RU2281776C1 - Биотрансплантат и способ коррекции дефектов мягких тканей, способ получения биотрансплантата - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области фармацевтической химии и лекарственных средств, может быть использовано для лечения парадонтита, в пластической медицине для лечения в том числе возрастных изменений кожи лица и др., для лечения алопеции неандрогенного происхождения. Биотрансплантат, представляющий собой суспензию аутологичных фибробластов с эффективностью клонирования 40-60% в аутологичной сыворотке, способ получения заявленного биотрансплантата, включающий культивирование аутологичных фибробластов в определенных условиях и отбор клеток с меньшей адгезией к поверхности и способ коррекции дефектов мягких тканей человека по определенной схеме. Изобретение обеспечивает высокий терапевтический эффект, отсутствие побочных эффектов и осложнений. 3 н. и 7 з.п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к области фармацевтической химии и лекарственных средств, а именно к биотрансплантатам для коррекции дефектов мягких тканей, способам получения таких биотрансплантатов и способам коррекции дефектов мягких тканей, и может быть использовано для лечения пародонтита, в пластической хирургии для лечения в том числе возрастных изменений кожи лица, шеи, рук, декольте и бедер, для лечения алопеции неандрогенного происхождения.

В настоящее время для коррекции дефектов мягких тканей человека используют жидкий силикон (Rees Т.О. Plast reconstr. Surg., 1977, vl, p 79), который вводят под кожу; известно эпидермальное введение аскорбиновой кислоты и витамина А (пат. US 4603146, 1986); в патенте RU 2135122, 1998 описан имплантант, представляющий собой золотые нити и/или биополимерный гель (полидиметилсилоксановую жидкость), которые вводят в субдермальное пространство и в месте введения начинается резкая активизация метаболических и регенерационных процессов вокруг имплантанта. Общим недостатком трансплантатов из «чужеродных» материалов является возможная реакция организма на введение чужеродных веществ вплоть до их отторжения, аллергические и воспалительные процессы в местах введения трансплантата, необходимость повторных операций, непредсказуемые неблагоприятные эстетические последствия.

В зарубежных патентах описаны биотрансплантаты, представляющие собой суспензию аллогенных или аутологичных дермальных фибробластов. Так, в патенте WO 98/40027 описан биотрансплантат с концентрацией дермальных аутологичных фибробластов от 0,5×10⁶ до 10×10⁶ клеток/мл в коллаген/фибробластном геле, культивированных в этом субстрате в течение 4-5 недель для замены экзогенного коллагена на эндогенный. В другом патенте (патент США 5660850, 1997) также используют культивируемые аутологичные фибробласты для коррекции дефектов мягких тканей у человека.

Известен дермальный аутотрансплантат, представляющий собой кожный лоскут, который вводят под кожу в специально создаваемый карман (патент США 5397352,1995).

Недостатком известных аллогенных и аутологичных биотрансплантатов является неустойчивость терапевтического эффекта, которая напрямую зависит от эффективности клонирования фибробластов, зависящая в свою очередь как от индивидуальных свойств отдельного пациента, так и от других факторов, например возраста, состояния здоровья и т.д.

Известно, что эффективность клонирования фибробластов может составлять от 10 до 60% (Терехов С.М., Гецадзе Х.А., Гринберг К.Н. Индивидуальная изменчивость пролиферативного потенциала диплоидных фибробластов человека in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1984, №4, стр.465-466) и такой широкий диапазон в значительной степени влияет на результаты лечения.

Задачей настоящего изобретения является создание биотрансплантата с высокой эффективностью клонирования аутологичных фибробластов, лишенного указанных выше недостатков, позволяющего получать устойчиво высокий терапевтический эффект.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

В группу изобретений входят:

- биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей, представляющий собой суспензию аутологичных фибробластов с эффективностью клонирования 40-60% в 20-50%-ной аутологичной сыворотке с содержанием 1.5×10⁶-3×10⁷ клеток/мл биотрансплантата;

- способ коррекции дефектов мягких тканей с использованием предложенного биотрансплантата по определенной схеме;

- способ получения заявленного биотрансплантата, включающий культивирование аутологичных фибробластов в определенных условиях.

