CN101802177A

CN101802177A - 从人或动物胚胎提取间质性干细胞及提取其分泌物的方法

Info

Publication number: CN101802177A
Application number: CN200980000501A
Authority: CN
Inventors: 连祺周; 夏建川
Original assignee: TEAM YOUN BIOMEDICAL Tech CO Ltd
Current assignee: TEAM YOUN BIOMEDICAL Tech CO Ltd
Priority date: 2008-10-10
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2010-08-11
Also published as: WO2010040262A1; WO2010040302A1; KR20100065338A; EP2368974A1; AU2009301517A1; CA2740092A1; JP2010538681A; US20110217385A1

Abstract

本发明涉及一种从人或动物胚胎提取间质性干细胞的方法，包括：A.基于人或动物胚胎取样，对样品进行离心处理；B.利用酶类消化液对样品进行消化，并制成单细胞悬液，其中所述酶类消化液包括胰酶-EDTA和IV型胶原酶；C.在分离的单细胞中加入间质性干细胞A型培养液，进行细胞接种并培养；D.对细胞进行贴壁纯化处理，并通过磁珠分选得到间质性干细胞。本发明还涉及从间质性干细胞提取分泌物的方法，该分泌物在美容、保健方面的应用，以及采用该分泌物制成的表皮细胞修复液。在本发明从人或动物胚胎提取间质性干细胞的过程中，采用胰酶-EDTA和IV型胶原酶混合液作为酶类消化液，能够获得最多的单细胞，同时将细胞受损程度降至最低。

Description

说明书从人或动物胚胎提取间质性干细胞及提取其分泌物的方法技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，更具体地说，涉及一种从人或动物胚胎提取间质性干细胞及提取其分泌物的方法。背景技术

间质性干细胞（Mesenchymal stem cells, MSC)是一类具有多分化潜能及自我更新能力的组织干细胞，可以分化为多种组织细胞：成骨、软骨、脂肪、神经细胞等。其最早自骨髓中分离出来，近年已有具有干 /祖细胞特征的间质性细胞自骨髓、外周血、密质骨、软骨、肌肉等组织分离出来。这些组织的共同特点是由来源于胚外中胚层的间充质和血管共同构成。间质性干细胞易于从骨髓中分离纯化，进行有效的体外扩增，具有改善骨髓环境、促进造血重建的作用。在免疫特性方面，间质性干细胞不表达或仅表达可忽略水平的 MHCII 类分子，不相关供者的间质性干细胞不引起异体淋巴细胞反应，能下调异体免疫反应。由于具有上述特性， MSC自发现后即迅速成为细胞治疗、基因治疗等方面的理想工程细胞，以及组织工程尤其是骨或软骨组织损伤修复中重要的种子细胞。

目前报道的间质性干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度分离法获得。供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，而在取材过程中及取材后会有很高的感染几率；另外，由于人体骨髓中间质性干细胞的含量极其稀少，每 105〜106个单个核细胞中大约只有 1个间质性干细胞，且随着年龄的增加，或合并感染、肿瘤等疾病，骨髓中间质性干细胞的数量以及增殖分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到很大限制。

现有技术中分离间质性干细胞的常用方法，包括以下步骤：（1 )胎盘从子宫娩出后立即放血，得到样品；（2)采用持续灌注的方式，或采用胶原酶消化法，获得单细胞悬液；（3 ) 单细胞悬液经密度梯度离心法或免疫磁珠分离法，获得间质性干细胞。该现有技术产出率较低，无法快速得到大量的间质性干细胞，而且纯度较低；此外，处理过程对细胞的损伤程度较为严重，难以保证间质性干细胞的质量；另外，由于产出率较低，也难以提取出具有良好应用前景的分泌物。因此需要一种新的从人或动物胚胎提取间质性干细胞方法，能够迅速得到大量的、高纯度且高质量的间质性干细胞，还能实现其扩展应用。明内：

