CN108309921A

CN108309921A - 一种富含细胞因子的冻干粉制备方法

Info

Publication number: CN108309921A
Application number: CN201711397179.9A
Authority: CN
Inventors: 闫姗姗; 李佳; 李一佳; 汪鉴; 秦金丽
Original assignee: Yunnan Shunxi Regenerative Medicine Engineering Co Ltd
Current assignee: Yunnan Shunxi Regenerative Medicine Engineering Co Ltd
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2018-07-24

Abstract

本发明公开一种富含细胞因子的冻干粉制备方法，所述制备方法包括以下步骤：从人胎盘绒毛膜中分离间充质干细胞，用无血清间充质干细胞培养基体外培养扩增人胎盘绒毛膜间充质干细胞；收集P2到P4代的细胞培养液上清和P4代细胞裂解物上清；将两种上清混合后制备成含有干细胞细胞因子的冻干粉。本发明采用人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养上清液和细胞裂解物上清制备的冻干粉制备方法简单，能够保证间充质干细胞生长分泌的细胞因子的活性，提高细胞因子有效浓度，增加细胞因子种类，有效解决了细胞因子需低温保存的难题、细胞因子含量少的问题，为实现干细胞细胞因子在美容护肤品中的应用和产业化发展奠定了基础。

Description

一种富含细胞因子的冻干粉制备方法

技术领域

本发明涉及干细胞细胞因子，具体涉及一种人源间充质干细胞分泌的细胞因子制备成的冻干粉。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是一种来源于发育早期中胚层的多能干细胞，在体内和体外特定的诱导条件下，能够分化为脂肪、骨、软骨、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。间充质干细胞能够分泌大量的细胞因子，包括表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、生长分化因子11（GDF-11）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、肝细胞生长因子（HGF）、转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素6（IL-6）、前列腺素2（PGE2）、色氨酸代谢酶（IDO）、一氧化氮合酶（iNOS）。大量研究表明这些细胞因子能在一定程度上促进皮肤细胞生长、改善细胞生长微环境、促进伤口愈合、延缓衰老、改善皮肤生长状态等作用，因此间充质干细胞已被广泛应用于美容整形等领域，如去疤痕、填皱纹、增肤质、祛色斑、抗衰老和丰胸等，由于具有良好的美容效果和极小的副作用，间充质干细胞受到了人们的重视，是目前研究较多的一种干细胞美容技术。

传统的干细胞美容术包括静脉输注干细胞，或水光针注射干细胞，其价格昂贵，起效慢，而且会造成皮肤创伤，风险大。使用的间充质干细胞大多来源于骨髓、脐带血、脂肪，细胞数量少、活性较低。与其他来源的干细胞相比，人胎盘绒毛膜间充质干细胞具有低免疫原性、无致瘤性、增殖能力强、数量充足、细胞纯净、分泌细胞因子含量高等优点，能够在体外大量扩增，在干细胞美容的应用中具有独特的优势。若间充质干细胞来源于18-26周岁、健康、首次妊娠、剖腹产的女性胎盘绒毛膜，所使用的干细胞均为低代次干细胞，最大限度的保证了细胞质量。胎盘绒毛膜间充质干细胞培养上清和细胞裂解物上清中含有丰富的具有生物活性的细胞因子，但由于液态的培养上清在常温保存时间短，细胞因子失效快，严重阻碍了它的推广和应用。

发明内容

本发明提出了一种富含干细胞细胞因子的冻干粉制备方法，解决了现有技术中液态培养上清常温保存时间短、细胞因子含量不足和质量不佳的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种富含细胞因子的冻干粉制备方法，经过下列各步骤：

（1）间充质干细胞分离与培养：无菌条件下分离新鲜胎盘绒毛膜间充质干细胞，用无血清间充质干细胞培养基培养扩增人胎盘绒毛膜间充质干细胞；

（2）上清液收集：收集P2-P3代之间人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养上清液和P4代细胞裂解物上清液；