Технический результат при использовании изобретения заключается в высоком терапевтическом эффекте, который достигается благодаря высокой эффективности клонирования фибробластов на уровне 40-60%, отсутствии осложнений. Данный технический результат достигается также способом получения биотрансплантата, который позволяет получить фибробласты с эффективностью клонирования 40-60%.

Способ получения заявленного биотрансплантата состоит в следующем: у пациента берут кусочек кожи с внутренней поверхности предплечья верхней трети руки или из-за ушной области. Предварительно кожу дезинфицируют 70% этиловым спиртом. После дезинфекции кожу захватывают глазным хирургическим пинцетом, оттягивают и отсекают кусочек кожи непосредственно под браншами пинцета размером 3-5 мм. Биоптат промывают в растворе питательной среды ДМЕМ с антибиотиком (гентамицин, 50 мкг/мл) и помещают на 12 часов в 0,25% раствор трипсина для отделения дермы от эпидермиса и жировой ткани при 4°С. Эпидермис и жировую ткань отбрасывают. Отделенный кусочек дермы промывают в физиологическом растворе с антибиотиками. Образец переносят для культивирования во флакон с питательной средой, состоящей из 90% среды ДМЕМ, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 20 ммоль MOPS (pH 7,4), 0,1-0,5% коллагеназы и антибиотиков (гентамицин, 30 мкг/мл). Флакон с образцом помещают в термостат при 37°С на 7-10 суток. Каждые 3 часа, в течение рабочего дня, содержимое флакона аккуратно перемешивают.

Подобный режим позволяет осуществить дезагрегирование дермы с высвобождением одиночных клеток фибробластов, но не препятствует ни их адгезии, ни размножению. Таким образом, данная процедура позволяет в течение 7-10 суток полностью дезагрегировать образец дермы и получить множество зон роста фибробластов по всей площади флакона.

После 10 суток культивирования клетки трипсинизируют и переносят в новый 75 см² культуральный флакон с питательной средой, состоящей из 80% среды ДМЕМ, 20% ЭТС, 20 ммоль MOPS (pH 7,4), антибиотиков (гентамицин, 30 мкг/мл) из расчета не более 50 клеток на 1 см² и инкубируют при 37°С 14-16 суток. Каждые 72 часа производят смену питательной среды.

Для отбора клонов с наиболее высокой эффективностью клонирования (пролиферативным потенциалом) культуру клеток в культуральном флаконе промывают раствором Версена, предварительно охлажденный до +4°С, в течение 3-5мин. Раствор Версена сливают и далее добавляют 0,1% раствор трипсина, также предварительно охлажденным до +4°С на 10-15 мин. Затем трипсин удаляют, а культуру клеток под наблюдением в инвертированный микроскоп выдерживают до появления первых ошаренных клеток, открепленных от дна культурального флакона. Далее во флакон вносят культуральную среду, состоящую из 90% среды ДМЕМ, 10% ЭТС, 20 ммоль MOPS (pH 7,4), в которой ресуспендируют открепившиеся от субстрата клетки. Культуральную среду с открепившимися от субстрата клетками отбирают и рассеивают в культуральные флаконы в соотношении 1:2-1:4 и культивируют до достижения конфлуэнтного слоя.

Эта процедура позволяет отобрать клоны фибробластов с наибольшей скоростью пролиферации (эффективностью клонирования) и высокой секрецией коллагена I типа, которые в отличие от медленно делящихся клонов слабее адгезируются на поверхности культурального флакона и открепляются в первую очередь. Клетки, перед получением готовой клеточной суспензии, отмывают от ЭТС, инкубируют в течение 18 часов в среде, содержащей 90% ДМЕМ и 10% аутологичной сыворотки пациента, для исключения аллергических реакций на компоненты эмбриональной телячьей сыворотки.

В отличие от других способов культивирования данная методика позволяет с минимальными повреждениями выделить из биоптата только кожи фибробласты и далее отобрать из них клоны с наиболее высокой эффективностью клонирования для дальнейшего культивирования.

После успешного культивирования часть выведенной культуры фибробластов можно подвергнуть криоконсервированию в криобанке, где в жидком азоте они могут храниться бессрочно. Запас замороженных клеток дает возможность проводить процедуры фармакопунктуры в определенно назначенное время.