本发明的目的之一在于提供一种从人或动物胚胎提取间质性干细胞方法并提取其分泌物的方法，旨在解决现有技术中存在的产出率、纯度较低，且难以保证细胞质量的问题。

为了实现发明目的，所述从人或动物胚胎提取间质性干细胞的方法包括以下歩骤： A.基于人或动物胚胎取样，对样品进行离心处理； B.利用酶类消化液对样品进行消化，并制成单细胞悬液，其中所述酶类消化液包括胰酶 -EDTA和 IV型胶原酶； C.在分离的单细胞中加入间质性干细胞 A型培养液，进行细胞接种并培养； D.对细胞进行贴壁纯化处理，并通过磁珠分选得到间质性干细胞。

优选地，所述步骤 B中的酶类消化液包括：胰蛋白酶 0.125g/L〜0.375g/L; EDTA 0.075g/L~0.125g/L和 IV胶原酶 0.25g〃L~0.75 g〃L。

所述步骤 B中的酶类消化液的制备包括：将 100ml含 0.05g胰蛋白酶和 0.02gEDTA · 4Na的 D-HBSS与 lOOmml含 O.OlglV胶原酶的生理盐水按照 1 : 1的体积比混合。

优选地，所述间质性干细胞 A型培养液包括：

碱性成纤维细胞生长因子 1 ng/ml~100 ng/ml基质

表皮生长因子 1 ng/ml~100 ng/ml基质

血小板衍生生长因子 1 ng/ml〜100 ng/ml基质

其中，所述基质包括下列重量份数的成份：

DMEM培养基 68%〜97%

脐带血血浆 1%〜30%

抗生素和谷氨酰胺 1 %

非必须氨基酸 1 %

抗氧化剂 0〜0.1 %。

优选地，所述步骤 D中的贴壁纯化处理包括：

用移液管将未贴壁的细胞吸出，加入生理盐水清洗并换上新的间质性干细胞 A型培养液继续培养，待贴壁细胞扩增到培养瓶的设定容积时用胰酶 -EDTA 消化，获得单细胞悬液。

优选地，所述歩骤 D中的磁珠分选包括：

采用免疫磁珠分离法，从所述单细胞中筛选出 CD271和 CD73双阳性的细胞群，即从胚胎分离出的间质性干细胞。优选地，所述步骤 D之后还包括：

E.将所得的间质性干细胞进行增殖和传代；和 /或

F.提取出间质性干细胞的分泌物。

优选地，所述歩骤 F包括：

F1.利用酶类消化液对间质性干细胞进行消化处理；

F2.在收集的细胞中加入培养基进行接种培养，并加入间质性干细胞 B型培养液促进细胞产生分泌因子；

F3.对收集到的培养液离心过滤，得到分泌物。

优选地，所述间质性干细胞 B型培养液中包括碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子。

本发明的目的之二在于提供一种提取间质性干细胞的分泌物的方法，所述方法包括以下步骤：

Α'.利用酶类消化液对间质性干细胞进行消化处理；

Β'.在收集的单细胞中加入培养基进行接种培养，并加入间质性干细胞 Β 型培养液促进细胞产生分泌因子；

C'.对收集到的培养液离心过滤，得到分泌物。

优选地，所述步骤 A'进一歩包括

ΑΊ. 利用 lOOmL含 0.05g胰蛋白酶和 0.02gEDTA *4Na的消化液对间质性干细胞进行消化处理；

A'2.当间质性干细胞变圆脱落时，用含有牛血清的 1640培养液终止消化。优选地，所述间质性干细胞 B型培养液包括：

碱性成纤维细胞生长因子 1 ng/ml〜100 ng/ml基质

血小板衍生生长因子 1 ng/ml〜100 ng/ml基质

其中，所述基质由下列重量份数的原料配制成：

DMEM培养基 96.9%

丙酮酸钠 1%

抗生素和谷氨酰胺 1 %

非必须氨基酸 1 %

抗氧化剂 0.1 %

优选地，所述步骤 B'中加入间质性干细胞 B型培养液促进细胞产生分泌因子的步骤包括：当培养瓶中的细胞层扩增至设定容积时，吸出培养液并用磷酸盐缓冲液清洗；然后加入间质性干细胞 B型培养液，剌激间质性干细胞产生分泌因子。

