KR20090040808A - 세포의 3차원 구조를 유지하는 피부재생용 조성물 및 그제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 섬유아세포; 세포응집 억제제; 및 3차원 구조 유지체를 포함하여 이루어지는 피부재생용 조성물 및 그 제조방법을 제공한다. 본 발명의 피부재생용 조성물은 세포가 3차원 구조를 유지하게 함으로써, 피험자에게로의 세포 주입이 잘 이루어질 수 있도록 한다.

섬유아세포, 피부재생, 세포주입, 세포응집, 3차원 구조

Description

세포의 3차원 구조를 유지하는 피부재생용 조성물 및 그 제조방법{Composition for skin regeneration with 3-dimensional self-supporting cell structure and method for preparing thereof}

본 발명은 세포의 3차원 구조를 유지하는 피부재생용 조성물 및 그 제조방법 에 관한 것이다.

피부 재생과 관련된 의료기술은 화상 치료에서부터 시작되었다. 현재, 피부재생 의료기술은 항노화, 미백, 주름이나 상처 자국의 개선 등 성형(미용)의학 분야까지 확장되어 있다.

이와 같은 피부재생을 실시하기 위해서는 먼저, 피험자로부터 채취된 생검 재료를 배양 배지 속에서-실질적으로 면역원성 단백질이 함유되지 않도록 배양(계대배양)한다. 그리고 상기 배양된 피험자의 세포 현탁액(배양액)을 피험자의 피하 또는 피하 조직에 주입하여 주름이나 상처 자국 등을 수정할 수 있다.

피험자에게 배양 세포를 투여하기 위해서는 가령, 섬유아세포 현탁액과 같은 세포 배양액을 주사기에 채운 후 주사침을 사용하여 가능한 한 피부 표면에 가까운 부분에 상기 주사침을 삽입하고, 약하게 압력을 걸어 피부 내 주사를 실시한다. 그러나 섬유아세포 등의 계대배양 세포를 고밀도의 세포현탁액 상태인 채로 일정 시간 방치하면, 세포가 서로 응집하여 거대화한다. 그 결과 상기 거대화된 응집 세포는 단백질 분해 효소 등을 작용시켜도 단세포(single cell) 부유 현탁액으로 재조정하기는 어렵다. 이와 같이 응집된 세포덩어리는 주사침에 의한 세포 주입을 어렵게 만들고, 세포 주입시 피험자에게 주는 고통이 커진다는 문제점이 있다.

본 발명의 목적은 세포응집을 억제하고 세포의 3차원 구조를 유지하여 피험자에게로의 세포주입이 용이한 피부재생용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 피부재생용 조성물의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명은 섬유아세포; 세포응집 억제제; 및 3차원 구조 유지체를 포함하여 이루어지는 피부재생용 조성물을 제공한다.

상기 섬유아세포는 자가 진피 섬유아세포 (autologous dermal fibroblast)를 포함할 수 있다.

상기 세포응집억제제는 국소마취제를 포함할 수 있다.

상기 3차원 구조 유지체는 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 섬유아세포를 배양하여 섬유아세포 배양액을 준비하는 단계; 상기 섬유아세포 배양액에 세포응집 억제제를 첨가하는 단계; 및 상기 세포응집 억제제가 첨가된 섬유아세포 배양액에 3차원 구조 유지체를 첨가하여 3차원 구조를 구축하는 단계를 포함하여 이루어지는 피부재생용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 피부재생용 조성물을 이용하여 피험자의 피부에 세포주입이 용이하게 이루어지게 할 수 있다.

배양시트(sheet)에 배양된 세포를 그대로 이식하는 경우는 세포의 운동성이 떨어지고, 세포간 간격을 유지하기 힘들어 세포의 생존율 등이 낮아지게 된다. 또한 단순히 일반 배양액 형태로 세포 조성물을 피험자에게 주입하는 경우, 세포형태 유지, 공간 및 수분유지 등에 있어 3차원 구조를 유지하면서 주입되는 것에 비해 세포 생존율이 낮아진다

실제 세포 이식 조작을 수행하는 경우, 이식될 세포를 일정 시간 동안 단세포(single cell) 상태로 유지하면서 세포의 생물 활성 능력 (viability)을 보전하는 것이 매우 중요하다. 즉, 이식될 세포는 세포 이식시 단세포 상태로 존재하여야 한다. 특히 주사침 등을 사용하여 세포를 이식하는 경우, 주사침의 노즐 내를 응집된 세포덩어리는 통과할 수 없기 때문이다. 또 일단 응집된 세포덩어리를 다시 단세포로 되돌리려면 장시간 세포덩어리를 효소에 노출시켜야 하는데, 이와 같은 장시간의 효소 노출은 세포의 생물 활성 능력을 현저하게 저하시킨다.