Предлагаемый способ коррекции дефектов мягких тканей человека заключается в следующем.

Полученный биотрансплантат (аутологичные культуры фибробластов для инъекций) суспендируют в стерильном физиологическом растворе либо растворе Рингера с 20-50% аутологичной сыворткой. Готовые суспензии хранят при 4°С. Биотрансплантат используют в течение 2-4 часов после получения суспензии. Добавление аутологичной сыворотки способствует лучшей сохранности клеток и большей эффективности процедуры фармакопунктуры.

Клетки вводят дву-пятикратно с интервалом 1-2 недели.

При возрастных изменениях кожи лица клетки вводят дву-четырехкратно с интервалом в 2 недели туннельным способом и папулами. Количество клеток на полный курс - 8-12×10⁷. Если курс состоит из двух процедур, то клетки вводят по 4-6×10⁷ аутологичных фибробластов в 2-3 мл физиологического раствора для инъекций. Если курс из четырех процедур, то вводят 2-3×10⁷ аутологичных фибробластов в 2-3 мл физиологического раствора для инъекций. Биотрансплантат вводят как вдоль, так и поперек морщин.

При диффузных и очаговых алопециях неандрогенного происхождения и после пересадки волос вследствие андрогенного, биотрансплантат вводят внутрикожно папулами в участки поредения и исчезновения волос в количестве 5×10⁶ клеток в 3 мл физиологического раствора для инъекций пятикратно с интервалом 1-2 недели.

При пародонтите биотрансплантат вводят папулами в альвеолярные отростки и под слизистую десны в количестве 10×10⁶ клеток в 1,5-2 мл физиологического раствора для инъекций трехкратно с интервалом в неделю.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Доброволец Т. 52 г., пол мужской. При осмотре кожи лица обнаружено: снижение тургора кожи в области щек, подбородка; глубокие морщины в области носогубных складок, на переносице, лбу, вокруг глаз; обезвоживание и птоз мягких тканей лица (изменение контура лица).

Диагноз: возрастные изменения кожи лица.

Коррекция проблемных зон кожи лица была проведена заявленным способом с использованием предложенного биотрансплантата.

Назначение: пересадка аутологичных фибробластов в проблемные зоны кожи лица.

Для этого у добровольца был взят кусочек кожи с внутренней поверхности предплечья верхней трети руки. Биоптат после промывки в растворе питательной среды ДМЕМ с антибиотиком (гентамицин, 50 мкг/мл) был помещен на 12 часов в 0,25% раствор трипсина для отделения дермы от эпидермиса и жировой ткани при 4°С. Отделенный кусочек дермы был промыт в физиологическом растворе с антибиотиком. Образец дермы был перенесен для культивирования во флакон площадью 25 см² с питательной средой в объеме 7мл, состоящей из 90% среды ДМЕМ, 10% ЭТС, 20 ммоль MOPS (pH 7,4), 0,4% коллагеназы и добавлением антибиотиков (гентамицин, 30 мкг/мл). Флакон с образцом был помещен в термостат при 37°С на 9 суток. Каждые 3 часа в течение рабочего дня содержимое флакона аккуратно перемешивали. После 9 суток культивирования клетки были трипсинизированы и перенесены в новый культуральный флакон площадью 75 см² с питательной средой в объеме 20 мл, состоящей из 80% среды ДМЕМ, 20% ЭТС, 20 ммоль MOPS (pH 7,4) и антибиотиков (гентамицин, 30 мкг/мл) из расчета не более 50 клеток на 1 см². Далее клетки инкубировали при 37°С 15 суток. Каждые 72 часа производилась смена питательной среды. На 16 сутки культура клеток была промыта охлажденным до +4°С раствором Версена и далее залита 0,1% раствором трипсина, также предварительно охлажденным до +4°С, на 10 мин. После удаления трипсина во флакон было внесено 25 мл культуральной среды, состоящей из 90% среды ДМЕМ, 10% ЭТС, 20 ммоль MOPS (pH 7,4), в которой были ресуспендированы открепившиеся от субстрата клетки. Далее клетки были рассеяны в 4 культуральных флакона площадью 75 см ² с питательной средой в объеме 20 мл, состоящей из 80% среды ДМЕМ, 20% ЭТС, 20 ммоль MOPS (pH 7,4) и антибиотиков (гентамицин, 30 мкг/мл). Через 3 суток среда во флаконах была заменена на свежую, через 7 суток после рассева во флаконах был получен конфлуентный слой клеток. Далее клетки из каждого флакона после обработки трипсином были рассеяны в 3 новых флакона площадью 175 см² с питательной средой в объеме 70 мл. Через 3 суток среда во флаконах была заменена на свежую, а через 7 суток после рассева во флаконах был получен конфлуентный слой клеток. На 8 сутки клетки промывали раствором Версена, обрабатывали трипсином и ресуспендировали в физиологическом растворе.

