CN110241077A - 一种从人间充质干细胞培养基中提取营养因子的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从人间充质干细胞培养基中提取营养因子的方法及其用途，包括供体的筛选、脐带间充质干细胞培养、培养上清预处理、复合营养因子提取以及样品冷冻干燥。本发明从培养的间充质干细胞培养基中提取出高浓度的复合营养因子，用于护肤美容，可以有效避免细胞注射带来的免疫排斥反应及潜在感染风险。本发明在GMP级环境中进行人脐带间充质干细胞的原代分离，培养及扩增，并经过严格的间充质干细胞质量控制与安全性评价体系的检测，制备的人脐带间充质干细胞符合临床级的生产要求，保证后续提取得生子因子没有传染性病毒及细菌的污染。本发明提取的高浓度复合营养因子在护肤美容方面具有很好市场开发前景。

Description

一种从人间充质干细胞培养基中提取营养因子的方法及其 用途
技术领域
本发明涉及干干细胞皮肤再生修复领域，具体涉及一种从人间充质干细胞培养基中提取营养因子的方法及其用途。
背景技术
皮肤的衰老与个体生命的衰老进程基本一致。随着岁月流逝，皮肤细胞的新陈代谢越来越慢。凋亡的细胞越来越多，新生的细胞越来越少，于是皮肤开始干裂、松弛、皱纹开始爬上脸。皮肤的衰老，皱纹的出现，究其根源实质上都是细胞的衰老和减少。而细胞的衰老和减少则是由干细胞老化引起的。
干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是我们肌体的起源细胞，是形成人体内各种组织、器官的原始细胞。在一定条件下，干细胞可能被诱导分化不同的细胞，补充受伤或者死亡的细胞。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs），是一群能够自我更新和分化为成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞的成体多潜能干细胞，体外易于分离和扩增，在临床试验中已被用于治疗多种疾病。MSCs 具有营养因子分泌，免疫调节能力，低免疫原性，能在宿主体内长期存活并可在微环境诱导下归巢到损伤部位并分化为特异的组织细胞，参与组织修复。研究表明，间充质干细胞在体内的修复作用主要是通过旁分泌作用，分泌大量的营养因子和免疫调节因子，神经营养因子-3，碱性成纤维细胞生长因子，血管内皮生长因子等。
干细胞在培养的过程中会分泌多种细胞再生因子。细胞生长因子是由细胞分泌的具有生物活性的蛋白质或多肽类物质, 具有诱导和刺激细胞增殖, 维持细胞存活等生物效应。由于生长因子是由正常细胞分泌，所以既无药物类毒性，也无免疫反应。所以间充质干细胞不但可以体内注射治疗多种疾病，而且可以将其分泌的营养因子提取出来，这些营养因子能从源头营养肌肤，彻底减轻肌肤年龄，重塑肌肤微环境，修复各种肌肤衰老问题，从而可以广泛应用于皮肤美容护肤、抗衰老等领域。干细胞产品使用时必须保持活性状态，对其安全性和有效性有着苛刻的标准，堪称有史以来最为复杂的“药品”也不为过，其生产的每一个环节都要严格按照既有规范执行，比如在符合GMP要求的场地生产、由合格的人员操作、采用的材料试剂得到相应批准，那么干细胞产品的安全性才有保障。所以必须从供体筛选、细胞培养、营养因子提取等各方面进行严格的质量控制，保证干细胞产品的安全性。
发明内容
本发明的目在于针对现有技术的不足，提供一种从人间充质干细胞培养基中提取营养因子的方法及其用途，从间充质干细胞培养上清中富集高浓度的复合营养因子，并作为添加物用于护肤美容产品。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法。
一种从人间充质干细胞培养基中提取营养因子的方法，包括以下步骤：
步骤A：供体的筛选：无菌采集足月生产的胎儿脐带，浸入含抗生素的生理盐水中，用PBS洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液；
步骤B：脐带间充质干细胞培养：将脐带剪碎成小组织块，将小组织块转移到75cm2透气盖培养瓶底，堆成小堆，然后倒置放入二氧化碳培养箱内4小时；然后向培养瓶内加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，继续放入培养箱中培养，待7天后组织块周围爬出细胞，更换培养基；待细胞融合度达到90%，按照1瓶传3瓶的比例传代扩增，在传代扩增的过程中，每次换液时，收集培养上清，在-80℃的温度下保存，备用；
步骤C：培养上清预处理：将培养上清在4℃的温度下过夜解冻，然后置入离心管中以3000rpm的速度离心10分钟，除去细胞碎片，收集离心管中的上清备用；
步骤D：复合营养因子提取：使用PD-10预装脱盐柱对步骤C得到的离心后的上清进行脱盐纯化，得到高蛋白浓度的纯化液；
