CN106754639A - 一种间充质干细胞因子大规模制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种间充质干细胞因子大规模制备方法，包括间充质干细胞的体外培养、间充质干细胞因子的诱导分泌及间充质干细胞因子的分离纯化三个步骤，其中间充质干细胞因子的诱导分泌步骤所需的诱导培养基由体积比为30‑80:20‑60:0.2‑1.5的DMEM、PBS缓冲液和L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺水溶液的混合培养基及诱导剂组成。本发明所提供的间充质干细胞因子大规模制备方法，采用单一样本来源大规模培养，保证批次产品均一性，间充质干细胞因子的诱导分泌阶段采用诱导培养基，刺激细胞因子的大量分泌，配方合理有效，整个制备过程条件稳定合理，适宜大规模生产。

Description

一种间充质干细胞因子大规模制备方法
技术领域
本发明属于细胞因子技术领域，特别涉及一种间充质干细胞因子大规模制备方法。
背景技术
间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞。因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。
间充质干细胞作用机理尚不完全明确，一般认为主要通过以下机制：1、旁分泌作用分泌细胞营养因子、细胞生长因子、抗凋亡因子等。2、代替或修复死亡或受损的细胞。3、细胞直接接触，调控细胞的功能。当前，越来越多的研究表明，间充质干细胞的旁分泌效应在其发挥治疗效果中其主要作用。间充质干细胞通过分泌各类细胞因子对邻近细胞产生作用，从而发挥其功效。研究表明，间充质干细胞可分泌多种细胞因子，如VEGF血管内皮生长因子、bFGF碱性成纤维细胞生长因子、NGF神经生长因子、HGF肝细胞生长因子、IGF-1胰岛素样生长因子1、BDNF脑源性神经营养因子、GDNF胶质源性神经营养因子、IL-6白细胞介素6、IL-11白细胞介素11等。间充质干细胞分泌活性因子具有改善炎性环境、调节机体免疫状态、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、促进血管再生、促进神经干细胞迁移和分化、促进轴突生长及突触连接形成及促进髓鞘形成的功能等，通过脑白质损伤的动物模型证实可以抑制宿主细胞及移植细胞凋亡、改善模型鼠的神经功能，通过心梗动物模型证实可以促进心功能恢复，通过皮肤损伤实验证实可以促进伤口愈合。
目前的间充质干细胞因子的制备方法的报道，如中国专利申请CN105543313A中公开的人源间充质干细胞因子及其制备方法，收集并合并P1-P5代细胞生长至汇合度75-85％时的上清液，并对上清液进行过滤和超滤得到细胞因子浓缩液即可，该方法未能提供有效的诱导培养基，诱导细胞因子分泌过程不够高效，得到的间充质干细胞因子数量较少，且该方法需要收集多代细胞培养基，效率低，工艺不连续，极易导致样品受到不必要的污染，且多代收集的方法来制备细胞因子，产品均一性较难保证，分离纯化过程不具规模化，较难适应大批量生产。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种一种间充质干细胞因子大规模制备方法，建立完善样本采集规范，建立大规模细胞培养及诱导分泌细胞因子的制备工艺，设计一套高效连续分离纯化工艺，产品经真空冷冻干燥可长期保存。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
一种间充质干细胞因子大规模制备方法，包括以下步骤：
1、间充质干细胞的体外培养：选取健康间充质干细胞，经体外原代培养、传代培养至4代后，将4代细胞消化计数，转至细胞工厂进行扩增培养；
2、间充质干细胞因子的诱导分泌：当扩增培养的细胞长至汇合度70～85％时，弃掉原培养基，添加诱导培养基至细胞工厂，继续培养，收集诱导培养基；
