CN108165527A - 一种美容护肤干细胞生长因子的富集方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种美容护肤干细胞生长因子的富集方法及其应用，其包括配置脐带间充质干细胞培养基、脐带间充质干细胞的分离制备及富集培养、脐带间充质干细胞生长因子的富集等步骤。本发明富集得到的干细胞生长因子体系的溶液中富含EGF、VEGF、KGF、bFGF、PDGF、TGF‑β干细胞生长因子，成分多样，能够对人体真皮细胞从深层次进行修复再生，上述干细胞生长因子可以刺激真皮细胞修复自身及再生、替换衰老的细胞，一段时间使用后能彻底修复真皮细胞，不易产生依赖性；本发明利用新型的富集方法，时间短，操作简单，避免了干细胞长期正常生长所产生的代谢废物，也去除了培养基，使其生长因子浓度和纯度增加。
Description
发明领域
本发明涉及一种美容护肤干细胞生长因子的富集方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
随着社会的发展，人们对美的追求越来越高，所有人都希望自己能够永远年轻、漂亮，而皮肤作为人体最大的组织器官，覆盖于人体的外表，是美学美容研究的主要组织器官。随着年龄的增加，人皮肤内的成纤维细胞逐渐减少，成纤维细胞分泌的胶原蛋白也在逐渐减少，从而表现出皮肤的弹性降低、出现皱纹等现象。
而一时之间，各种化妆品、护肤品等如同雨后春笋一样的应运而生了。然而，市面上的这些化妆品只是通过遮掩缺陷或是在皮肤表层起作用来达到美丽的目的，但是只是治标，而不能治本。然而精细的化工产品，长期使用副作用大，且易形成依赖性。本发明从人体干细胞提取干细胞生长因子作为新型美容护肤成分，安全可靠，且从深层真皮细胞永久性解决皮肤问题，避免了以上弊端。
干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞。干细胞在生命科学的基础研究与临床应用中起着越来越重要的作用，干细胞在细胞治疗、组织器官修复、发育生物学、药物学等领域有着极为广阔的应用前景，当前，干细胞和再生医学的研究已成为自然科学中最为引人注目的领域。
干细胞生长因子（Stem Cell Growth Factors）是由干细胞自身正常分泌的一种具有刺激调节细胞生长与功能的多效应的多肽类物质，富含表皮生长因子（EGF）、碱性纤维细胞生长因子（bFGF）、角质细胞生长因子（KGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF-β）等多重有效成分。
EGF在体内能促进机体表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞的生长、分裂和新陈代谢，促进微血管生长，改善细胞生长的微环境。因此具有修复表皮、抗衰老、淡化色斑、平复皱纹、滋润之功效。
bFGF属于拥有促进细胞分裂作用的FGF家族一，在血管形成、促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生和神经组织生长发育过程中起着十分重要的作用。具有促进弹性纤维和胶原蛋白的合成，成纤维细胞生长发育，降低黑色素和有色细胞含量的作用。其功效可修复、护肤，使肌肤富有弹性滑嫩；抗皱；美白淡斑；防晒及晒后修复；去除疤痕。
KGF是一种多功能生长因子，有促进上皮细胞增值分化，辐射防护，维持细胞骨架稳定作用，其功效可消除皱纹；防晒。
PDGF是创伤愈合过程中较早出现的生长因子之一，在创伤愈合的全过程中其重要作用，促进伤口愈合，缩短愈合时间。其功效可促进胶原蛋白合成，修复皮肤微血管系统延缓衰老；刺激特定细胞群分裂增殖，促进纤维母细胞生成，从而使皱纹自然淡化。
VEGF可提高局部血管通透，为成纤维细胞增值及胶原蛋白的合成提供充足的营养及其他生长因子，进而改善皮肤微循环，使皮肤红润有光泽。同时清除一些代谢障碍的细胞从而减轻暗疮和黑斑、黄褐斑。同时也有抗衰老的功效。
TGF-β可双向调节细胞生长，促进细胞外基质的合成（如透明质酸），促进软组织损伤的修复（如溃疡），抗炎等功效。
目前市面上已存在含有EGF的护肤品、冻干粉等，然而人体细胞更新是一个系统的过程，单一的生长因子某种程度上虽然刺激了细胞的代谢，但是很容易形成依赖性；
