞，按照每毫升培养液Ⅲ含0.5×106～3×106个成纤维细胞的密度进行接种；置于5％CO2、37℃条件下培养2～3小时后，加入培养液Ⅳ培养；每隔22～26小时更换培养液Ⅳ一次，共培养9~10天；
其中，消化液包括0.25％胰酶和0.02％乙二胺四乙酸EDTA的磷酸盐缓冲液PBS；培养液Ⅰ包括DMEM，胶原酶、透明质酸、谷氨酰胺、孕酮、丁二胺、硒酸钠和转铁蛋白；培养液Ⅱ包括10％胎牛血清FBS和90％DMEM；培养液Ⅲ包括DMEM、FBS、维生素C和维生素E，培养液Ⅲ中DMEM和FBS的体积比为9：1；培养液Ⅳ包括75％DMEM和25％DMEM/F12，以及胎牛血清、NaHCO3、阿魏酸钠、维生素C、维生素E、α-硫辛酸、转化生长因子TGF-β、表皮生长因子EGF、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、孕酮、丁二胺、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白和血管生长因子，DMEM/F12是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:3的比例混合的。
进一步地，培养液Ⅰ包括DMEM，胶原酶、透明质酸、谷氨酰胺、孕酮、丁二胺、硒酸钠和转铁蛋白，其中，胶原酶的浓度为200U•mL-1、透明质酸的浓度为300U•mL-1、谷氨酰胺的浓度为2～10mM、孕酮的浓度为10～20nM、丁二胺的浓度为30～60μM、硒酸钠的浓度为15～30nM、转铁蛋白的浓度为65～100ng/mL。
进一步地，培养液Ⅲ包括DMEM、FBS、维生素C和维生素E，培养液Ⅲ中DMEM和FBS的体积比为9：1，其中，维生素C的浓度为50～100mg/L，维生素E的浓度为10~20mg/L。
进一步地，培养液Ⅳ包括75％DMEM和25％DMEM/F12，以及胎牛血清、NaHCO3、阿魏酸钠、维生素C、维生素E、α-硫辛酸、转化生长因子TGF-β、表皮生长因子EGF、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、孕酮、丁二胺、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白和血管生长因子，其中，胎牛血清的浓度为3～10％、NaHCO3的浓度为3～5mg/ml、阿魏酸钠的浓度为2~10μg/ml、维生素C的浓度为50～100mg/L、维生素E的浓度为10~20mg/L、α-硫辛酸的浓度为30~50μM、转化生长因子TGF-β的浓度为5～10μg/L、表皮生长因子EGF的浓度为5～10μg/L、胰岛素的浓度为15～30ng/ml、氢化可的松的浓度为150～180ng/L、腺嘌呤的浓度为55～75μg/ml、孕酮的浓度为30～50nM、丁二胺的浓度为30～60μM、碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8～12ng/ml、转铁蛋白的浓度为10～20ng/ml、血管生长因子的浓度为5～10ng/ml。
本发明实施例还提供一种培养液，培养液应用于上述的无外源支架的真皮构建方法中，培养液为无外源支架的真皮构建方法中的培养液Ⅳ；
其中，培养液Ⅳ包括75％DMEM和25％DMEM/F12，以及胎牛血清、NaHCO3、阿魏酸钠、维生素C、维生素E、α-硫辛酸、转化生长因子TGF-β、表皮生长因子EGF、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、孕酮、丁二胺、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白和血管生长因子，DMEM/F12是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:3的比例混合的。
进一步地，胎牛血清的浓度为3～10％、NaHCO3的浓度为3～5mg/ml、阿魏酸钠的浓度为2~10μg/ml、维生素C的浓度为50～100mg/L、维生素E的浓度为10~20mg/L、α-硫辛酸的浓度为30~50μM、转化生长因子TGF-β的浓度为5～10μg/L、表皮生长因子EGF的浓度为5～10μg/L、胰岛素的浓度为15～30ng/ml、氢化可的松的浓度为150～180ng/L、腺嘌呤的浓度为55～75μg/ml、孕酮的浓度为30～50nM、丁二胺的浓度为30～60μM、碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8～12ng/ml、转铁蛋白的浓度为10～20ng/ml、血管生长因子的浓度为5～10ng/ml。
本发明对真皮构建过程中的培养基进行了优化，其中添加的维生素C可以促进成纤维细胞的大量增殖和分泌细胞外基质。同时，维生素C作为抗氧化剂，能够降低细胞的过氧化物水平，减少细胞的损伤。