（3）冻干粉制备：将所收集的两种上清液混合，加入甘露醇作为保护剂和赋型剂，低温冷冻干燥制备成冻干粉。

作为本发明一种富含细胞因子的冻干粉制备方法的一种优选实施方式，步骤（1）干细胞分离与培养具体为：取新鲜人胎盘剥离绒毛膜，用生理盐水清洗去除血渍，置于含有1%双抗(青霉素和链霉素）的生理盐水中浸泡10min，在置于注射用甲硝唑注射液中浸泡10min，最后再用生理盐水清洗一次，用灭菌的手术器材将胎盘绒毛膜组织剪碎至大小为直径1-2mm；将组织块平铺于培养瓶中进行原代培养，待有足够传代的间充质干细胞长出后进行传代体外扩增。

作为本发明一种富含细胞因子的冻干粉制备方法的一种优选实施方式，步骤（2）上清液收集具体为：胎盘绒毛膜间充质干细胞培养至第二代后开始收集上清，当P2代细胞生长至80-90%汇合度时，细胞进行传代用DPBS清洗细胞1次，加重组胰酶将细胞消化为单细胞，DPBS清洗一次后按照1:4的传代比例传至细胞培养瓶中继续培养；当P3代细胞生长至80-90%汇合度时，收集培养上清后再次传代，培养上清同样置于-80℃保存；当P4代细胞生长至80-90%汇合度时，收集培养上清，置于-80℃保存，细胞用DPBS清洗细胞1次，加重组胰酶将细胞消化为单细胞，离心去除胰酶溶液，按照每5×10⁵个细胞/ml的浓度加入生理盐水重悬细胞，置于-80℃条件下2h后，取出并置于2-4℃条件下解冻，完全融化后再次置于-80℃条件下，如此反复冻融3次，3500rpm/min，4℃离心10min，收集上清，置于-80℃保存，收集的所有上清用于后续冻干粉的制备。

作为本发明一种富含细胞因子的冻干粉制备方法的一种优选实施方式，步骤（3）冻干粉制备具体为：将步骤（2）中收集的所有上清4℃解冻后，在无菌条件下混合两种上清，并加入甘露醇作为冻干保护剂和赋形剂，待甘露醇完全溶解后置于4℃暂存，24h内置于冻干机中开始进行冻干制备；冻干程序如下：0℃，1h；0℃降至-10℃，2h；-10℃降至-20℃,3h；-20℃降至-30℃,10h；-30℃,1h，开始抽真空；-30℃升至-20℃,10h；-20℃升至-5℃,2h；-5℃回温至25℃,3h；冻干结束后收集冻干粉，4℃保存。

作为本发明一种富含细胞因子的冻干粉制备方法的一种优选实施方式，所述胎盘来自18-26周岁、健康、首次妊娠、剖腹产的孕妇。

作为本发明一种富含细胞因子的冻干粉制备方法的一种优选实施方式，所述间充质干细胞来源于人胎盘绒毛膜。

作为本发明一种富含细胞因子的冻干粉制备方法的一种优选实施方式，所述胎盘绒毛膜间充质干细胞最高代次为4代。

作为本发明一种富含细胞因子的冻干粉制备方法的一种优选实施方式，所述上清液包含P2-P4代胎盘绒毛膜间充质干细胞培养上清液和P4代细胞裂解物上清液。

作为本发明一种富含细胞因子的冻干粉制备方法的一种优选实施方式，所述添加甘露醇直至甘露醇的浓度达到6%。

本发明所涉及到的一种富含因子冻干粉的制备方法能够解决细胞因子失效快、难以保存、有效细胞因子数量不足和质量不佳的缺点。

冻干保护剂甘露醇可用来保证冻干过程的顺利进行和调节渗透压，甘露醇上的羟基能替代蛋白质表面水的羟基，使蛋白质表面形成一层假定的水化膜，这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干而变性，使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持蛋白质结构与功能的完整性。作为一种赋形剂，甘露醇具有较高的化学稳定性，使冻干粉保持良好的物理特性，对人体无害，来源广，成本低。依据本发明制作的冻干粉含有6%的甘露醇，不仅能使冻干粉维持良好的物理特性，也提高了有效细胞因子的浓度。