3、间充质干细胞因子的分离纯化：将收集的诱导培养基通过中空纤维滤膜进行循环过滤5-8遍，收集第一粗纯液，将第一粗纯液泵至切向流超滤膜包，循环过滤至第一粗纯液体积浓缩为原体积的1/30-1/60，然后向浓缩粗纯液中加入PBS缓冲液补至原体积得到第二粗纯液，继续泵至切向流超滤膜包循环过滤至第二粗纯液体积浓缩为原体积的1/40-1/60后，向第二浓缩粗纯液中加入生理盐水补至原体积得到第三粗纯液，继续超滤至第三粗纯液体积浓缩为原体积的1/30-1/50，收集浓缩滤液得间充质干细胞因子浓缩液；
其中，所述诱导培养基由体积比为30-80:20-60:0.2-1.5的DMEM、PBS缓冲液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培养基及诱导剂组成，所述诱导剂包括如下浓度的组分：10-20mmol/L的HEPES、1-2g/100ml的D-葡萄糖和40-70μmol/L的L-维生素C，其中DMEM的浓度为1500-3000mg/L，PBS缓冲液的浓度为0.01-0.03M，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的浓度为150-300mM。
本发明所提供的间充质干细胞因子大规模制备方法，采用单一样本来源大规模培养，保真批次产品均一性，间充质干细胞因子的诱导分泌阶段采用基础培养基添加诱导剂配制成诱导培养基，刺激细胞因子的大量分泌，配方合理有效，保持神经干细胞的高活率同时大量分泌细胞因子，诱导培养基基本不含大分子蛋白成分，便于后期产物分离纯化；间充质干细胞因子的分离纯化阶段包含两步置换缓冲液步骤，第一步用PBS缓冲液有效防止细胞因子纯化过程失活；第二部采用生理盐水，避免PBS缓冲液在冻干过程中因本身特性产生的PH急剧变化导致蛋白失活，整个制备过程条件稳定合理，适宜大规模生产。
进一步地，所述诱导剂还包括5-7mg/ml的硫代甘油和0.8-1.3mmol/L的吡哆醇盐酸盐。
进一步地优选，当扩增培养的细胞长至汇合度70～85％时，弃掉原培养基，添加原培养基一半体积的诱导培养基至细胞工厂，继续培养72h；
其中，0-24h内培养条件为37℃、5％CO2、5％O2，24-48h内培养条件为：37℃、5％CO2、20％O2；
48-72h内培养条件为：37℃、5％CO2、5％O2；于48h后收集半量诱导培养基，并向细胞工厂中加入等量诱导培养基；72h后收集全部诱导培养基。
诱导阶段交替改善培养环境并放出一部分诱导培养基，补加新鲜诱导培养基，从而改善细胞生长环境，解除产物抑制，使细胞进一步分泌细胞因子。
进一步地，所述制备方法还包括间充质干细胞因子的冷冻干燥步骤，将间充质干细胞因子浓缩液用生理盐水稀释得到间充质干细胞因子生理盐水稀释液，添加冻干保护剂混合均匀，过滤除菌后-80℃冷冻，并进行真空干燥，得到的间充质干细胞因子冻干粉，-20℃保存。
进一步地，所述冻干保护剂包括250-400mmol/L海藻糖、180-220mmol/L山梨醇和0.8-1.3g/L的人血白蛋白；更进一步地，所述冻干保护剂还包括：30-50mmol/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺和12-36mmol/L的黄体酮，将间充质干细胞因子在冻干过程中有效保护，保证冻干粉的高质量。
优选地，间充质干细胞的体外培养包括如下步骤：
1、在无菌条件取得含有间充质干细胞的组织块装于培养瓶中，加入间充质干细胞无血清培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，保持培养瓶绝对静止培养5天，其后每3天换液；
2、待细胞长至75-85％愈合时，弃旧培养基，于非细胞培养面加入生理盐水洗涤两次，然后加入0.25％胰酶均匀浸润细胞贴壁面，室温孵育3-5min，待细胞变圆后加无血清培养基，快速震荡并吹打细胞贴壁面，得到细胞悬液，离心弃上清，沉淀加生理盐水再次洗涤并离心得细胞沉淀，所述细胞沉淀用无血清培养基重悬，细胞筛过滤，计数并以为1-2×104个/ml细胞浓度铺瓶，置37℃、5％CO2培养箱中传代培养；
3、取间充质干细胞因子的4代细胞，消化计数按1-2×104/ml密度接种到细胞工厂中，同时按相同密度接种于培养瓶伴随培养，以37℃、5％CO2、20％O2条件进行培养。