Для получения готовой клеточной суспензии клетки смывали трипсином, отмывали от ЭТС путем инкубирования в течение 18 ч с двухкратной сменой среды, состоящей из 90% ДМЕМ и 10% аутологичной сыворотки.

Биотрансплантат в концентрации 6×10⁷ клеток в 3 мл физиологического раствора для инъекций двухкратно с интервалом 2 недели был инъецирован добровольцу в поверхностный или средний слой дермы туннельным способом. Вкол производили внутрикожно (инсулиновая игла 25,4 мм, 30 G) параллельно ходу морщины или поперек с интервалом 8-10 мм, на вколе производили введение 0,05 мл препарата; в случае сниженного тонуса кожи и мелких морщин препарат вводили папуллами в проблемную зону: вколы производили на глубину 2 мм по параллельным линиям с интервалом 5-8 мм.

Перед инъекциями поверхность кожи обрабатывали 0,5% раствором хлоргексидина, затем проводили местную анестезию 5% кремом Эмла.

Наблюдения за клиническими результатами проводили посредством фотографирования пациента до, после и через 6 мес. после курса лечения.

Результаты оценивали по сравнительному анализу фото до и после пересадки фибробластов, а также по данным визуального наблюдения.

Через 6 месяцев после пересадки фибробластов наблюдали сглаживание морщин и крупных складок лба; сглаживание морщин на переносице и в латеральной подглазничной области глаз; уменьшилась выраженность и глубина носогубных складок; заметно улучшился тургор кожи, улучшился контур и цвет лица.

Пример 2

Доброволец К. 48 лет, пол женский.

При осмотре ротовой полости выявлены: подвижность зубов, кровоточивость десен, неприятный запах изо рта и невозможность полноценно пережевывать пищу. При клиническом и рентгенологическом исследовании поставлен диагноз пародонтит.

Назначение: пересадка аутологичных фибробластов в альвеолярные отростки и под слизистую десны.

У добровольца был взят биоптат с внутренней поверхности предплечья нижней трети руки диаметром 3 мм. Культура фибробластов для инъекций была получена таким же способом, как это описано в примере 1, но раствор коллагеназы использовали 0.1%.

Пациенту провели профессиональную гигиену полости рта и глубокий кюретаж патологических карманов. Затем в альвеолярные отростки и под слизистую десны вводили 10×10⁶ клеток, разведенных в 2 мл физиологического раствора с 20% аутологичной сыворотки папулами посредством инсулиновой иглы 13 мм 30 G. Инъекции были выполнены трехкратно с интервалом в 1 неделю.

Наблюдения за клиническими результатами проводили посредством фотографирования ротовой полости пациента до, после и через 6 мес. после курса лечения.

Через 6 месяцев было выявлено: улучшение состояния слизистой оболочки альвеолярных отростков и их плотное сращение с тканями зубов, уменьшение или исчезновение подвижности зубов, улучшение кровоснабжения слизистой оболочки, исчезновение неприятного запаха изо рта.

Пример 3

Доброволец В. 32 г, пол женский.

При осмотре пациентки выявлено равномерное диффузное прорежение волос по всей волосистой части головы (на фоне психоэмоционального стресса).

У пациентки был взят биоптат кожи из заушной области диаметром 5 мм. Культура фибробластов для инъекций была получена таким же способом, как это описано в примере 1, но раствор коллагеназы использовали 0.3%. Биотрансплантат в количестве 5×10⁶ клеток в 3 мл физиологического раствора с 20% аутологичной сыворотки вводили внутрикожно по всей волосистой части головы папулами на расстоянии 0.5-1 см друг от друга. Биотрансплантат вводили с интервалом в 1 неделю между инъекциями пятикратно инсулиновой иглой 13 мм 30G.