优选地，所述步骤 B'中加入培养基进行接种培养的步骤包括：

在分离的单细胞中加入间质性干细胞培养基，摇匀并调整到 5〜8 X 10⁴个细胞 /ml的细胞密度；

将调整后的细胞溶液接种到多个培养瓶中，置于 5〜10%CO₂、 37°C、饱和湿度的培养箱中培养。

本发明的目的之三在于提供根据本发明的上述提取间质性干细胞的分泌物的方法所产生的分泌物。

本发明的目的之四在于提供根据本发明的上述提取间质性干细胞的分泌物的方法所产生的分泌物在人体美容方面的应用。

本发明的目的之五在于提供根据本发明的上述提取间质性干细胞的分泌物的方法所产生的分泌物在保健品方面的应用。

本发明的目的之六在于提供一种表皮细胞修复液，包括下列重量份数的成份：

溶剂 50〜94%

防腐剂 0〜0.5%

保湿剂 0〜3%

分泌物 0.5~25%

胶原蛋白 5〜25%。

优选地，所述防腐剂包括：咪唑烷基脲、羟苯丙酯和 /或羟苯甲酯；所述保湿剂包括丙三醇和 /或透明质酸。

由上可知，本发明从人或动物胚胎提取间质性干细胞的过程中，采用混合的酶类消化液作为消化液，能够获得更多的单细胞，同时将细胞受损程度降至最低；另外通过贴壁纯化和免疫磁珠分离筛选出的间质性干细胞，提高了纯度。另外，在分离的单细胞中加入间质性干细胞 A型培养液，进行细胞接种并培养，从而促进了细胞的生长和增殖。再者，在间质性干细胞培养的过程中加入间质性干细胞 B型培养液，能刺激间质性干细胞产生更多的分泌因子，因此，从间质性干细胞中提取出其分泌物含有更多的细胞分泌因子。附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图 1是本发明的一个实施例中人或动物提取间质性干细胞的方法流程图；图 2是本发明的一个实施例中采用酶类消化液消化后，原代细胞贴壁生长示意图；

图 3是本发明的另一实施例中采用酶类消化液消化后，原代细胞贴壁生长示意图；

图 4是本发明的再一实施例中采用酶类消化液消化后，原代细胞贴壁生长示意图；

图 5是本发明的一个实施例中采用间质性干细胞 A型培养液进行细胞接种并培养，获得细胞贴壁生长情况示意图；

图 6是本发明的另一个实施例中采用间质性干细胞 A型培养液进行细胞接种并培养，获得细胞贴壁生长情况示意图- 图 7是本发明的再一个实施例中采用间质性干细胞 A型培养液进行细胞接种并培养，获得细胞贴壁生长情况示意图；

图 8是采用现有技术的培养液进行细胞接种并培养，获得细胞贴壁生长情况示意图；

图 9是本发明的又一个实施例的从人或动物胚胎提取间质性干细胞的方法流程图；

图 10是本发明的一个实施例中间质性干细胞表面蛋白表达鉴定的示意图；图 11是本发明的一个实施例中细胞化学方法诱导胎盘间质性干细胞分化为脂肪、软骨及成骨细胞的示意图；

图 12是本发明的一个实施例中提取间质性干细胞的分泌物的方法流程图；图 13是本发明的一个实施例中鉴定间质性干细胞的分泌因子的示意图；图 14是本发明的一个实施例中经检测发现间质性干细胞的分泌物中含有大量的细胞生长因子群和胶原蛋白分子群；

图 15是本发明的一个实施例中间质性干细胞分泌物在表皮修复中的作用的示意图；

图 16是本发明的一个实施例的表皮细胞修复液对于烧伤创面的修复示意图；

图 17是本发明的一个实施例的表皮细胞修复液在人体美容方面的应用示意图。具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

图 1示出了本发明的一个实施例中人或动物提取间质性干细胞的方法流程图；包括如下步骤：在步骤 S101中，基于人或动物胚胎取样，对样品进行离心处理。在歩骤 S102中，利用酶类消化液对样品进行消化，并制成单细胞悬液。在步骤 S103中，在分离的单细胞中加入间质性干细胞 A型培养液，进行细胞接种并培养。在歩骤 S 104中，对细胞进行贴壁纯化处理，并通过磁珠分选得到间质性干细胞。在本发明的一个优选实施例中，所述步骤 S102进一步包括：