采用营养充足的培养基，有利的培养条件，快速大量扩增间充质干细胞，采用低氧环境，模拟间充质干细胞在生物体内环境，刺激大量分泌细胞因子。
优选地，所述含有间充质干细胞的组织为人脐带，采集方法包括如下步骤：
1、提前确定脐带来源孕妇，调查家族遗传病史，抽母血进行病毒检测，记录健康调查表；
2、新生儿出生当场采集脐带，保存于储运液，保存时间<12h；
3、将脐带消毒、清洗，剪成小块，纵向撕开，剖离1根静脉血管和2根动脉血管，去除羊膜，撕取华通胶；
4、将华通胶洗涤，充分剪碎至1mm3-3mm3大小，即得含有间充质干细胞组织块。
上述方法建立完善样本采集规范，有利于大规模细胞培养样品质量的稳定性。
另一方面，本发明提供一种间充质干细胞因子大规模制备方法所需的制备装置，包括通过管路依次密闭连接的细胞工厂、诱导培养基储罐、中空纤维膜微滤器、粗纯液储罐、切向流超滤膜超滤器和生物安全柜，所述粗纯液储罐还通过管路连接有PBS缓冲液储罐和生理盐水储罐；所述中空纤维膜微滤器与所述诱导培养基储罐间还设有第一循环管路，所述切向流超滤膜超滤器与所述粗纯液储罐件还设有第二循环管路，所述第一循环管路、第二循环管路，细胞工厂与诱导培养基储罐之间、中空纤维膜微滤器与粗纯液储罐之间、PBS缓冲液储罐或生理盐水储罐与粗纯液储罐之间和切向流超滤膜超滤器与生物安全柜之间的管道上均设有阀门，所述中空纤维膜微滤器与所述诱导培养基储罐之间及切向流超滤膜超滤器与所述粗纯液储罐件之间的管路上还安装有无菌泵。提供了一套高效连续封闭的分离纯化装置，整个纯化系统密闭连接，连续化操作，大大提高分离纯化效率。
优选地，所述无菌泵为无菌蠕动泵，所述切向流超滤膜超滤器的截留分子量为5kD。
进一步地，所述诱导培养基储罐、粗纯液储罐、PBS缓冲液储罐和生理盐水储罐上均设有空气过滤器，有效防止空气中微生物或细菌的进入。
本发明的有益效果在于:
1、提供了系统的样本采集、细胞培养，细胞因子诱导分泌及细胞因子分离纯化工艺，单一样本来源大规模培养，最大可能实现产品质量稳定性、均一性及重现性，适用于工业生产；
2、培养分为两个阶段，第一阶段采用营养充足培养基、有利培养条件快速大量扩增细胞；第二阶段采用基础培养基添加诱导剂配置诱导培养基，并采用低氧环境，模拟间充质干细胞在生物体内环境，刺激大量分泌细胞因子；
3、纯化过程包含两步置换缓冲液步骤，第一步用PBS缓冲液有效防止细胞因子纯化过程失活；第二部采用生理盐水，避免PBS缓冲液在冻干过程中因本身特性产生的PH急剧变化导致蛋白失活。
4、诱导培养基基本不含大分子蛋白成分，便于后期产物分离纯化。诱导阶段交替改善培养环境并放出一部分诱导培养基，补加新鲜诱导培养基，从而改善细胞生长环境，解除产物抑制，使细胞进一步分泌细胞因子；
5、纯化浓缩液采用ELISA法测定4种代表因子浓度，然后调节浓缩液细胞因子浓度，最后添加保护剂进行真空冷冻干燥，真空压盖，保证了最终产品批次间的均一性。有利于产品后续在美容、临床前研究及医疗方面的应用。
6、提供完整系统的一种间充质干细胞因子大规模制备方法所需的制备装置，该装置实现了间充质干细胞因子大规模制备的连续化操作，大大提高纯化效率，并可有效防止空气中微生物进入；无菌泵可选蠕动泵，较易保证无菌操作
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围；本发明中所使用的设备，如无特殊规定，均为本领域内常用的设备；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。
实施例1
一种间充质干细胞因子大规模制备方法，包括以下步骤：
1、选取间充质干细胞，经体外原代培养、传代培养至4代后，将4代细胞消化计数，转至细胞工厂进行扩增培养；
2、当扩增培养的细胞长至汇合度70～85％时，弃掉原培养基，添加诱导培养基至细胞工厂，继续培养，收集诱导培养基；
3、将收集的诱导培养基通过中空纤维滤膜进行循环过滤5遍，收集第一粗纯液，将第一粗纯液泵至切向流超滤膜包，循环过滤至第一粗纯液体积浓缩为原体积的1/50，然后向浓缩粗纯液中加入PBS缓冲液补至原体积得到第二粗纯液，继续泵至切向流超滤膜包循环过滤至第二粗纯液体积浓缩为原体积的1/50后，向第二浓缩粗纯液中加入生理盐水补至原体积得到第三粗纯液，继续超滤至第三粗纯液体积浓缩为原体积的1/40，收集浓缩滤液得间充质干细胞因子浓缩液；