Перед введением фибробластов кожу головы обрабатывали 0,05% раствором хлоргексидина.

Результаты оценивали по сравнительному анализу фото до и после пересадки фибробластов, а также по данным визуального наблюдения.

Результаты: под действием аутологичных фибробластов прекратилось патологическое выпадение волос, наблюдалась стимуляция роста волос за счет активации волосяных луковиц. При этом из луковиц сначала отметили появление пушковых волос, которые затем постепенно утолщались и крепли.

Возрастные изменения кожи

Лечение получали 27 пациентов в возрасте 33-65 лет, из которых 14 мужчин и 13 женщин с признаками возрастных изменений кожи в виде мелких морщин периорбитальной области, средних и глубоких морщин в области лба и носогубных складок. Клинический эффект наблюдали спустя 2-3 месяца после введения клеток. Длительность наблюдения - 12 месяцев и продолжаются до настоящего времени. Аллергических реакций не отметили ни у одного пациента. Наблюдение за клиническими результатами проводили посредством фотографирования пациентов до и после курса лечения. При обратной пересадке в кожу пациента фибробласты активно заселяют дерму, продуцируют коллаген, эффективно восполняющий дефекты мягких тканей. Как следствие: нивелируются мелкие и средние морщины, улучшается цвет кожи, повышается эластичность и упругость кожи.

Алопеции

Работа выполнена на 24 пациентах (8 женщин, 16 мужчин). При введении препарата в зоны поредения и исчезновения волос происходит стимуляция волосяных луковиц, находящихся в стадии анабиоза. Под действием аутологичных фибробластов наблюдается восстановление слоев кожи, особенно эпидермиса и дермы, стимулируется периферическое кровоснабжение волос и даже появляются пушковые волосы. У 7 пациентов наблюдали появление пушковых волос, которые постепенно утолщались и крепли, изменялся цвет волос - волосы темнели. Наблюдение за клиническими результатами проводили посредством фотографирования пациентов до и после. Срок наблюдения составил 12 месяцев и продолжается до настоящего времени.

Пародонтит

Работа выполнена на 7 пациентах (4 мужчин и 3 женщины). При введении препарата в зону альвеолярных отростков и под слизистую десны происходит выделение культивированными фибробластами факторов роста, стимуляция ими белкового синтеза, формирование экстрацеллюлярного матрикса, фибронектина и других веществ, которые способствуют активации процессов ангиогенеза и дальнейшего остеогенеза, усилению регенерации тканей.

Под действием аутологичных фибробластов наблюдается улучшение состояния слизистой оболочки альвеолярных отростков и их плотное сращение с тканями зубов, уменьшение или исчезновение подвижности зубов, улучшение кровоснабжения слизистой оболочки, исчезновение неприятного запаха изо рта. Наблюдение за клиническими результатами проводили посредством фотографирования ротовой полости пациентов до и после. Срок наблюдения составил 12 месяцев и продолжается до настоящего времени.

Возрастных ограничений предложенная методика не имеет, поскольку при культивировании постнатальных фибробластов происходит стимуляция пролиферации лишь тех клеток, которые сохранили высокий пролиферативный потенциал, т.е. молодых фибробластов, способных активно делиться. Старые же клетки с низким пролиферативным потенциалом вымываются и отбрасываются в процессе культивирования. Таким образом, методика позволяет получить и использовать культуры клеток с высоким пролиферативным потенциалом, где эффективность клонирования фибробластов составляет 40-60%.

Биотрансплантат был протестирован по следующим показателям:

- Тест на сократительную способность фибробластов изучали на 5-6 пассаже клеток по общепризнанной методике (Guirdy С., Grinnell F. // J.Cell Sci - 1985. - Vol.79. - Р.67-81). Проведенное исследование показало, что инъецируемые аутологичные фибробласты, используемые для коррекции мягких тканей, имели нормальную силу сжатия коллагена in vitro и не вызывали образование рубцов и фиброзов у пациентов.