维生素E和维生素C共同使用具有协同效应，VC能将生育酚氧自由基再生转化为VE，同时通过清除氧自由基来减少VE的消耗。
阿魏酸钠是中药当归的主要活性成分，在体外培养的成纤维细胞中加入阿魏酸可以促进转化生长因子（TGF-β）的分泌，以及表皮生长因子EGF的表达。同时，阿魏酸钠还具有抗氧化、抑制细胞凋亡等作用。
α-硫辛酸具有很强的清除自由基、螯合金属离子的功效，是一种强抗氧化剂，有延缓细胞衰老、抑制细胞凋亡的作用。此外，α-硫辛酸还可以通过激活TGF-β信号通路来促进成纤维细胞合成ECM成分。
胰岛素也可促进成纤维细胞增殖和胶原蛋白、弹性蛋白的分泌，但也存在一定的剂量依赖关系，表现为低浓度促进高浓度抑制。
转化生长因子（TGF-β）是一种多功能的细胞因子，可以调节多种 ECM 降解酶及其抑制因子，从而促进细胞外基质的合成，减少细胞外基质的降解，在创伤愈合及组织修复中起关键作用。
表皮生长因子（EGF）是一种促间充质细胞和表皮细胞进行有丝分裂的丝裂原，可以促进哺乳类动物细胞进行有丝分裂并影响其某些分化过程，与胰岛素具有相同的作用。有研究显示，EGF可以促进成纤维细胞的增殖以及创伤愈合过程中真皮成纤维细胞的移行。
与现有的技术相比，本发明构建的无外源支架的真皮至少具有以下优点：
（1）培养时间大大缩短，由原先的12~14天提升到9~10天；
（2）细胞密度、组织厚度有明显提升；
（3）真皮层成纤维细胞分泌更多的细胞因子及细胞外基质，更有利于在构建全层皮肤模型时基底膜的形成，并且能够促进和支持表皮层的增殖与分化。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的无外源支架的真皮进行组织固定及HE染色的结构示意图；
图2为本发明实施例2提供的无外源支架的双层皮肤进行组织固定及HE染色的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。
实施例1
在一种可能的实现方式中，本发明实施例提供一种无外源支架的真皮构建方法，该方法包括：
步骤一：成纤维细胞的分离培养
将已去除脂肪和结缔组织的1mm3的皮肤组织置于培养液Ⅰ中，放置于4℃过夜；加入等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；以每毫升4×105个细胞接种于培养液Ⅱ，5％CO2、37℃条件下培养；经传代后，取第7代细胞；
步骤二、真皮层构建
获取步骤一所得的第7代成纤维细胞，按照每毫升培养液Ⅲ含3×106个成纤维细胞的密度进行接种；置于5％CO2、37℃条件下培养2～3小时后，加入培养液Ⅳ培养；每隔24小时更换培养液Ⅳ一次，共培养9天，进行组织固定及HE染色，结果如图1所示。
其中，消化液包括0.25％胰酶和0.02％乙二胺四乙酸EDTA的磷酸盐缓冲液PBS。
培养液Ⅰ包括DMEM，胶原酶、透明质酸、谷氨酰胺、孕酮、丁二胺、硒酸钠和转铁蛋白，其中，胶原酶的浓度为200U•mL-1、透明质酸的浓度为300U•mL-1、谷氨酰胺的浓度为10mM、孕酮的浓度为10nM、丁二胺的浓度为50μM、硒酸钠的浓度为30nM，转铁蛋白的浓度为80ng/mL。
培养液Ⅱ包括10％胎牛血清FBS和90％DMEM。
培养液Ⅲ包括DMEM、FBS、维生素C和维生素E，培养液Ⅲ中DMEM和FBS的体积比为9：1，其中，维生素C的浓度为50mg/L，维生素E的浓度为10mg/L。
培养液Ⅳ包括75％DMEM和25％DMEM/F12，以及胎牛血清、NaHCO3、阿魏酸钠、维生素C、维生素E、α-硫辛酸、转化生长因子TGF-β、表皮生长因子EGF、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、孕酮、丁二胺、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白和血管生长因子，DMEM/F12是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:3的比例混合的，其中，胎牛血清的浓度为10％、NaHCO3的浓度为5mg/ml、阿魏酸钠的浓度为5μg/ml、维生素C的浓度为50mg/L、维生素E的浓度为10mg/L、α-硫辛酸的浓度为50μM、转化生长因子TGF-β的浓度为5μg/L、表皮生长因子EGF的浓度为5μg/L、胰岛素的浓度为15ng/ml、氢化可的松的浓度为150ng/L、腺嘌呤的浓度为60μg/ml、孕酮的浓度为30nM、丁二胺的浓度为30μM、碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml、转铁蛋白的浓度为10ng/ml、血管生长因子的浓度为5ng/ml。
如图1所示，本方法构建的人工真皮生发良好，成纤维细胞形态呈梭型，分布均匀。经统计，细胞密度约为400~500个/mm2，厚度约为120μm。
在另一种可能的实现方式中，本发明实施例提供一种无外源支架的双层皮肤构建方法，该方法包括：