1、在离心后，吸弃上清液。将 0.375g胰蛋白酶、 0.125g EDTA和 0.25gIV胶原酶溶解到 1L生理盐水中，配置成本发明的酶类消化液。然后将配置好的酶类消化液加入 30ml到离心管中于 37°C恒温水浴摇床中消化 1.5~2h，获得的原代细胞贴壁生长情况如图 2所示。在本发明的另一实施例中，可以先将 0.375g胰蛋白酶、 0.125g EDTA溶解到 500ml的 D-HBSS中，然后再将 0.25gIV胶原酶溶解到 500ml生理盐水中，然后将 500ml的 D-HBSS和 500ml生理盐水混合，制备成 1L本发明的酶类消化液。在本发明的其他实施例中，本领域技术人员也可采用其他方法、或缓冲液来配置本发明的酶类消化液。

2、在消化完毕后的溶液中加入 3〜5倍体积的生理盐水稀释，振荡均匀，并用电动移液枪吸取过 100 μ m细胞筛网，从而制成单细胞悬液。

在本发明的另一实施例中，可将 100ml含 0.05g胰蛋白酶和 0.02gEDTA -4Na 的 D-HBSS与 lOOmml含 O.OlglV胶原酶的生理盐水等体积混合，配置本发明的酶类消化液。然后，加入 30ml配置好的酶类消化液到离心管中于 37°C恒温水浴摇床中消化 1.5~2h，获得的原代细胞贴壁生长情况如图 3所示。在本发明的其他实施例中，也可采用如 PBS来代替生理盐水。在本发明的优选实施例中，可将 GIBCO公司生产的胰酶 -EDTA (0.05 % )与胶原酶消化液（ImglV胶原酶 /ml 生理盐水）按照体积比 1 : 1混合来制备。

在本发明的再一实施例中，可将 0.125g胰蛋白酶、 0.075g EDTA和 0.75gIV 胶原酶溶解到 500ml生理盐水和 500mlD-HBSS的混合液中，配置成本发明的酶类消化液。然后将配置好的酶类消化液加入 30ml到离心管中于 37°C恒温水浴摇床中消化 1.5〜2h，获得的原代细胞贴壁生长情况如图 4所示。

在本发明的其他实施例中，还可按照其他配比、缓冲液或方法来配置本发明的酶类消化液。例如，将 0.2g胰蛋白酶、 0.05g EDTA ， 4Na溶解到 500mlD-HBSS中，同时将 0.5gIV胶原酶溶解到 500ml生理盐水或 PBS中，然后将 500ml的 D-HBSS和 500ml生理盐水混合，制备成 1L本发明的酶类消化液。

经反复实验表明，将 GIBCO公司生产的胰酶 -EDTA (0.05 % )与胶原酶消化液（ImglV胶原酶 /ml生理盐水）等体积混合，消化时间（1.5〜2h) ，能使酶对细胞的消化损伤程度降至最低，同时又能获得最多的单细胞，因此在消化过程中掌握好两种酶的配置和消化时间对成功的从人胎盘中分离间质性干细胞至关重要。

在本发明的一个优选实施例中，所述间质性干细胞 A型培养液包括基质、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和血小板衍生生长因子。基质中碱性成纤维细胞生长因子的浓度为 1 ng /ml、表皮生长因子的浓度为 1 ng/ml、血小板衍生生长因子的浓度为 1 ng/ml。在该实施例中，基质中含 97 %重量分数的 DMEM培养基， 1 %重量分数的脐带血血浆， 1 %重量分数的青霉素一链霉素一谷氨酰胺溶液， 1 %重量分数的非必须氨基酸（Non-essential amino acids)。采用上述间质性干细胞 A型培养液进行细胞接种并培养，获得细胞贴壁生长情况如图 5所示。

在本发明中，除特别说明外，上述间质性干细胞 A型培养液和上述间质性干细胞 B型培养液的基质中的各个组分均购自美国 GIBCO公司。

在本发明的另一个优选实施例中，所述间质性干细胞 A型培养液包括基质、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和血小板衍生生长因子。基质中碱性成纤维细胞生长因子的浓度为 25 ng /ml、表皮生长因子的浓度为 25ng/ml、血小板衍生生长因子的浓度为 25 ng/ml。在该实施例中，基质中含 77.9%重量分数的 DMEM培养基， 20%重量分数的脐带血血浆， 1 %重量分数的青霉素一链霉素一谷氨酰胺溶液， 1 %重量分数的非必须氨基酸， 0.1 %重量分数的 β -巯基乙醇。采用上述间质性干细胞 Α型培养液进行细胞接种并培养，获得细胞贴壁生长情况如图 6所示。