- Секрецию коллагена I типа аутологичными фибробластами выявляли путем реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием набора моноклональных антител к человеческому коллагену I типа и вторых ФИТЦ-меченных поликлональных антител против первых по методике (Darby J., Skalli О., Gabbiani G. // Lab. Invest. - 1990. - Vol. - 63. - P.21-29). Все инъецируемые фибробласты имели нормальную продукцию коллагена I типа.

- Тест на онкогенность инъецируемых фибробластов изучали in vivo на 3-7 пассаже клеток. Клетки вводили двукратно в дозе 4×10 1,5-3-месячным мышам nude линии BALB/c. Фибробласты после пассирования in vitro были не онкогенны для мышей nude.

Таким образом, предложенная группа изобретений, включающая биотрансплантат, способ коррекции дефектов мягких тканей и способ получения биотрансплантата, позволяет достичь высокого терапевтического эффекта при лечении пародонтита, а также возрастных изменнеий кожи и алопеции без возникновения каких-либо нежелательных побочных явлений.

Claims (10)

1. Биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что он представляет собой суспензию аутологичных фибробластов с эффективностью клонирования 40-60% и высокой секрецией коллагена I типа, полученных в результате отбора клеток с меньшей адгезией к поверхности, при этом клетки суспендированы в 20-50%-ной аутологичной сыворотке в количестве от 1,5·10⁶ до 3·10⁷ на 1 мл биотрансплантата.

2. Способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что биоптат аутокожи промывают, выдерживают в 0,25%-ном растворе трипсина, дерму отделяют и культивируют в питательной среде, содержащей 90% среды ДМЕМ, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 20 ммоль MOPS (pH 7,4), 0,1-0,5% коллагеназы и антибиотик-гентамицин 30 мкг/мл, до дезагрегирования дермы с высвобождением одиночных клеток фибробластов, далее клетки трипсинизируют и инкубируют 14-16 суток в среде, содержащей 80% среды ДМЕМ, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 20 ммоль MOPS (pH 7,4) и антибиотик - гентамицин 30 мкг/мл из расчета не более 50 клеток на 1 см² с заменой среды каждые 72 ч, затем культуру клеток последовательно промывают сначала в течение 3-5 мин охлажденным раствором Версена, затем 10-15 мин в охлажденном растворе трипсина, далее клетки с меньшей адгезией к поверхности и открепившиеся от субстрата отбирают и ресуспендируют в среде ДМЕМ, при этом суспензия содержит фибробласты с эффективностью клонирования 40-60%, затем клетки культивируют в соотношении 1:2-1:4 до достижения конфлуэнтного слоя.

3. Способ по п.2, где биоптат промывают в растворе питательной среды ДМЕМ с антибиотиком гентамицином.

4. Способ по п.2, где биоптат для отделения дермы от эпидермиса и жировой ткани выдерживают в 0,25%-ном растворе трипсина при 4°С в течение 12 ч.

5. Способ по п.2, где дезагрегирование дермы проводят в течение 7-10 суток при 37°С.

6. Способ по п.2, где культуру клеток промывают раствором Версена и 0,1%-ным раствором трипсина, охлажденных до 4°С.

7. Способ коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что используют биотрансплантат по п.1, при этом клетки вводят в область дефекта дву-пятикратно с интервалом в 1-2 недели.

8. Способ по п.7, где при возрастных изменениях кожи клетки вводят дву-четырехкратно с интервалом в 2 недели туннельным способом в область крупных морщин и папулами в мелкие морщины, общее количество аутологичных фибробластов на полный курс - 8-12·10⁷ клеток, при этом если курс состоит из двух процедур, то вводят 4-6·10⁷ клеток, а если из четырех, то вводят 2-3·10⁷ клеток в 2-3 мл физиологического раствора.

9. Способ по п.7, где при диффузных и очаговых алопециях неандрогенного происхождения и после пересадки волос вследствие андрогенного происхождения биотрансплантат вводят внутрикожно папулами в участки поредения и исчезновения волос в количестве 5·10⁶ клеток в 3 мл физиологического раствора пятикратно с интервалом в 1-2 недели.

10. Способ по п.7, где при пародонтите биотрансплантат вводят папулами в альвеолярные отростки и под слизистую десны в количестве 10·10⁶ клеток в 1,5-2 мл физиологического раствора для инъекций трехкратно с интервалом в одну неделю.