目前有些人体干细胞护肤品（以进口为主）所用为培养干细胞的培养基，其中自然含有生长因子，但也含有培养基本身不必要的成分如酚红等，同时也含有细胞正常生长所产生的代谢废物。
综上所述，干细胞美容护肤前景广阔，且意义深远。但科学合理有效的利用干细胞独有特性，仍是一个值得深入研究的课题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足提供一种美容护肤干细胞生长因子的富集方法及其应用。本发明利用新型的富集方法，时间短，操作简单，避免了干细胞长期正常生长所产生的代谢废物，也去除了培养基，使其生长因子浓度和纯度增加；本发明富集得到的干细胞生长因子体系的溶液中富含EGF、VEGF、KGF、bFGF、PDGF、TGF-β干细胞生长因子，成分多样，不易产生依赖性。
为实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：
一种美容护肤干细胞生长因子的富集方法，包括以下步骤：
（1）配置脐带间充质干细胞培养基
MEM培养基加入10%胎牛血清、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子备用；
（2）脐带间充质干细胞的分离制备及富集培养
①手术台取下的脐带，剪短，浸入含抗生素的生理盐水中，放入超净工作台，用含有抗生素的生理盐水冲洗，洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液；
②用灭菌好的手术器械去除脐带表面的外被羊膜及血管，将脐带剪碎成1-2mm3大小的组织块；
③加入少量配置好的脐带间充质干细胞培养基重悬，转移至75cm2透气盖培养瓶中，轻轻左右摇动培养瓶，使其均匀的铺平瓶底，置于温度为37℃、CO2浓度为5%的二氧化碳培养箱内培养；
④静止24h，向培养瓶中轻柔的补加脐带间充质干细胞培养基至10ml，注意不要碰到或冲到贴壁的组织块；
⑤3天后，采用1/2换液法换液；
⑥5天后，弃培养基，用不含 Ca2＋和 Mg2＋离子、PH=7.2的磷酸盐缓冲液清洗一次，用胰蛋白酶－EDTA消化液消化，并收集细胞，调整细胞浓度，接种于75cm2透气盖培养瓶中；
⑦待细胞融合度达到90%，按照1瓶传4瓶的比例传代于温度为37℃、 CO2浓度为5%的二氧化碳培养箱内培养；
⑧富集4天后，取其中一瓶计数并用流式细胞计数仪检测CD34-、CD44+、CD45-、CD90+、CD29+的表达率；
（3）脐带间充质干细胞生长因子的富集
①待脐带间充质干细胞融合度为60-70%时，加入10nmol/L的Exendin-4，刺激培养；
②8h后弃培养基，用不含 Ca2＋和 Mg2＋离子、PH=7.2的磷酸盐缓冲液清洗两次，去除残余的培养基；
③向清洗完毕的脐带间充质干细胞中加入10ml质量分数为0.9%的生理盐水，将培养瓶置于低氧培养箱中，低氧培养24 h；
④取上清液，于2000r/min离心5 min，取上清，弃去散落细胞及碎片，即可得到富含EGF、VEGF、KGF、bFGF、PDGF、TGF-β干细胞生长因子体系的溶液。
上述胰蛋白酶－EDTA消化液是采用2.5g胰蛋白酶和0.2g EDTA溶于1L 不含 Ca2＋和 Mg2＋离子、PH=7.2的磷酸盐缓冲液而成。
上述富集方法得到的干细胞生长因子体系的溶液在制备美容护肤品中的应用。将富集得到的干细胞生长因子体系的溶液按照1-10%不同质量比例加入到不同需求及作用的美容护肤成分中即可。
本发明的有益效果：
（1）本发明富集得到的干细胞生长因子体系的溶液中富含EGF、VEGF、KGF、bFGF、PDGF、TGF-β干细胞生长因子，成分多样，能够对人体真皮细胞从深层次进行修复再生，上述干细胞生长因子可以刺激真皮细胞修复自身及再生、替换衰老的细胞，一段时间使用后能彻底修复真皮细胞，不易产生依赖性；
（2）本发明富集的干细胞生长因子为干细胞正常分泌的因子，避免了干细胞培养基及干细胞长期正常生长所产生的代谢废物，也去除了培养基，其成分更纯粹。
（3）本发明用新型的富集方法，其时间短，操作简单，且生长因子纯度及浓度增加。
附图说明
图1为脐带间充质干细胞表面标志CD34-的流式检测图；
图2为脐带间充质干细胞表面标志CD44+的流式检测图；
图3为脐带间充质干细胞表面标志CD45-的流式检测图；
图4为脐带间充质干细胞表面标志CD90+的流式检测图；