步骤一：成纤维细胞的分离培养
将已去除脂肪和结缔组织的1mm3的皮肤组织置于培养液Ⅰ中，放置于4℃过夜；加入等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；以每毫升4×105个细胞接种于培养液Ⅱ，5％CO2、37℃条件下培养；取P7代细胞用于真皮构建。
步骤二、真皮层构建
取第P7代成纤维细胞，按照每毫升培养液Ⅲ含3×106个成纤维细胞进行接种；置于5％CO2、37℃条件下培养3小时后，加入培养液Ⅳ培养；每隔24小时更换培养液Ⅳ一次，共培养4天后用于双层皮肤模型的构建。
步骤三：表皮细胞的接种
在真皮培养4天后接种表皮细胞，具体步骤为：取P6代表皮细胞进行复苏后，培养至融合率达60%左右；弃去培养液Ⅳ，按照接种密度2.5E5/cm2将表皮细胞接种于真皮层表面，加入培养液Ⅴ进行培养。
步骤四：双层皮肤模型的培养
在含4.5%-5.5% CO2、37±1℃孵箱中培养，每天换液；液下培养2天后，改为气液面培养，继续培养7天后，对此双层皮肤模型进行组织固定，HE染色，结果如图2所示。
其中，消化液包括0.25％胰酶和0.02％乙二胺四乙酸EDTA的磷酸盐缓冲液PBS。
培养液Ⅰ包括DMEM，胶原酶、透明质酸、谷氨酰胺、孕酮、丁二胺、硒酸钠和转铁蛋白，其中，胶原酶的浓度为200U•mL-1、透明质酸的浓度为300U•mL-1、谷氨酰胺的浓度为10mM、孕酮的浓度为10nM、丁二胺的浓度为50μM、硒酸钠的浓度为30nM，转铁蛋白的浓度为80ng/mL。
培养液Ⅱ包括10％胎牛血清FBS和90％DMEM。
培养液Ⅲ包括DMEM、FBS、维生素C和维生素E，培养液Ⅲ中DMEM和FBS的体积比为9：1，其中，维生素C的浓度为100mg/L，维生素E的浓度为20mg/L。
培养液Ⅳ包括75％DMEM和25％DMEM/F12，以及胎牛血清、NaHCO3、阿魏酸钠、维生素C、维生素E、α-硫辛酸、转化生长因子TGF-β、表皮生长因子EGF、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、孕酮、丁二胺、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白和血管生长因子，DMEM/F12是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:3的比例混合的，其中，胎牛血清的浓度为10％、NaHCO3的浓度为5mg/ml、阿魏酸钠的浓度为10μg/ml、维生素C的浓度为100mg/L、维生素E的浓度为20mg/L、α-硫辛酸的浓度为50μM、转化生长因子TGF-β的浓度为10μg/L、表皮生长因子EGF的浓度为10μg/L、胰岛素的浓度为30ng/ml、氢化可的松的浓度为180ng/L、腺嘌呤的浓度为60μg/ml、孕酮的浓度为50nM、丁二胺的浓度为60μM、碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml、转铁蛋白的浓度为20ng/ml、血管生长因子的浓度为10ng/ml。
培养液Ⅴ为：75％DMEM和25％DMEM/F12，胎牛血清，NaHCO3，维生素C，维生素E，转化生长因子TGF-β，阿魏酸钠，胰岛素，CaCl2，氢化可的松，腺嘌呤，表皮生长因子EGF，碱性成纤维细胞生长因子，转铁蛋白和血管生长因子。DMEM/F12是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:3的比例混合的。其中，胎牛血清的浓度为10％，NaHCO3的浓度为5mg/mL，维生素C的浓度为100μg/mL，维生素E 的浓度为20mg/L，转化生长因子TGF-β的浓度为10μg/L，阿魏酸钠的浓度为10μg/ml，胰岛素的浓度为30ng/mL，CaCl2的浓度为0.5mmol/mL，氢化可的松的浓度为150ng/L，腺嘌呤的浓度为60μg/mL，表皮生长因子EGF的浓度为10μg/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/mL，转铁蛋白的浓度为20ng/ml，血管生长因子的浓度为10ng/ml。
如图2所示，本方法构建的全层皮肤模型真皮层成纤维细胞状态良好、密度较大，表皮层生发良好，基底层细胞呈柱状排列，复层化明显，可见基底层、棘层、颗粒层、角质层结构。
本发明实施例提供一种无外源支架的真皮构建方法，无外源支架的真皮由成纤维细胞及其自身分泌的细胞外基质构成。基于上述实施例的描述，针对目前无外源支架的人工真皮厚度小，细胞密度低，培养时间长等缺点，通过优化培养体系，在其中添加一些能够促进成纤维细胞增殖和ECM分泌的活性成分，构建出一种细胞密度高、厚度大、稳定性好的无外源支架的真皮替代物。此真皮替代物可用于组织工程全层皮肤的构建。
实施例2