其中，所述诱导培养基由培养基由体积比为50:49:1的DMEM、PBS缓冲液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培养基及诱导剂组成，所述诱导剂包括如下浓度的组分：15mmol/L的HEPES、1.3g/100ml的D-葡萄糖和52μmol/L的L-维生素C，所述原培养基为常规无血清培养基，其中DMEM浓度为2500mg/L，PBS缓冲液缓冲溶液的浓度为0.02M，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的浓度为200mM。
实施例2
一种间充质干细胞因子大规模制备方法，包括以下步骤：
1、选取间充质干细胞，经体外原代培养、传代培养至4代后，将4代细胞消化计数，转至细胞工厂进行扩增培养；
2、当扩增培养的细胞长至汇合度70～85％时，弃掉原培养基，添加诱导培养基至细胞工厂，继续培养，收集诱导培养基；
3、将收集的诱导培养基通过中空纤维滤膜进行循环过滤8遍，收集第一粗纯液，将第一粗纯液泵至切向流超滤膜包，循环过滤至第一粗纯液体积浓缩为原体积的1/30，然后向浓缩粗纯液中加入PBS缓冲液补至原体积得到第二粗纯液，继续泵至切向流超滤膜包循环过滤至第二粗纯液体积浓缩为原体积的1/40后，向第二浓缩粗纯液中加入生理盐水补至原体积得到第三粗纯液，继续超滤至第三粗纯液体积浓缩为原体积的1/30，收集浓缩滤液得间充质干细胞因子浓缩液；
其中，所述诱导培养基由培养基由体积比为30:68.5:1.5的DMEM、PBS缓冲液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培养基及诱导剂组成，所述诱导剂包括如下浓度的组分：10mmol/L的HEPES、1g/100ml的D-葡萄糖和40μmol/L的L-维生素C，5mg/ml的硫代甘油和0.8mmol/L的吡哆醇盐酸盐，其中DMEM浓度为1500mg/L，PBS缓冲液缓冲溶液的浓度为0.01M，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的浓度为300mM。。
实施例3
一种间充质干细胞因子大规模制备方法，包括以下步骤：
1、选取间充质干细胞，经体外原代培养、传代培养至4代后，将4代细胞消化计数，转至细胞工厂进行扩增培养；
2、当细胞长至汇合度70～85％时，弃掉原培养基，并按照原培养基一半体积添加诱导培养基，继续培养调整参数为:37℃、5％CO2、5％O2，24h后调整培养参数为：37℃、5％CO2、20％O2，48h后收集半量诱导培养基，并向细胞工厂中加入等量新鲜诱导培养基，调整参数为37℃、5％CO2、5％O2，继续培养；72h后收集全部诱导培养基；
3、将收集的诱导培养基通过0.1um的中空纤维滤膜进行循环过滤7遍，收集第一粗纯液，将第一粗纯液泵至切向流超滤膜包，循环过滤至第一粗纯液体积浓缩为原体积的1/60，然后向浓缩粗纯液中加入PBS缓冲液补至原体积得到第二粗纯液，继续泵至切向流超滤膜包循环过滤至第二粗纯液体积浓缩为原体积的1/60后，向第二浓缩粗纯液中加入生理盐水补至原体积得到第三粗纯液，继续超滤至第三粗纯液体积浓缩为原体积的1/50，收集浓缩滤液得间充质干细胞因子浓缩液
其中，所述诱导培养基由培养基由体积比为80:19.8:0.2的DMEM、PBS缓冲液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培养基及诱导剂组成，所述诱导剂包括如下浓度的组分：20mmol/L的HEPES、2g/100ml的D-葡萄糖和70μmol/L的L-维生素C，7mg/ml的硫代甘油和1.3mmol/L的吡哆醇盐酸盐，其中DMEM浓度为3000mg/L，PBS缓冲液缓冲溶液的浓度为0.03M，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的浓度为300mM。
实施例4
一种间充质干细胞因子大规模制备方法，包括以下步骤：