게다가, 피부 특히 진피(dermis)는 두께를 가지고 있기 때문에 3차원 장기라 할 수 있다. 따라서 진피와 같은 세포를 생체 외에서 배양하여 생체로 되돌리기 위해서는 3차원 구조를 유지하는 것이 중요하다. 즉, 생체 외에서 평면배양한 세포를 생체로 되돌릴 때에는 입체구조를 부여할 필요가 있는 것이다.

본 발명의 피부재생용 조성물은 섬유아세포; 세포응집 억제제; 및 3차원 구조유지체를 포함하고 있어서 세포의 생물 활성 능력을 일정하게 유지함과 동시에 세포의 3차원 구조를 유지할 수 있다.

상기 섬유아세포는 콜라겐을 생성하는 세포로, 세포분열을 하여 그 수를 늘린다. 상기 섬유아세포는 다음과 같은 방법으로 배양하여 얻을 수 있다.

먼저, 상기 섬유아세포를 이 분야에서 이용가능한 통상의 방법에 의해 분리하여 준비한다. 바람직한 것은 피험자(환자) 자신의 피부 조직으로부터 준비되는 자가 진피 섬유아세포(autologus dermal fibroblast)이다. 이러한 진피 섬유아세포는 거부반응을 일으키지 않고 조직적합성이 매우 뛰어나다.

상기 피험자로부터 분리해 낸 피부조직은 항생제 또는 항균제를 포함한 물질로 여러 번 세척한다. 이는 섬유아세포를 배양하는 단계에서 발생할 수 있는 오염을 예방하기 위한 것이다. 상기 세척에 사용하는 물질에는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등과 같은 배지를 이용할 수 있다.

상기와 같은 섬유아세포 배양시 이 분야에서 공지된 바와 같이 EDTA-트립신 처리를 하거나 보존을 위하여 동결건조할 수도 있다. 상기 배양액은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등과 같은 통상의 것을 이용할 수 있다.

상기 배지에는 피험자의 혈액으로부터 얻은 자가혈청이 포함될 수 있다. 자가혈청 속에는 피브로넥틴(fibronectin), 상피세포 성장인자(EGF), 섬유아세포 성 장인자 (fibroblast growth factor), 비타민 A, substance P, α2 antiglobulin 등이 포함되며, 혈청에 있는 면역 단백질 (항체, 보체 등)은 세균을 억제하거나 죽이는 역할을 한다. 특히, 환자에서 분리한 자가혈청은 타인의 혈청에 비하여 면역 반응이 전혀 없으므로 세포성장과 조직형성에 탁월한 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 첨가되는 자가혈청의 농도는 0.001∼20%인 것이 바람직하다. 이 범위를 벗어나는 경우에는 섬유아세포의 배양이 잘 이루어지지 않는다.

또한 상기 배지에는 태반추출물이 첨가될 수 있다. 태반은 산모의 체내에서 산소의 공급, 해독작용 및 호르몬 분비 등의 작용을 하는 것으로 그 유효 성분은 아미노산과 비타민, 미네랄, 다수의 효소 및 핵산이다. 본 발명에서 태반은 사람이나 소 등의 특정 포유동물의 것으로 한정되는 것은 아니며, 포유동물의 태반이면 모두 적당하다. 상기 태반의 추출물은 주름생성을 억제하고 콜라겐 생성을 촉진함은 물론, 섬유아세포의 다량 증식에도 효과적이다.

상기 태반추출물은 이 분야에서 알려진 통상의 방법으로 제조된 것을 사용하는데, (주)멜스몬에서 제조, 판매하고 있는 태반추출물을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 섬유아세포 배양시 첨가되는 태반추출물의 농도는 0.05∼20 %인 것이 바람직하다.

상기 배양된 섬유아세포는 트립신 처리되어 성장 배지가 포함된 새로운 플라스크로 옮겨진 다음 계대 배양된다. 이때 상기 플라스크에는 태반추출물 및/또는 자가혈청이 포함될 수 있다. 상기 플라스크에서 배양이 충분히 이루어지면 기존의 성장 배지는 다시 새로운 성장 배지로 바꾸어 준다. 상기 세포들은 30∼40℃의 온 도에서 5∼20 시간 동안 인큐베이션된다.

상기 배지에서의 인큐베이션이 완료되면 트립신-EDTA를 이용하여 배양기에서 섬유아세포를 분리하여 얻는다. 분리된 섬유아세포는 원심분리나 재현탁(resuspension)을 하여 충분히 세척하고 같은 양의 식염수와 섞어 섬유아세포 현탁액을 얻을 수 있다. 여기에 피브린 및 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 섬유아세포 현탁액은 단세포의 부유 현탁액이다. 그러나 상기 현탁액은일정 시간이 지나면 서로 응집하여 거대화되어 버려 단백질 분해 효소 등을 첨가하여도 다시 단세포 상태로 되돌리기 어렵다. 또한 이와 같이 응집된 세포 덩어리는 주사침에 의한 세포 주입을 어렵게 만든다.