与其他细胞因子冻干粉制备方法相比，本发明具有以下优势：

1）本发明一种富含干细胞细胞因子的冻干粉制备方法所制备的冻干粉取材于18-26周岁、健康、首次妊娠、剖腹产产妇的胎盘绒毛膜间充质干细胞，与其它来源间充质干细胞相比，本发明所采用的人胎盘绒毛膜间充质干细胞具有细胞活性高、增殖能力强、免疫原性低及细胞因子质量高等优点。

2）与传统仅收集细胞培养液上清制备冻干粉不同，本发明不仅收集培养上清内间充质干细胞分泌的细胞因子，还收集细胞裂解上清里间充质干细胞内产生的细胞因子，提高细胞因子浓度和种类，本发明方法收集的细胞因子生物活性为35000IU/ml，明显高于其它方法。

3）与其它采用P10代甚至P10代以后的间充质干细胞制备冻干粉方法不同，本发明方法仅采用P2-P4代之间的间充质干细胞制备冻干粉，有效避免了细胞由于在体外传代过多导致细胞活力下降、基因突变增多以及细胞因子质量下降等问题。

4）目前细胞因子冻干粉的制备加入的保护剂和赋型剂含量均在20%以上，严重影响细胞因子的有效浓度。本发明采用的方法加入的甘露醇浓度仅有6%，减少了成品中其他成分的含量，有效提高了细胞因子的浓度，并且使冻干粉保持良好的物理特性。

5）目前间充质干细胞的培养方法主要采用含有自体血清的间充质干细胞培养基，而本发明使用间充质干细胞无血清培养基，不仅能够维持细胞良好的生长状态，而且无血清培养基能够避免由血清诱导的间充质干细胞分化，维持间充质干细胞特性，保证上清中细胞因子的质量。

6）本发明方法中所采用的试剂均为人工合成试剂，无外源物质，成分明确，并进行相关临床监测符合标准。

7）本发明方法所制备的间充质干细胞培养液上清液和细胞裂解物上清液冻干粉有效保护了上清液中各种细胞因子的生物活性，降低保存条件，延长保存期限，提高有效细胞因子浓度，为人间充质干细胞培养上清液和细胞裂解物上清在护肤领域的产业化应用奠定了基础。

附图说明

图1是分离获得的P1-P3代人绒毛膜间充质干细胞形态图；其中，A为原代代间充质干细胞；B为第1代间充质干细胞；C为第2代间充质干细胞；D为第3代间充质干细胞；E为第4代间充质干细胞。

图2是流式细胞术检测P3代人绒毛膜间充质干细胞表面抗原表达情况图：其中，A为收集细胞位置；B为获取的数据，共收集15888个细胞，其中R1门中有15590个细胞，R2门中有15590个细胞，R3门中有15519个细胞，R4门中有15483个细胞，R5门中有15368个细胞；绒毛膜间充质干细胞的比例为98.58%；C为CD90阳性峰图；D为CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性峰图；E为CD105阳性峰图；F为CD73阳性峰图。

具体实施方式

为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合具体实施例作进一步说明。

下列实施例仅用于说明本发明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明所用的间充质干细胞无血清培养基购自BI，货号为05-200-1A。