在本发明的另一个优选实施例中，所述间质性干细胞 A型培养液包括基质、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和血小板衍生生长因子。基质中碱性成纤维细胞生长因子的浓度为 100 ng /ml、表皮生长因子的浓度为 100 ng/ml、血小板衍生生长因子的浓度为 100 ng/mL在该实施例中，基质中含 67.9 %重量分数的 DMEM培养基， 20%重量分数的脐带血血浆， 1 %重量分数的青霉素一链霉素一谷氨酰胺溶液， 1 %重量分数的非必须氨基酸， 0.1 %重量分数的 β -巯基乙醇。采用上述间质性干细胞 Α型培养液进行细胞接种并培养，获得细胞贴壁生长情况如图 Ί所示。

图 8是釆用现有技术的培养液进行细胞接种并培养，获得细胞贴壁生长情况示意图。从图 5-8示出的细胞贴壁生长情况对比可以看出，当采用了间质性干细胞 A型培养液进行培养以后，明显促进了细胞的生长。

图 9是本发明的一个实施例的从人或动物胚胎提取间质性干细胞的方法流程图。如图 9所示，在歩骤 S901中，基于动物胎盘和 /或脐带取样，对样品进行离心处理。在本发明的一个实施例中，所述步骤具体实现过程是： 1、将新鲜的胎盘用剪刀去掉外面的膜，取内部暗红的组织块，最好取血管密集部位的组织，此处血管交织如树根状，用生理盐水（加肝素， 500ml盐水加 2支肝素， 12500IU/支，终浓度为： 50单位肝素 /ml生理盐水）洗净组织中的血液，用不含肝素的生理盐水洗一遍，然后用剪刀将组织块剪碎（越碎越好）。对脐带的处理方式是：将脐带剪成约 2cm每段，用含肝素的盐水洗净血液，纵向剪破，洗净内部的血液，再用不含肝素的生理盐水洗一次，用剪刀将脐带剪碎。当然，本发明并不限定于上述方式，也可选取胚胎的其他部分作为本发明的原料。 2、将样品转入装有生理盐水的离心管中，进行离心处理。在一个优选实施例中，将收集到的样品置入装有生理盐水的 50ml离心管中， 1200rpm、 lOmin离心。

在歩骤 S902中，利用酶类消化液对样品进行消化，并制成单细胞悬液。在本发明的一个实施例中，所述步骤具体实现过程是： 1、离心后，吸弃上清液，按体积比 1 : 1混合胰酶 -EDTA (0.05 % )和 IV型胶原酶（lmg/ml) ，加入 30ml 到离心管中于 37°C恒温水浴摇床中消化 1.5〜2h。当然，在消化处理的步骤中还可以采用其他的配备方案，具体可参见前文所述； 2、在消化完毕后的溶液中加入 3〜5倍生理盐水稀释，振荡均匀，并用电动移液枪吸取过 100 μ ιη细胞筛网，从而制成单细胞悬液。

在步骤 S903中，通过单细胞悬液得到分离的单细胞，并在分离的单细胞中加入间质性干细胞 Α型培养液，进行细胞接种并培养。在本发明的一个实施例中，所述步骤具体实现过程是： 1、单细胞悬液经 1600rpm、 lOmin离心后去上清； 2、加入间质性干细胞 A型培养液，摇匀并调整到 5〜8x l0⁴个细胞 /ml的细胞密度； 3、将调整后的溶液接种于多孔板（如 6孔板）中，置于 5%CO₂、 37°C、饱和湿度的培养箱中培养。当然，本发明还可采取其他的数据配置，上述的实现方式并不用以限定本发明的保护范围。其中所述间质性干细胞 A型培养液可选用上述实施例中的任意一种。

在步骤 S904中，对细胞进行贴壁纯化处理，并通过磁珠分选得到间质性干细胞。在本发明的一个实施例中，所述步骤具体实现过程是：

1、贴壁纯化处理，具体包括：

用移液管将未贴壁的细胞吸出，加入生理盐水清洗并换上新的间质性干细胞 A型培养液继续培养，待贴壁细胞扩增到培养瓶容积的 70%时用胰酶 -EDTA ( 0.05 % ) 消化，获得单细胞。