步骤E：样品冷冻干燥：将步骤D制备的纯化液用0.22微米孔径的过滤器过滤除菌，采用BCA方法测定其蛋白含量，按照2mg总蛋白量将对应体积的纯化液转移到安臻瓶中，然后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，去除水分，得到富集干细胞营养因子的蛋白粉末。
进一步地，所述步骤A中的抗生素为质量浓度为1%的青霉素-链霉素溶液。
进一步地，所述步骤B的二氧化碳培养箱中，箱内温度为37℃，箱内二氧化碳浓度为5%。
进一步地，所述步骤B中剪碎的小组织块体积为1-2mm3。
进一步地，所述步骤D中脱盐纯化的具体步骤包括：
步骤D1：上样，在PD-10柱平衡后，将步骤C得到的离心后的上清加到柱子顶上；
步骤D2：洗脱，上清全部进入柱子内后，从柱顶加入PBS以自然流速进行洗脱；
步骤D3：收集，从加样开始计算，用1.5mL的EP 管收集流出液为脱盐蛋白峰，每管收集1mL，将第3-8管样品液合并得到高蛋白浓度的纯化液。
本发明的第二方面，提供所制备的脐带间充质干细胞来源的营养因子作为护肤美容产品添加物的应用。
本发明的第三方面，提供一种抗衰老化妆品，其活性成分采用富集间充质干细胞营养因子的蛋白粉末。
进一步地，所述的间充质干细胞营养因子，包括BDNF，GNDF，NGF，NT-3等再生因子复合营养因子，其可在再生修复、皮肤护理美容、抗衰老等方面均有所应用。
本发明所述的人间充质干细胞种类，包括但不限于脐带、胎盘、骨髓、脐带血、牙龈、牙髓、脂肪来源的间充质人培养基中分离制备的复合再生因子在作为干细胞治疗药物、护肤品、化妆品中的应用。
本发明所述的人脐带间充质干细胞在GMP级临床干细胞制备室分离，培养及扩增，并经过严格的间充质干细胞质量控制与安全性评价体系的检测，无伦理学的争议，为干细胞衍生物在再生修复、皮肤护理、医美、抗衰等领域的应用提供了新的支持。同时，本发明所使用的方法可以扩展到任何干细胞种类，并从其培养基中提取复合再生因子。
本发明的有益效果在于：
(1) 本发明从培养的间充质干细胞培养基中提取出高浓度的复合营养因子，用于护肤美容，可以有效避免细胞注射带来的免疫排斥反应及潜在感染风险。本发明在GMP级环境中进行人脐带间充质干细胞的原代分离，培养及扩增，并经过严格的间充质干细胞质量控制与安全性评价体系的检测，制备的人脐带间充质干细胞符合临床级的生产要求，保证后续提取得生子因子没有传染性病毒及细菌的污染。本发明提取的高浓度复合营养因子在护肤美容方面具有很好市场开发前景。另外，本方法可以应用于其他干细胞种类，比如各种组织来源的间充质干细胞分泌因子的提取，广泛应用于再生修复、皮肤护理等多个领域。
(2) 本发明通过将提取出来的复合营养因子，根据不同需要，添加到各种功能化妆品中，用于护肤美容等。这些营养因子蛋白是自然产生的而不同于克隆的因子，其来源也是人体，更适合于人的皮肤。多种蛋白作用于人体表皮和真皮，通过刺激成纤维细胞增殖，增加胶原蛋白合成及真皮厚度，修复损伤等，对防止老化和皮肤再生具有突破性的功效，让肌肤保持年轻的光彩。
(3) 本发明制备得到的间充质干细胞来源的复合营养因子浓缩液中包括BDNF，GNDF，NGF，NT-3等多种营养因子，成分多，活性高，按照不同的比例与护肤美容产品配方进行混合，能够促进皮肤新陈代谢，可以刺激皮肤真皮细胞从深层次进行修复再生，加快替代衰老细胞，从而达到护肤美容的效果。由于这些营养因子来源于人类干细胞合成分泌，所以无药物类毒性，也无不良免疫反应，且不产生依赖性。本发明采用的新型富集方法，除了具有成本低、耗时短、操作简单、成品质量稳定等特点，还可以有效除去培养基中原本含有的动物血清成分、培养基成分及干细胞生长过程中产生的代谢废物，使得富集的复合营养因子纯度和浓度都增加，可以在商业上进行大规模应用。
附图说明
图1为本实施例中间充质干细胞中培养基部分生长因子浓缩前后浓度对比图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
步骤A：对取得知情同意的健康孕妇进行健康体检，排除艾滋病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、梅毒、EB病毒等传染性疾病感染，筛选合格的供体足月生产时，无菌采集胎儿脐带，浸入含质量浓度为1%的青霉素-链霉素溶液的生理盐水中，运送到GMP干细胞制备室的超净工作台，用PBS洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液；
步骤B：将脐带剪碎成小组织块，每块体积为1-2mm3，将小组织块转移到75cm2透气盖培养瓶底，堆成一个个小堆，然后倒置放入二氧化碳培养箱内，箱内温度为37℃，箱内二氧化碳浓度为5%，培养4小时；然后向培养瓶内加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，继续放入培养箱中培养，待7天后组织块周围爬出细胞，更换培养基；待细胞融合度达到90%，按照1瓶传3瓶的比例传代扩增，在传代扩增的过程中，每次换液时，收集培养上清，在-80℃的温度下保存，备用；