图5为脐带间充质干细胞表面标志CD29+的流式检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
实施例
一种美容护肤干细胞生长因子的富集方法，包括以下步骤：
（1）配置脐带间充质干细胞培养基
MEM培养基加入10%胎牛血清、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）备用；
（2）脐带间充质干细胞的分离制备及富集培养
①手术台取下的脐带，剪短，浸入含抗生素的生理盐水中，放入超净工作台，用含有抗生素的生理盐水冲洗，洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液；
②用灭菌好的手术器械去除脐带表面的外被羊膜及血管，将脐带剪碎成1-2mm3大小的组织块；
③加入少量配置好的脐带间充质干细胞培养基重悬，转移至75cm2透气盖培养瓶中，轻轻左右摇动培养瓶，使其均匀的铺平瓶底，置于温度为37℃、CO2浓度为5%的二氧化碳培养箱内培养；
④静止24h，向培养瓶中轻柔的补加脐带间充质干细胞培养基至10ml，注意不要碰到或冲到贴壁的组织块；
⑤3天后，采用1/2换液法换液；
⑥5天后，弃培养基，用不含 Ca2＋和 Mg2＋离子、PH=7.2的磷酸盐缓冲液（DPBs）清洗一次，用胰蛋白酶－EDTA消化液消化，并收集细胞，调整细胞浓度，接种于75cm2透气盖培养瓶中；上述胰蛋白酶－EDTA消化液是采用2.5g胰蛋白酶和0.2g EDTA溶于1L不含 Ca2＋和 Mg2＋离子、PH=7.2的磷酸盐缓冲液（DPBs）而成；
⑦待细胞融合度达到90%，按照1瓶传4瓶的比例传代于温度为37℃、 CO2浓度为5%的二氧化碳培养箱内培养；
⑧富集4天后，取其中一瓶计数并用流式细胞计数仪检测CD34-、CD44+、CD45-、CD90+、CD29+的表达率，如图1-5所示；
（3）脐带间充质干细胞生长因子的富集
①待脐带间充质干细胞融合度为60-70%时，加入10nmol/L的Exendin-4，刺激培养；
②8h后弃培养基，用不含 Ca2＋和 Mg2＋离子、PH=7.2的磷酸盐缓冲液（DPBs）清洗两次，去除残余的培养基；
③向清洗完毕的脐带间充质干细胞中加入10ml质量分数为0.9%的生理盐水，将培养瓶置于低氧培养箱中，低氧培养24 h；
④取上清液，于2000r/min离心5 min，取上清，弃去散落细胞及碎片，即可得到富含EGF、VEGF、KGF、bFGF、PDGF、TGF-β干细胞生长因子体系的溶液。
试验例：富集得到的干细胞生长因子美容护肤效果试验
（1）使用本发明富集的干细胞生长因子自制面膜为实例，面膜液以3%干细胞生长因子溶液，6%甜菜碱，6%丁二醇，7%羟乙基脲，8%聚甘油-10，10%β-葡聚糖，60%水。
（2）试验对象为100名年龄30-60岁的自愿参与试验的女性（无处于哺乳期和孕期的女性），对其进行第一次皮肤测试，随后将其随机分为两个测试组，一组为对照组，使用普通的保湿面膜（比试验组的面膜只缺少干细胞生长因子成分）；另一组为试验组，使用富含干细胞生长因子的自制面膜。
（3）试验分为安全过敏性试验和效果试验：
A．安全过敏性试验：试验组与对照组将各自面膜液分别涂抹于手腕内侧、耳后，面积为25mm×25mm，涂抹后分别于24 h、48 h和72 h观察皮肤反应，进行评定。结果均未发现异常，无发痒、刺痛、水肿、红肿、水泡等状况发生；
B．效果试验：安全过敏性试验结束后，试验组与对照组要求相同，每次敷面20min，前三天每天敷面一次，之后隔一天敷面一次（测试期间不得使用其他面膜，日常护肤以基础保湿为主只使用统一赠送护肤品），三周后再次测试，而后停止使用任何面膜，只做日常护肤（使用统一赠送护肤品）一周后第三次测试。
（4）测试为临床测试和自主测试：
A．临床测试：在温度为20±1℃、相对湿度为50±5％的测试空间里利用德国CK公司的皮肤测试仪MPA580，对每位受试者从皮肤水分、皮肤弹性、皮肤黑色素三个层面进行客观评定；
B． 自主评价：受试者通过填写调查问卷打分评价，从皮肤补水、皮肤弹性、细纹改善、毛孔收缩、皮肤光滑度、皮肤美白六个方面进行主观评定。评分标准：0-10分，0-2分为效果不明显基本没有改善，3-5分为有一定效果但改善情况一般，6-8分为效果明显改善情况较好，9-10分为效果极其明显得到极大改善。