在本发明中，通过胰酶 -EDTA (0.05 % )来消化后获得的单细胞悬液通过普通离心（1600r/min) 获得的单细胞，在这种单细胞群体里面含有多种不同生物学特性的细胞，也混杂一些死细胞。然后用培养间质性干细胞的培养液进行筛选，能存活并能贴壁生长的细胞大部分是间质性干细胞，通过贴壁纯化可以去掉大量非间质性干细胞，

2、磁珠分选，具体包括：

采用免疫磁珠分离法，从所述单细胞中筛选出 CD271和 CD73双阳性的细胞群，即从胎盘分离出的间质性干细胞。磁珠分选可在最短时间内获得大量活的、高纯度的间质性干细胞。

在步骤 S905中，将所得的间质性干细胞进行增殖和传代，其具体实现过程是： 1、用移液枪吸去瓶内的培养基。 2、加入少量磷酸盐缓冲液轻轻洗一遍，吸弃，从而平衡 PH值。 3、加入胰酶 -EDTA (0.05%), 酶液没过瓶底即可，在显微镜下观察，至大部分细胞变圆脱落即可用含有胎牛血清的 1640培养液终止消化。 4、用移液枪吸取瓶内培养液反复吹打细胞层，收集细胞悬液至一个 50ml 离心管，再用 PBS洗培养瓶一次。 5、经 1200rpm、 8min离心细胞悬液，去上清，加入间质性干细胞 A型培养液，打匀细胞，按 1 : n的比例进行传代扩瓶。从而获得大量的胎盘间质性干细胞。其中 η>1，例如 n典型的可取值为 4。

图 10是本发明其中一个实施例中间质性干细胞表面蛋白表达鉴定的示意图。本发明用流式细胞仪检测胎盘间质性干细胞表明细胞因子的表达，可见分离培养的胎盘间质性干细胞表达 CD9、 CD29、 CD105、 CD166表面蛋白，不表达 CD34、 CD13、 CD14、 CD45表面蛋白，这群细胞生物特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到 95 %和 98 %。在该图中，空心的浅色曲线是代表一种细胞因子表达的阴性对照，实心黑颜色图案表示细胞群体中表达相应细胞因子阳性率的高低。如果实心黑颜色图案离空心的浅色曲线越远，这种细胞因子的阳性率就越高。

图 11是本发明其中一个实施例中细胞化学方法诱导胎盘间质性干细胞分化为脂肪、软骨及成骨细胞的示意图。胎盘间质性干细胞（PDMSC)连续传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自发分化，在体外特定的诱导条件下， PDMSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。其中：图 A显示在加入成脂诱导剂后，会导致胎盘间质性干细胞分化为脂肪细胞且油红染色为阳性，浆内可见橙红色脂滴。图 B显示加入成骨诱导剂后，胎盘间质性干细胞分化为成骨细胞， Von Kossa进行成骨细胞鉴定。 Von Kossa染色可见细胞深棕色,间布满黑色颗粒，提示有矿化基质沉积。图 C显示加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达。图 D免疫组化方法检测显示诱导分化后表达软骨细胞特有胶原蛋白 II—软骨细胞。

需要进行扩充说明的是，胎盘间质性干细胞作为人类胚胎干细胞 (hESC) 和老鼠胚胎干细胞 (mESC)滋养层的应用。胎盘间质性干细胞（PDMSC)作为细胞滋养层为人类胚胎干细胞 (hESC)和老鼠胚胎干细胞 (mESC)提供生长支持，并保持胚胎干细胞处于未分化状态。目前使用小鼠的胚胎纤维原细胞 (MEF) 作为人类胚胎干细胞 OiESC)和老鼠胚胎干细胞 (mESC)的滋养层。但是，使用小鼠的胚胎纤维原细胞 (MEF)作为干细胞的生长滋养层受到诸多限制： 1.存在动物源性污染的风险； 2.提取大量小鼠的胚胎纤维原细胞 (MEF)需要杀死许多小鼠。使用健康人来源的胎盘间质性干细胞（PDMSC ) 作为胚胎干细胞的滋养层有独特的优势： 1.避免牺牲很多小鼠，取材于丢弃的健康人来源的胎盘组织； 2.避免了动物源性污染的风险； 3.使用人体的胎盘间质性干细胞（PDMSC ) 作为人体胚胎干细胞的滋养层对培养人体胚胎干细胞更有利。因此，作为人类胚胎干细胞 OiESC)滋养层的来源， PDMSC是比小鼠的胚胎纤维原细胞MEF) 更理想的选择。