步骤C：将保存在-80℃冰箱中的将培养上清取出，在4℃的温度下过夜解冻，然后置入离心管中以3000rpm的速度离心10分钟，除去细胞碎片，收集离心管中的上清备用；
步骤D：使用PD-10预装脱盐柱对步骤C得到的离心后的上清进行脱盐纯化，具体操作包括：在PD-10柱平衡后，先将步骤C得到的离心后的上清加到柱子顶上，上清全部进入柱子内后，从柱顶加入PBS以自然流速进行洗脱，最后从加样开始计算，用1.5mL的EP 管收集流出液为脱盐蛋白峰，每管收集1mL，将第3-8管样品液合并得到得到高蛋白浓度的纯化液；
步骤E：将步骤D制备的纯化液用0.22微米孔径的过滤器过滤除菌，采用BCA方法测定其蛋白含量，按照2mg总蛋白量计算，将对应体积的纯化液转移到消毒灭菌的安臻瓶中，然后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，去除水分，得到富集间充质干细胞营养因子的蛋白粉末。
采用酶联免疫吸附实验（ELISA）对人间充质干细胞培养基浓缩前后的部分代表性生长因子进行浓度检测，参见图1，发现所检测的bFGF，EGF和IGF浓度在浓缩后都比浓缩前明显提高，表明本方法能从培养基中富集干细胞分泌的生子因子。所用ELISA试剂盒均来自R&D公司，其中，bFGF ELISA 试剂盒货为DFB50；EGF ELISA 试剂盒货号为DEG00；IGF1ELISA 试剂盒货号为DG100。
应用例1
制备一种抗衰老化妆品，包括如下组分：富集的干细胞复合营养因子总蛋白6.6mg；甘油1mL；透明质酸0.2g；植物表达的人白蛋白0.5g；聚谷氨酸0.3g。将上述原料溶于高温灭菌的超纯水，总体积为100mL本发明通过干细胞复合营养因子的作用达到高效修复、皮肤护理、消除皱纹、淡化色斑及滋润补水的功能。干细胞复合因子抗衰老化妆品是纯生物制品，对肌肤不会产生任何污染，可作为长期日常护肤用。初期使用量较大，一般让肌肤细胞达到饱和态最佳。使用一段时间后，每次的使用量可减少，以保持肌肤细胞的最佳状态。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种从人间充质干细胞培养基中提取营养因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A：供体的筛选：无菌采集足月生产的胎儿脐带，浸入含抗生素的生理盐水中，用PBS洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液；
步骤B：脐带间充质干细胞培养：将脐带剪碎成小组织块，将小组织块转移到75cm2透气盖培养瓶底，堆成小堆，然后倒置放入二氧化碳培养箱内4小时；然后向培养瓶内加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，继续放入培养箱中培养，待7天后组织块周围爬出细胞，更换培养基；待细胞融合度达到90%，按照1瓶传3瓶的比例传代扩增，在传代扩增的过程中，每次换液时，收集培养上清，在-80℃的温度下保存，备用；
步骤C：培养上清预处理：将培养上清在4℃的温度下过夜解冻，然后置入离心管中以3000rpm的速度离心10分钟，除去细胞碎片，收集离心管中的上清备用；
步骤D：复合营养因子提取：使用PD-10预装脱盐柱对步骤C得到的离心后的上清进行脱盐纯化，得到高蛋白浓度的纯化液；
步骤E：样品冷冻干燥：将步骤D制备的纯化液用0.22微米孔径的过滤器过滤除菌，采用BCA方法测定其蛋白含量，按照2mg总蛋白量将对应体积的纯化液转移到安臻瓶中，然后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，去除水分，得到富集间充质干细胞营养因子的蛋白粉末。
2.根据权利要求1所述的一种从人间充质干细胞培养基中提取营养因子的方法，其特征在于：所述步骤A中的抗生素为质量浓度为1%的青霉素-链霉素溶液。
3.根据权利要求1所述的一种从人间充质干细胞培养基中提取营养因子的方法，其特征在于：所述步骤B的二氧化碳培养箱中，箱内温度为37℃，箱内二氧化碳浓度为5%。
4.根据权利要求1所述的一种从人间充质干细胞培养基中提取营养因子的方法，其特征在于：所述步骤B中剪碎的小组织块体积为1-2mm3。
5.根据权利要求1所述的一种从人间充质干细胞培养基中提取营养因子的方法，其特征在于，所述步骤D中脱盐纯化的具体步骤包括：
步骤D1：上样，在PD-10柱平衡后，将步骤C得到的离心后的上清加到柱子顶上；
步骤D2：洗脱，上清全部进入柱子内后，从柱顶加入PBS以自然流速进行洗脱；
步骤D3：收集，从加样开始计算，用1.5mL的EP 管收集流出液为脱盐蛋白峰，每管收集1mL，将第3-8管样品液合并得到高蛋白浓度的纯化液。
6.权利要求1所制备的脐带间充质干细胞来源的营养因子作为护肤美容产品添加物的应用。
7.一种抗衰老化妆品，其特征在于：其活性成分采用权利要求1所述方法而制备的富集间充质干细胞营养因子的蛋白粉末。
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