本发明实施例还提供一种培养液，培养液应用于如实施例1中任意一项的无外源支架的真皮构建方法中，培养液为无外源支架的真皮构建方法中的培养液Ⅳ；
其中，培养液Ⅳ包括75％DMEM和25％DMEM/F12，以及胎牛血清、NaHCO3、阿魏酸钠、维生素C、维生素E、α-硫辛酸、转化生长因子TGF-β、表皮生长因子EGF、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、孕酮、丁二胺、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白和血管生长因子，DMEM/F12是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:3的比例混合的。
进一步地，胎牛血清的浓度为3～10％、NaHCO3的浓度为3～5mg/ml、阿魏酸钠的浓度为2~10μg/ml、维生素C的浓度为50～100mg/L、维生素E的浓度为10~20mg/L、α-硫辛酸的浓度为30~50μM、转化生长因子TGF-β的浓度为5～10μg/L、表皮生长因子EGF的浓度为5～10μg/L、胰岛素的浓度为15～30ng/ml、氢化可的松的浓度为150～180ng/L、腺嘌呤的浓度为55～75μg/ml、孕酮的浓度为30～50nM、丁二胺的浓度为30～60μM、碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8～12ng/ml、转铁蛋白的浓度为10～20ng/ml、血管生长因子的浓度为5～10ng/ml。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (1)

1.一种无外源支架的真皮构建方法，其特征在于，无外源支架的真皮由成纤维细胞及其自身分泌的细胞外基质构成，所述无外源支架的真皮构建方法包括以下步骤：
步骤一、成纤维细胞的分离培养
将已去除脂肪和结缔组织的1mm3的皮肤组织置于培养液Ⅰ中，放置于4℃过夜；加入等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；以每毫升2×105～4×105个细胞接种于培养液Ⅱ，5％CO2、37℃条件下培养；经传代后，取第5~7代细胞；
步骤二、真皮层构建
获取步骤一所得的第5～7代成纤维细胞，按照每毫升培养液Ⅲ含0.5×106～3×106个成纤维细胞的密度进行接种；置于5％CO2、37℃条件下培养2～3小时后，加入培养液Ⅳ培养；每隔22～26小时更换培养液Ⅳ一次，共培养9~10天；
其中，所述消化液由0.25％胰酶和0.02％乙二胺四乙酸EDTA的磷酸盐缓冲液PBS组成；培养液Ⅱ由10％胎牛血清FBS和90％DMEM组成；
所述培养液Ⅰ由DMEM，胶原酶、透明质酸、谷氨酰胺、孕酮、丁二胺、硒酸钠和转铁蛋白组成，其中，所述胶原酶的浓度为200U•mL-1、所述透明质酸的浓度为300U•mL-1、所述谷氨酰胺的浓度为2～10mM、所述孕酮的浓度为10～20nM、所述丁二胺的浓度为30～60μM、所述硒酸钠的浓度为15～30nM、所述转铁蛋白的浓度为65～100ng/mL；
所述培养液Ⅲ由DMEM、FBS、维生素C和维生素E组成，所述培养液Ⅲ中DMEM和FBS的体积比为9：1，其中，所述维生素C的浓度为50～100mg/L，所述维生素E的浓度为10~20mg/L；
所述培养液Ⅳ由75％DMEM和25％DMEM/F12，以及胎牛血清、NaHCO3、阿魏酸钠、维生素C、维生素E、α-硫辛酸、转化生长因子TGF-β、表皮生长因子EGF、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤、孕酮、丁二胺、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白和血管生长因子组成，所述DMEM/F12是F12培养液和DMEM培养液以体积比1:3的比例混合的，其中，所述胎牛血清的浓度为3～10％、所述NaHCO3的浓度为3～5mg/ml、所述阿魏酸钠的浓度为2~10μg/ml、所述维生素C的浓度为50～100mg/L、所述维生素E的浓度为10~20mg/L、所述α-硫辛酸的浓度为30~50μM、所述转化生长因子TGF-β的浓度为5～10μg/L、所述表皮生长因子EGF的浓度为5～10μg/L、所述胰岛素的浓度为15～30ng/ml、所述氢化可的松的浓度为150～180ng/L、所述腺嘌呤的浓度为55～75μg/ml、所述孕酮的浓度为30～50nM、所述丁二胺的浓度为30～60μM、所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8～12ng/ml、所述转铁蛋白的浓度为10～20ng/ml、所述血管生长因子的浓度为5～10ng/ml。
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