本发明所用的重组细胞胰酶溶液购自BI，货号为03-079-1B。

实施例1

人胎盘绒毛膜间充质干细胞体外培养

将采集的新鲜的人胎盘置于无菌不锈钢碗中，用无菌手术镊子和剪刀剥去羊膜后剥离绒毛膜，置于生理盐水清洗去除血渍，用含有1%双抗(青霉素和链霉素）的生理盐水中浸泡10min,浸泡过程中不断摇晃使液体于组织充分接触，在置于注射用甲硝唑注射液中浸泡10min，同样浸泡过程中不断摇晃，最后再用生理盐水清洗一次，用灭菌的手术剪刀将组织剪碎至大小为1-2mm，取1ml碎组织加入T75培养瓶内，加入7ml无血清间充质干细胞培养基，摇晃培养瓶使组织平铺于T-75细胞培养瓶底部，置于37℃、饱和湿度、5%CO₂培养箱中静置培养，每隔2-3天换液一次，原代培养7-10天后可进行传代，弃去T-75培养瓶无血清间充质干细胞培养基和悬浮的组织，加入10mlDPBS 清洗细胞一次，弃去DPBS后加入3ml重组型胰酶，轻轻晃动培养瓶使重组型胰酶与细胞充分接触，37℃消化2-3min，待细胞开始脱落后轻轻拍打培养瓶侧壁，将细胞消化成单细胞，加入9ml DPBS稀释胰酶终止消化，用10ml移液管吹打细胞培养瓶底部2-3次并将细胞悬液转移至50ml离心管中，1500rpm离心5min。弃上清，调整细胞浓度，每个T75培养瓶内接种1×10⁶个细胞，置于37℃、饱和湿度、5%CO₂培养箱内培养，每隔2-3天观察一次细胞生长情况，图1的A、B、C、D和E分别为绒毛膜间充质干细胞P0、P1、P2、P3和P4代的细胞形态。

实施例2

人胎盘绒毛膜间充质干细胞的培养上清收集及细胞传代

当P2、P3、P4代细胞生长长至汇合度达80-90%时，收集培养上清至无菌容器中，置于-80℃保存。P2、P3代细胞继续进行传代，T-75培养瓶加入10mlDPBS 清洗细胞一次，T-175培养瓶加入15mlDPBS清洗细胞一次，弃去DPBS后，T-75培养瓶加入3ml重组型胰酶，T-175培养瓶加入6ml重组型胰酶，轻轻晃动培养瓶使重组型胰酶与细胞充分接触，37℃消化2-3min，待细胞开始脱落后轻轻拍打培养瓶侧壁，将细胞消化成单细胞，T-75培养瓶加入9ml DPBS稀释胰酶终止消化，T-175培养瓶加入15ml DPBS稀释胰酶终止消化，用10ml移液管吹打细胞培养瓶底部2-3次并将细胞悬液转移至50ml离心管中，1500rpm离心5min。弃上清，调整细胞浓度，每个T-75培养瓶内接种1×10⁶个细胞，每个T-175培养瓶内接种3×10⁶个细胞，将培养瓶置于37℃、饱和湿度、5%CO₂培养箱内继续培养。将得到的P3代绒毛膜间充质干细胞进行流式细胞术检测（图2），方法如下：

实验原理：利用流式细胞技术检测间充质干细胞特异性表面抗体表达情况。根据抗原抗体结合原理，选用BD公司人类间充质干细胞检测试剂盒，用特定荧光素标记的抗体对已知携有相应抗原的细胞进行染色。经荧光素标记抗体染色的细胞可以被流式细胞仪识别，并根据已知细胞所携带的荧光素的强度，对标记抗体进行定性，定量分析。检测试剂盒配备了国际通用的MSC的五阴（CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR）三阳（CD73、CD90、CD105）检测抗体和对应的对照抗体。

检测步骤：

（1）取7根流式管，分别为

①空白对照

②FITC-CD90 单染管

③PE 单染管

④PerCP-CD105单染管

⑤APC-CD73单染管

⑥Positive antibody isotype（阳性混合抗体的对照抗体） + Negative antibodyisotype（阴性混合抗体的对照抗体）

⑦Positive antibody cocktail（阳性混合抗体）（CD73、CD90、CD105）+ Negativeantibody cocktail（阴性混合抗体）（CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR）