1、选取间充质干细胞，经体外原代培养、传代培养至4代后，将4代细胞消化计数，转至细胞工厂进行扩增培养；
2、当细胞长至汇合度70～85％时，弃掉原培养基，并按照原培养基一半体积添加诱导培养基，继续培养调整参数为:37℃、5％CO2、5％O2，24h后调整培养参数为：37℃、5％CO2、20％O2，48h后收集半量诱导培养基，并向细胞工厂中加入等量新鲜诱导培养基，调整参数为37℃、5％CO2、5％O2，继续培养；72h后收集全部诱导培养基；
3、将收集的诱导培养基通过0.1um的中空纤维滤膜进行循环过滤6遍，收集第一粗纯液，将第一粗纯液泵至切向流超滤膜包，循环过滤至第一粗纯液体积浓缩为原体积的1/50，然后向浓缩粗纯液中加入PBS缓冲液补至原体积得到第二粗纯液，继续泵至切向流超滤膜包循环过滤至第二粗纯液体积浓缩为原体积的1/50后，向第二浓缩粗纯液中加入生理盐水补至原体积得到第三粗纯液，继续超滤至第三粗纯液体积浓缩为原体积的1/50，收集浓缩滤液得间充质干细胞因子浓缩液；
4、将间充质干细胞因子浓缩液收集至合适离心管，取样ELISA法测定VEGF、BDNF、GDNF、bFGF浓度，用生理盐水稀释至适当浓度得纯化液，然后将纯化液用注射器吸出，0.22μm滤膜过滤除菌，分装到2ml无菌、无热源西林瓶，每管1ml，将西林瓶置于-80℃冰箱速冻4h；将西林瓶置于压盖式真空冷冻干燥机，浮盖盖好，启动冷冻干燥机，设置真空度1.05mbar，干燥时间24h；干燥结束，真空压盖，西林瓶取出-20℃保存。
其中，所述诱导培养基由培养基由体积比为50:49:1的DMEM、PBS缓冲液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培养基及诱导剂组成，所述诱导剂包括如下浓度的组分：10mmol/L的HEPES、2g/100ml的D-葡萄糖和50μmol/L的L-维生素C。
冻干保护剂包括：250mmol/L海藻糖、180mmol/L山梨醇和0.8g/L的人血白蛋白。
实施例5
一种间充质干细胞因子大规模制备方法，与实施例4的区别在于冻干保护剂包括：400mmol/L海藻糖、220mmol/L山梨醇和1.3g/L的人血白蛋白，50mmol/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺和36mmol/L的黄体酮。
实施例6
一种间充质干细胞因子大规模制备方法，包括以下步骤：
1、间充质干细胞的体外培养：
1)提前确定脐带来源孕妇，调查家族遗传病史，抽母血进行病毒检测，记录健康调查表；
2)新生儿出生当场采集脐带，保存于储运液，保存时间<12h；
3)将脐带消毒、清洗，剪成小块，纵向撕开，剖离1根静脉血管和2根动脉血管，去除羊膜，撕取华通胶；
4)将华通胶洗涤，充分剪碎至1mm3-3mm3大小，即得含有间充质干细胞组织块；
5)将组织块并装于培养瓶中，加入间充质干细胞无血清培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，保持培养瓶绝对静止培养5天，其后每3天换液；
6)待细胞长至80％愈合时，弃旧培养基，于非细胞培养面加入生理盐水洗涤两次，然后加入0.25％胰酶均匀浸润细胞贴壁面，室温孵育3-5min，待细胞变圆后加无血清培养基，快速震荡并吹打细胞贴壁面，得到细胞悬液，离心弃上清，沉淀加生理盐水再次洗涤并离心得细胞沉淀，所述细胞沉淀用无血清培养基重悬，细胞筛过滤，计数并以为1-2×104个/ml细胞浓度铺瓶，置37℃、5％CO2培养箱中传代培养；
7)取间充质干细胞因子的4代细胞，消化计数按1-2×104/ml密度接种到细胞工厂中，同时按相同密度接种于培养瓶伴随培养，以37℃、5％CO2、20％O2条件进行培养。
2、间充质干细胞因子的诱导分泌：当细胞长至汇合度70～85％时，弃掉原培养基，并按照原培养基一半体积添加诱导培养基，继续培养调整参数为:37℃、5％CO2、5％O2，24h后调整培养参数为：37℃、5％CO2、20％O2，48h后收集半量诱导培养基，并向细胞工厂中加入等量新鲜诱导培养基，调整参数为37℃、5％CO2、5％O2，继续培养；72h后收集全部诱导培养基；