图 12是本发明其中一个实施例中提取间质性干细胞的分泌物的方法流程图。在歩骤 S 1201中，利用酶类消化液对间质性干细胞进行消化处理，其具体过程包括： 1、细胞大量扩增后，在 175cm²培养瓶中长到 80%左右时，加入胰酶 -EDTA ( 0.05% )进行消化处理。 2、当所述间质性干细胞变圆脱落时，用含有牛血清的 1640培养液终止消化。

在歩骤 S 1202中，在收集的细胞中加入培养基进行接种培养，并加入间质性干细胞 B型培养液促进细胞产生更多的分泌因子，其具体过程包括：

1、在收集的细胞中加入培养基进行接种培养。在一个优选实施例中，上述步骤的具体过程是：在收集的细胞中加入间质性干细胞培养基，摇匀并调整到 5〜8x l0⁴个细胞 /ml的细胞密度；将调整后的溶液接种到培养瓶中，置于 5%C0₂、 37 °C、饱和湿度的培养箱中培养。在本发明的其他实施例中，也可按照需要调节 5%CO₂的浓度，比如 10 %， 8 %， 6 %等等

2、加入间质性干细胞 B型培养液促进细胞产生更多的分泌因子。在一个优选实施例中，上述步骤的具体过程是：当培养瓶中的细胞层扩增至 80%时，吸出培养液并用磷酸盐缓冲液清洗。

在本发明的第一优选实施例中，所述间质性干细胞 B型培养液包括基质、碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子。基质中碱性成纤维细胞生长因子的浓度为 1 ng /ml、血小板衍生生长因子的浓度为 1 ng/ml。在该实施例中，基质中含 96.8 %重量分数的 DMEM培养基， 1 %重量分数的青霉素一链霉素一谷氨酰胺溶液， 1 %重量分数的非必须氨基酸， 0.1 %重量分数的 β -巯基乙醇和 1 %重量分数的丙酮酸钠。

在本发明的第二优选实施例中，所述间质性干细胞 Β型培养液包括基质、碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子。基质中碱性成纤维细胞生长因子的浓度为 25 ng I 血小板衍生生长因子的浓度为 25 ng/ml。在该实施例中，基质中含 96.8 %重量分数的 DMEM培养基， 1 %重量分数的青霉素一链霉素一谷氨酰胺溶液， 1 %重量分数的非必须氨基酸， 0.1 %重量分数的 β - 巯基乙醇和 1 %重量分数的丙酮酸钠。

在本发明的第三优选实施例中，所述间质性干细胞 Β型培养液包括基质、碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子。基质中含碱性成纤维细胞生长因子的浓度为 100 ng /ml、血小板衍生生长因子的浓度为 100 ng/ml。在该实施例中，基质中含 96.8 %重量分数的 DMEM培养基， 1 %重量分数的青霉素一链霉素一谷氨酰胺溶液， 1 %重量分数的非必须氨基酸， 0.1 %重量分数的 β -巯基乙醇和 1 %重量分数的丙酮酸钠。在步骤 S1203中，对收集到的培养液离心过滤，得到分泌物。上述步骤的具体过程是： 1、收集培养液，经 2000 rpm、 8min离心后收集上清液。在一个优选实施例中，上述步骤的具体过程是：培养 3天后收集培养液。经 2000G、 8min离心收获液，去除细胞碎片，并收集上清液。 2、用 0.22um的过滤器过滤，得到分泌物。在一个优选实施例中，上述步骤的具体过程是：用 0.22u的过滤器过滤，过滤液收集在 -20°C的条件下储存 2天，然后放到 -80°C的条件下长期保存备用。