（2）各流式管分别加入相同量的传代细胞（有核细胞数2-5×10⁵个），不可粘到管壁。

（3）各流式管加入对应抗体

①不加任何抗体

②加入CD90-FITC 5ul

③加入PE-Negative cocktail 5μl

④加入CD105-Per CP 5ul

⑤加入CD73-APC 5ul

⑥加入阳性混合抗体的对照抗体（Positive antibody isotype）和阴性混合抗体的对照抗体（Negative antibody isotype）

⑦加入阳性混合抗体（Positive antibody cocktail）和阴性混合抗体（Negativeantibody cocktail）

（4）涡旋振荡器混匀各检测管后，室温避光放置30min，加入1mL PBS/管，涡旋混匀后，1200rpm/min，离心5min。

（5）弃上清，重复洗涤3次，最后加入0.5mL PBS重悬细胞，上机检测（若不能及时上机，应加入2%多聚甲醛溶液固定剂）。

（6）上机分析结果得：共收集15888个细胞，其中CD90阳性细胞占100%，CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性细胞占99.54%，CD105阳性细胞占99.31%，CD73阳性细胞占98.58%，所以CD73、CD90、CD105表达率在98%以上，为阳性；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR表达率小于1%，为阴性；另外由于流式门的逻辑关系CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性细胞中CD73、CD90、CD105共阳性细胞占98.58%。

上述说明：按照实施例中的方法分离培养得到的人绒毛膜间充质干细胞，满足CD73、CD90、CD105 大于95%，为阳性；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR小于2%，为阴性的结果，经鉴定为间充质干细胞。

P4代细胞收集培养上清后，按照每5×10⁵个细胞/ml的浓度加入生理盐水，置于-80℃条件下2h后，取出2-4℃解冻，完全融化后再次置于-80℃条件下，如此反复冻融3次，3500rpm/min,4℃离心10min，收集上清，置于-80℃保存，收集的所有上清用于后续冻干粉的制备。

实施例3

冻干粉的制备

将一个胎盘分离获得的间充质干细胞制备出的培养上清和细胞裂解上清4℃解冻后，在无菌条件下混合两种上清，加入甘露醇至其浓度达到6%，甘露醇作为冻干保护剂和赋形剂，待甘露醇完全溶解后置于4℃暂存，24h内置于冻干机中开始进行冻干制备。冻干程序如下：0℃，1h；0℃降至-10℃，2h；-10℃降至-20℃,3h；-20℃降至-30℃,10h；-30℃,1h，开始抽真空；-30℃升至-20℃,10h；-20℃升至-5℃,2h；-5℃回温至25℃,3h。冻干结束后收集冻干粉，4℃保存。

人间充质干细胞在培养过程中可分泌许多细胞因子，这些细胞因子主要包括包括表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、生长分化因子11（GDF-11）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、肝细胞生长因子（HGF）、转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素6（IL-6）、前列腺素2（PGE2）、色氨酸代谢酶（IDO）、一氧化氮合酶（iNOS）等，其中表皮生长因子能促进表皮细胞新陈代谢，皮肤快速代谢老化角质，修复痘印，细化皱纹，增强自身肌肤的保水及锁水能力，具有增强肌肤弹性、减少皱纹，防止肌肤衰老和渗透滋养等作用。碱性成纤维生长因子能够促进真皮细胞的增殖、分化，改善细胞生活微环境，促进受损皮肤的修复和细化皱纹，恢复细胞活力，内源性调节胶原蛋白让皮肤充盈有弹性，焕发健康光泽，可用于问题性皮肤的深层修复和除皱。