3、间充质干细胞因子的分离纯化：将收集的诱导培养基通过0.1um的中空纤维滤膜进行循环过滤6遍，收集第一粗纯液，将第一粗纯液泵至切向流超滤膜包，循环过滤至第一粗纯液体积浓缩为原体积的1/50，然后向浓缩粗纯液中加入PBS缓冲液补至原体积得到第二粗纯液，继续泵至切向流超滤膜包循环过滤至第二粗纯液体积浓缩为原体积的1/50后，向第二浓缩粗纯液中加入生理盐水补至原体积得到第三粗纯液，继续超滤至第三粗纯液体积浓缩为原体积的1/50，收集浓缩滤液得间充质干细胞因子浓缩液；
4、间充质干细胞因子的冷冻干燥，将间充质干细胞因子浓缩液用生理盐水稀释，添加冻干保护剂混合均匀，过滤除菌后-80℃冷冻干燥，得到的间充质干细胞因子冻干粉，-20℃保存；
其中，所述诱导培养基由培养基由体积比为50:49:1的DMEM、PBS缓冲液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培养基及诱导剂组成，所述诱导剂包括如下浓度的组分：10mmol/L的HEPES、1.5g/100ml的D-葡萄糖和55μmol/L的L-维生素C。
冻干保护剂包括：250mmol/L海藻糖、180mmol/L山梨醇和0.8g/L的人血白蛋白，30mmol/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺和12mmol/L的黄体酮。
实施例7
一种间充质干细胞因子大规模制备方法所需的制备装置，包括通过管路依次密闭连接的细胞工厂、诱导培养基储罐、中空纤维膜微滤器、粗纯液储罐和切向流超滤膜超滤器，所述粗纯液储罐还通过管路连接有PBS缓冲液储罐和生理盐水储罐；所述中空纤维膜微滤器与所述诱导培养基储罐间还设有第一循环管路，所述切向流超滤膜超滤器与所述粗纯液储罐间还设有第二循环管路，所述第一循环管路、第二循环管路，细胞工厂与诱导培养基储罐之间、中空纤维膜微滤器与粗纯液储罐之间、PBS缓冲液储罐或生理盐水储罐与粗纯液储罐之间和切向流超滤膜超滤器与生物安全柜之间的管道上均设有阀门，所述中空纤维膜微滤器与所述诱导培养基储罐之间及切向流超滤膜超滤器与所述粗纯液储罐间之间的管路上还安装有无菌泵，优选地，所述无菌泵为无菌蠕动泵，所述切向流超滤膜超滤器的截留分子量为5kD。
实施例8
一种间充质干细胞因子大规模制备方法所需的制备装置，与实施例7的区别在于，诱导培养基储罐、粗纯液储罐、PBS缓冲液储罐和生理盐水储罐上均设有空气过滤器。
对照实施例1
一种间充质干细胞因子大规模制备方法，与实施例1的区别在于，诱导培养基与原培养基相同，所述原培养基为常规无血清培养基。
对照实施例2
一种间充质干细胞因子大规模制备方法，与实施例1的区别在于，诱导培养基中，诱导剂包括的组分及各组分在诱导培养基中的浓度如下：10mmol/L的HEPES、1g/100ml的甘露糖、50μmol/L的维生素E。
对照实施例3
一种间充质干细胞因子大规模制备方法，与实施例1的区别在于，所述诱导培养基中培养基由体积比为50:50的DMEM和PBS缓冲液混合而成。
对照实施例4
一种间充质干细胞因子大规模制备方法，与实施例1的区别在于，诱导培养基中，诱导剂包括的组分及各组分在诱导培养基中的浓度如下：10mmol/L的HEPES、1g/100ml的D-葡萄糖、50μmol/L的L-维生素C5mg/ml的硫代甘油。
对照实施例5
一种间充质干细胞因子大规模制备方法，与实施例4的区别在于，所述冻干保护剂为，每100ml中含有如下组分：抗坏血酸(VC)0.5g，人白蛋白0.5ml,右旋糖苷3.5g、海藻糖1.5g，甘氨酸0.04g、精氨酸0.17g、氨基乙酸2g、柠檬酸钠0.26g、叔丁醇15ml。
试验1：间充质干细胞因子浓缩液中细胞因子的含量测定
取等量实施例1-3、对照例1-4及中国专利申请CN105543313A中公开的人源间充质干细胞因子制备方法所制备出的间充质干细胞因子浓缩液，采用ELISA法测定VEGF、BDNF、GDNF、bFGF浓度，结果见表1。
表1各细胞因子的浓度
组别 VEGF BDNF GDNF bFGF
实施例1 457ng/ml 269ng/ml 206ng/ml 353ng/ml
实施例2 537ng/ml 321ng/ml 257ng/ml 398ng/ml