（5）对照组及试验组评定结果利用SPSS软件统计处理，临床测试结果如表1、表2、自主评价百分比结果如表3。
表1 受试者使用面膜三周后的临床测试评定
表2 受试者停止使用面膜一周后的临床测试评定
表3 受试者的自主评定
临床测试结果如表1、表2所示，对照组使用面膜三周后及停止使用面膜一周后对皮肤水分、皮肤弹性、皮肤黑色素三个层面的改善均有显著效果（P＜0.01），相比对照组而言试验组使用三周后皮肤水分、皮肤弹性、皮肤黑色素三个层面改善更为明显，且在停止使用面膜一周后，试验组在此三个皮肤层面的保持性远远高于对照组。
自主测试结果如表3所示，从皮肤补水、皮肤弹性、细纹改善、毛孔收缩、皮肤光滑度、皮肤美白六个方面受试者的自我评定来看，试验组明显优于对照组。从试验组本组来讲，皮肤补水和皮肤光滑度效果明显（大于六分）的评分均达到80%以上，而皮肤弹性、毛孔收缩、皮肤美白效果明显（大于六分）的评分均达到60%以上，只有细纹改善效果明显（大于六分）的评分为50%。
综上，说明干细胞生长因子可深层次修复真皮细胞，从基础调理皮肤，不仅可改善皮肤状况，亦可保持其改善效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种美容护肤干细胞生长因子的富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配置脐带间充质干细胞培养基
MEM培养基加入10%胎牛血清、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子备用；
（2）脐带间充质干细胞的分离制备及富集培养
①手术台取下的脐带，剪短，浸入含抗生素的生理盐水中，放入超净工作台，用含有抗生素的生理盐水冲洗，洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液；
②用灭菌好的手术器械去除脐带表面的外被羊膜及血管，将脐带剪碎成1-2mm3大小的组织块；
③加入少量配置好的脐带间充质干细胞培养基重悬，转移至75cm2透气盖培养瓶中，轻轻左右摇动培养瓶，使其均匀的铺平瓶底，置于温度为37℃、CO2浓度为5%的二氧化碳培养箱内培养；
④静止24h，向培养瓶中轻柔的补加脐带间充质干细胞培养基至10ml，注意不要碰到或冲到贴壁的组织块；
⑤3天后，采用1/2换液法换液；
⑥5天后，弃培养基，用不含 Ca2＋和 Mg2＋离子、PH=7.2的磷酸盐缓冲液清洗一次，用胰蛋白酶－EDTA消化液消化，并收集细胞，调整细胞浓度，接种于75cm2透气盖培养瓶中；
⑦待细胞融合度达到90%，按照1瓶传4瓶的比例传代于温度为37℃、 CO2浓度为5%的二氧化碳培养箱内培养；
⑧富集4天后，取其中一瓶计数并用流式细胞计数仪检测CD34-、CD44+、CD45-、CD90+、CD29+的表达率；
（3）脐带间充质干细胞生长因子的富集
①待脐带间充质干细胞融合度为60-70%时，加入10nmol/L的Exendin-4，刺激培养；
②8h后弃培养基，用不含 Ca2＋和 Mg2＋离子、PH=7.2的磷酸盐缓冲液清洗两次，去除残余的培养基；
③向清洗完毕的脐带间充质干细胞中加入10ml质量分数为0.9%的生理盐水，将培养瓶置于低氧培养箱中，低氧培养24 h；
④取上清液，于2000r/min离心5 min，取上清，弃去散落细胞及碎片，即可得到富含EGF、VEGF、KGF、bFGF、PDGF、TGF-β干细胞生长因子体系的溶液。
2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述胰蛋白酶－EDTA消化液是采用2.5g胰蛋白酶和0.2g EDTA溶于1L不含 Ca2＋和 Mg2＋离子、PH=7.2的磷酸盐缓冲液而成。
3.如权利要求1-2任一项所述富集方法得到的干细胞生长因子体系的溶液在制备美容护肤品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将富集得到的干细胞生长因子体系的溶液按照1-10%不同质量比例加入到不同需求及作用的美容护肤成分中即可。
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