但常规细胞因子溶于液体后保存期仅为1个月，不利于干细胞在美容方面的应用，并且细胞因子含量不足，美容效果不佳。而本发明一种富含细胞因子的冻干粉制备方法所制备的冻干粉有效地保存了人间充质干细胞培养上清中的各种细胞因子的生物活性，保存期可长达2年。与其他研究者所采用的脂肪或其它来源的间充质干细胞相比，本发明所采用的胎盘绒毛膜间充质干细胞为生长状态最好的P2-P4代胎盘绒毛膜间充质干细胞（图1）培养上清液和P4代细胞裂解物上清液，具有活力更好、细胞因子数量更多和质量更佳等优势，细胞因子生物活性高达35000IU/ml，因此依据本发明制作的冻干粉细胞因子的浓度和质量都远远高于其他方法。

应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种富含细胞因子的冻干粉制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤（1），间充质干细胞分离与培养：无菌条件下分离新鲜胎盘绒毛膜间充质干细胞，用无血清间充质干细胞培养基培养扩增人胎盘绒毛膜间充质干细胞：

新鲜人胎盘剥离绒毛膜，用生理盐水清洗去除血渍，置于含有1%双抗的生理盐水中浸泡10min，在置于注射用甲硝唑注射液中浸泡10min，最后再用生理盐水清洗一次，用灭菌的手术器材将胎盘绒毛膜组织剪碎，直径大小为1-2mm；将组织块平铺于培养瓶中进行原代培养，待有足够传代的间充质干细胞长出后进行传代扩增；

步骤（2），上清液收集：收集P2-P4代之间人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养上清液和P4代细胞裂解物上清液：

胎盘绒毛膜间充质干细胞培养至第二代后开始收集上清；当P2代细胞生长至80-90%汇合度时进行培养上清收集，收集的培养上清置于-80℃保存；细胞进行传代用DPBS清洗细胞1次，加重组胰酶将细胞消化为单细胞，DPBS清洗一次后按照1:4的传代比例传至细胞培养瓶中继续培养；当P3代细胞生长至80-90%汇合度时，收集培养上清后再次传代，培养上清同样置于-80℃保存；当P4代细胞生长至80-90%汇合度时，收集培养上清，置于-80℃保存，细胞用DPBS清洗细胞1次，加重组胰酶将细胞消化为单细胞，离心去除胰酶溶液，按照每5×10⁵个细胞/ml的浓度加入生理盐水重悬细胞，置于-80℃条件下2h后，取出并置于2-4℃条件下解冻，完全融化后再次置于-80℃条件下，如此反复冻融3次，3500rpm/min，4℃离心10min，收集上清，置于-80℃保存，收集的所有上清用于后续冻干粉的制备；

步骤（3），冻干粉制备：将步骤（2）中收集的所有上清4℃解冻后，在无菌条件下混合收集的上清，并加入甘露醇作为冻干保护剂和赋形剂，加入甘露醇至其浓度达6%，待甘露醇完全溶解后置于4℃暂存，24h内置于冻干机中开始进行冻干制备；冻干程序如下：0℃，1h；0℃降至-10℃，2h；-10℃降至-20℃,3h；-20℃降至-30℃,10h；-30℃,1h，开始抽真空；-30℃升至-20℃,10h；-20℃升至-5℃,2h；-5℃回温至25℃,3h；冻干结束后收集冻干粉，4℃保存。

2.根据权利要求1所述的一种富含细胞因子的冻干粉制备方法，其特征在于：所述步骤（1）胎盘来自18-26周岁、健康、首次妊娠、剖腹产的孕妇。

3.根据权利要求1所述的一种富含细胞因子的冻干粉制备方法，其特征在于：所述步骤（1）间充质干细胞来源于人胎盘绒毛膜。

4.根据权利要求1所述的一种富含细胞因子的冻干粉制备方法，其特征在于：所述步骤（2）胎盘绒毛膜间充质干细胞最高代次为4代。

5.根据权利要求1所述的一种富含细胞因子的冻干粉制备方法，其特征在于：所述步骤（2）上清液包含P2-P4代胎盘绒毛膜间充质干细胞培养上清液和P4代细胞裂解物上清液。