实施例3 602ng/ml 364ng/ml 283ng/ml 435ng/ml
对照例1 211ng/ml 137ng/ml 89ng/ml 159ng/ml
对照例2 397ng/ml 221ng/ml 153ng/ml 301ng/ml
对照例3 335ng/ml 158ng/ml 183ng/ml 226ng/ml
对照例4 462ng/ml 285ng/ml 213ng/ml 363ng/ml
CN105543313A 385ng/ml 214ng/ml 164ng/ml 297ng/ml
由表1可以看出，实施例1与对照例1-3相比，极大程度提高了各细胞因子的浓度，对间充质干细胞分泌细胞因子具有很好的诱导作用，对照实施例2与实施例1的区别在于，将D-葡萄糖替换为其同分异构体甘露糖、将L-维生素C替换为同族的维生素E；对照实施例3与实施例1的区别在于诱导培养基中的混合培养基中不含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液；试验结果可知，上述改变所构成的诱导培养基均不能较好的起到诱导间充质干细胞分泌细胞因子的作用，各个组分相互协同，缺一不可且不可替代；实施例2相对于实施例1进一步优化了诱导培养基的组分，有实验结果可知实施例2的细胞因子浓度高于实施例1，对照例4与实施例2的区别在于诱导培养基组分不同，由试验结果可知，实施例2的间充质干细胞因子诱导分泌效果远优于对照例4；而实施例3在实施例2的基础上，优化了细胞培养的条件，更进一步提高了细胞分泌细胞因子的量；与中国专利申请CN105543313A的方法制备间充质干细胞因子数量相比较，本发明所提供的间充质干细胞因子制备方法得到的细胞因子更多，效率高，且方法简单。
试验2：间充质干细胞因子冻干粉检验
取实施例4、实施例5和对照实施例2所得的间充质干细胞因子冻干粉，于-10℃放置18个月，分别于6个月、12个月和18个月时观察冻干粉的性状、剩余水分及bFGF活性进行检测，检测结果见表2。
表2试验组和对照组神经干细胞分化结果
经试验结果分析可知，本发明所提供的冻干保护剂，可以形成稳定的间充质干细胞因子冻干粉，使产品质量稳定，易于保存，在-10℃条件下可放置12个月以上无变化，含水量在1.33％以下，其中实施例5所提供的冻干保护剂较实施例4效果更佳；实施例1与对照例2相比效果更佳，且成分简单，成本低廉。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞因子大规模制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)间充质干细胞的体外培养：选取间充质干细胞，经体外原代培养、传代培养至4代后，将4代细胞消化计数，转至细胞工厂进行扩增培养；
(2)间充质干细胞因子的诱导分泌：当扩增培养的细胞长至汇合度70～85％时，弃掉原培养基，添加诱导培养基至细胞工厂，继续培养，收集诱导培养基；
(3)间充质干细胞因子的分离纯化：将收集的诱导培养基通过中空纤维滤膜进行循环过滤5-8遍，收集第一粗纯液，将第一粗纯液泵至切向流超滤膜包，循环过滤至第一粗纯液体积浓缩为原体积的1/30-1/60，然后向浓缩粗纯液中加入PBS缓冲液补至原体积得到第二粗纯液，继续泵至切向流超滤膜包循环过滤至第二粗纯液体积浓缩为原体积的1/40-1/60后，向第二浓缩粗纯液中加入生理盐水补至原体积得到第三粗纯液，继续超滤至第三粗纯液体积浓缩为原体积的1/30-1/50，收集浓缩滤液得间充质干细胞因子浓缩液；
其中，所述诱导培养基由诱导剂和混合培养基配置而成，所述混合培养基由体积比为30-80:19.8-68.5:0.2-1.5的1500-3000mg/L的DMEM、0.01-0.03M的PBS缓冲液和150-300mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液组成，所述诱导剂包括的组分及各组分在诱导培养基中的浓度如下：10-20mmol/L的HEPES、1-2g/100ml的D-葡萄糖和40-70 μmol/L的L-维生素C。