본 발명의 피부재생용 조성물은 상기와 같은 세포응집을 억제하기 위하여 세포응집 억제제를 포함한다.

상기 세포응집 억제제는 세포의 응집작용을 억제하는 역할을 하는 것으로서, 국소마취약을 포함할 수 있다. 상기 국소마취약으로는 리도카인, 메피바카인, 디부카인, 부피바카인 및 프로피바카인 등의 아미드형 국소마취약 또는 코카인, 프로카인, 클로로프로카인 및 테트라카인 등의 에스테르형 국소마취약을 이용하는 것이 바람직하다. 이 중에서도 다른 국소마취약에 비해 안전 영역이 넓고, 마취 작용 및 세포응집 억제작용이 빠르고 그 지속 시간도 길다는 점에서 리도카인 및 그 약학적으로 허용될 수 있는 염이 특히 바람직하다.

본 발명의 피부재생용 조성물은 또한 섬유아세포의 3차원 구조를 유지하기 위해 3차원 구조 유지체를 포함하고 있다.

'3차원 구조 유지체(3-dimensional self-supporting material)'란, 생체 외에서 평면배양한 세포를 생체로 되돌릴 때 입체구조를 부여하기 위해 사용되는 물질을 말한다.

상기 3차원 구조 유지체로는 히알루론산(Hyaluronic acid)이 바람직하다.

상기 히알루론산은 세포간질 (intercellular substance)에 광범위하게 분포되어 있는 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan:GAG)의 일종으로서, 소의 안구를 채우고 있는 액체에서 처음 발견되었으며 골세포에서도 세포외 기질 중 하나로 존재하는 것으로 알려져 있다.

세포외 기질의 주요성분인 히알루론산은 조직의 증식 및 재생, 그리고 상처 치유시 그 양이 증가한다. 또한 히알루론산은 수분을 함유하는 능력을 가지고 있어서 조직의 수분 함량을 유지하여 세포외 공간을 유지하고 전해질과 영양소의 이동을 촉진시킨다.

히알루론산은 생리적 환경에서 세포간질 분자의 구성요소로 작용하여 각종 결합 단백질, 프로테오글리칸(proteoglycan) 및 성장인자들과 상호작용을 하고, 혈장과 단백질의 선택적인 투과에 영향을 미치는 수분 균형을 능동적으로 조절한다. 상기 히알루론산을 포함하는 본 발명의 피부재생용 조성물은 조직의 수분 함량 및 세포외 공간을 유지하며 전해질과 영양소의 이동을 촉진시킴으로써 세포의 3차원 구조 유지체 역할을 하게 된다.

이상과 같이, 본 발명의 피부재새용 조성물은 섬유아세포; 상기 섬유아세포 의 응집을 억제하는 세포응집 억제제; 그리고 상기 섬유아세포의 3차원 구조를 형성하고 유지시키는 3차원 구조 유지체로 이루어져 있다. 따라서 본 발명의 피부재생용 조성물은 세포응집이 억제되므로 단세포 상태로 세포의 생물 활성 능력을 일정하게 유지하게 된다. 또한 본 발명의 피부재생용 조성물은 주사기 내에서 세포 응집이 일어나지 않고 피험자의 피부 조직에 쉽게 주입되어 피험자 체내에서 섬유아세포의 증식을 촉진한다.

또한 상기 3차원 구조 유지체는 세포의 3차원 구조를 구축하여 그 입체 구조를 유지한 채 피험자 체내에 주입되어 세포의 활발한 운동성을 확보하는 역할을 한다. 동시에 상기 3차원 구조 유지체는 세포형태 유지, 적절한 공간 및 수분유지 등의 역할을 함으로써 피험자에게 주입된 세포 조성물의 생존율을 높이고 섬유아세포의 증식을 촉진한다.

Claims (6)

1. 섬유아세포;

   세포응집 억제제; 및

   3차원 구조 유지체;

   를 포함하여 이루어지는 피부재생용 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 섬유아세포는 자가 진피 섬유아세포 (autologous dermal fibroblast)를 포함하는 것인 피부재생용 조성물.
3. 제1항에 있어서,

   상기 세포응집억제제는 국소마취제를 포함하는 것인 피부재생용 조성물.
4. 제1항에 있어서,

   상기 3차원 구조 유지체는 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함하는 것인 피부재생용 조성물.
5. 섬유아세포를 배양하여 섬유아세포를 준비하는 단계;

   상기 배양된 섬유아세포에 세포응집 억제제를 첨가하는 단계; 및

   상기 세포응집 억제제가 첨가된 섬유아세포에 3차원 구조 유지체를 첨가하여 3차원 구조를 구축하는 단계;

   를 포함하여 이루어지는 피부재생용 조성물의 제조방법.
6. 제5항에 있어서,

   상기 섬유아세포 준비는 자가혈청 및 태반추출물을 함유한 배지에서 섬유아세포를 계대배양하여 준비하는 것인 피부재생용 조성물의 제조방법.