2.如权利要求1所述的间充质干细胞因子大规模制备方法，其特征在于，所述诱导剂还包括如下浓度的组分：5-7mg/ml的硫代甘油和0.8-1.3mmol/L的吡哆醇盐酸盐。
3.如权利要求1所述的间充质干细胞因子大规模制备方法，其特征在于，间充质干细胞因子诱导分泌的具体方法如下：
当扩增培养的细胞长至汇合度70～85％时，弃掉原培养基，添加原培养基一半体积的诱导培养基至细胞工厂，继续培养72h；
其中，0-24h内培养条件为37℃、5％CO2、5％O2，24-48h内培养条件为：37℃、5％CO2、20％O2；
48-72h内培养条件为：37℃、5％CO2、5％O2；于48h后收集半量诱导培养基，并向细胞工厂中加入等量诱导培养基；72h后收集全部诱导培养基。
4.如权利要求1所述的间充质干细胞因子的大规模制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括间充质干细胞因子的冷冻干燥步骤，将间充质干细胞因子浓缩液用生理盐水稀释得到间充质干细胞因子生理盐水稀释液，添加冻干保护剂混合均匀，过滤除菌后-80℃冷冻，并进行真空干燥，得到的间充质干细胞因子冻干粉，-20℃保存。
5.如权利要求4所述的间充质干细胞因子大规模制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括的组分及各组分在间充质干细胞因子生理盐水稀释液中的浓度如下：250-400mmol/L海藻糖、180-220mmol/L山梨醇和0.8-1.3g/L的人血白蛋白。
6.如权利要求5所述的间充质干细胞因子大规模制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂还包括：30-50mmol/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺和12-36mmol/L的黄体酮。
7.如权利要求1所述的间充质干细胞因子大规模制备方法，其特征在于，间充质干细胞的体外培养包括如下步骤：
(1)将含有间充质干细胞的组织块，并装于培养瓶中，加入间充质干细胞无血清培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，保持培养瓶绝对静止培养5天，其后每3天换液；
(2)待细胞长至75-85％汇合度时，弃间充质干细胞无血清培养基，于非细胞培养面加入生理盐水洗涤两次，然后加入0.25％胰酶均匀浸润细胞贴壁面，室温孵育3-5min，待细胞变圆后加无血清培养基，快速震荡并吹打细胞贴壁面，得到细胞悬液，离心弃上清，沉淀加生理盐水再次洗涤并离心得细胞沉淀，所述细胞沉淀用无血清培养基重悬，细胞筛过滤，计数并以为1-2×104个/ml细胞浓度铺瓶，置37℃、5％CO2培养箱中传代培养；如此反复至细胞传代至4代；
(3)取经传代培养的第4代间充质干细胞细胞；按1-2×104/ml密度接种于细胞工厂进行扩增培养，培养条件为37℃、5％CO2、20％O2培养。
8.一种如权利要求1所述的间充质干细胞因子大规模制备方法所需的制备装置，其特征在于，所述制备装置包括通过管路依次连通的细胞工厂、诱导培养基储罐、中空纤维膜微滤器、粗纯液储罐和切向流超滤膜超滤器，所述粗纯液储罐还通过管路连接有PBS缓冲液储罐和生理盐水储罐；所述中空纤维膜微滤器与所述诱导培养基储罐间还设有第一循环管路，所述切向流超滤膜超滤器与所述粗纯液储罐间还设有第二循环管路，所述第一循环管路、第二循环管路，细胞工厂与诱导培养基储罐之间、中空纤维膜微滤器与粗纯液储罐之间、PBS储罐或生理盐水储罐与粗纯液储罐之间和切向流超滤膜超滤器与生物安全柜之间的管路上均设有阀门，所述中空纤维膜微滤器与所述诱导培养基储罐之间及切向流超滤膜超滤器与所述粗纯液储罐之间的管路上还安装有无菌泵。
9.如权利要求8所述的制备装置，其特征在于，所述无菌泵为无菌蠕动泵，所述切向流超滤膜超滤器的截留分子量为5kD。
10.如权利要求8所述的制备装置，其特征在于，所述诱导培养基储罐、粗纯液储罐、PBS缓冲液储罐和生理盐水储罐上均设有空气过滤器。
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