在本发明优选实施例中，所述提取间质性干细胞的分泌物的方法进一步包括对所述分泌物进行浓缩。在一个实施例中，浓缩步骤的具体执行过程包括首先准备超滤膜：先用 75%酒精冲洗超滤膜并浸泡 lOmin; 用镊子夹住膜片边缘，拿注射用水冲洗 3遍，再放入干净容器盛装的注射用水中浸泡过夜备用。

1、将收获液加入超滤杯至工作体积，完成装配。在一个优选实施例中，上述步骤的具体过程是：按超滤杯说明书装好膜片、杯体、搅拌系统，加入收获液至工作体积，再装上杯盖、保护套。 2、接入氮气进行过滤，并收集过滤后的浓缩液。在一个优选实施例中，上述歩骤的具体过程是：接上氮气开始过滤，要注意的是在过滤开始时应缓慢地加压，有压力后再打开磁力搅拌器；过滤中氮气压力不能超过 55PSI; 过滤结束后应缓慢降压。最后，当超滤杯中的收获液浓缩至 25倍时停止浓縮，在超净台中收集浓缩液，储存到 -80°C冰箱备用。

当未采用间质性干细胞 B型培养液时，浓缩后的分泌物中含蛋白浓度为 0.2mg/ml。当采用上述第一实施的间质性干细胞 B型培养液时，浓缩后的分泌物中含蛋白浓度为 0.3mg/ml_; 当采用上述第二实施的间质性干细胞 B型培养液时，浓縮后的分泌物中含蛋白浓度为 1.5mg/ml_; 当采用上述第三实施的间质性干细胞 B型培养液时，浓缩后的分泌物中含蛋白浓度为 2mg/ml。

图 13是本发明其中一个实施例中鉴定间质性干细胞的分泌因子的示意图。胎盘间质性干细胞分泌因子产物中含有大量的蛋白分子。在胎盘间质性干细胞培养增殖过程中，胎盘间质性干细胞会分泌出许多生长因子、蛋白质、活性多肽等促进细胞生长、组织再生的物质。在该附图中，通过银染显示胎盘间质性干细胞分泌的细胞因子与对照组有显著的差异，胎盘间质性干细胞分泌物中含有大量的特有的蛋白分子。

图 14是本发明其中一个实施例中经检测发现间质性干细胞的分泌物中含有大量的细胞生长因子群和胶原蛋白分子群。利用细胞活素抗体阵列对胎盘间质性干细胞分泌因子蛋白质组进行了测评。发现了大量胎盘间质干性细胞分泌独特的基因产物.这些基因产物中含有大量与细胞生长和代谢相关的生长因子群，例如： BDNF、 EGF、 FGF、 FGF17、 FGF4、 FGF6、 FGF7、 FGF9、 GDNF、 HGF、 IGFBp、 PDGFB、 PIGF、 TGFB1、 TGFb2、 TNFRSF11B, VEGF、 IGF1 和 LEP等；以及大量的胶原蛋白分子群，例如： COLl lAl、COL12Al、COL16Al、 C0L1A、 C0L3A1、 COL4Al、 COL5A和 COL6A等。这些蛋白分子群对促进细胞的生长和代谢具有重要的作用。在该图中，经检测发现胎盘间质性干细胞分泌物中含有大量的细胞生长因子群和胶原蛋白分子群，如图中箭头所指示。

在此需要说明间质性干细胞的分泌物的功能，主要阐述其在以下几个方面的作用：表皮修复、人体美容、再生医学、保健品。

本发明还提供了一种表皮细胞修复液，包括下列重量份数的成份：水 71 % , 防腐剂 0.5%，保湿剂 3%，分泌物 5.5%，胶原蛋白 20%。其中，防腐剂可包括咪唑烷基脲 0.15 %，羟苯丙酯 0.2 %和羟苯甲酯 0.15 %，保湿剂包括丙三醇 2%和透明质酸 1 %。其中分泌物可通过前述方法来获得。

在本发明的另一实施例中，该表皮细胞修复液，包括下列重量份数的成份：水 94%，保湿剂 0.5%, 分泌物 0.5%, 胶原蛋白 5%。其中，保湿剂包括丙三醇 0.25 %和透明质酸 0.25 %。

在本发明的另一实施例中，该表皮细胞修复液，包括下列重量份数的成份: 水 88 %，咪唑烷基脲 0.1 %，羟苯丙酯 0.2 % , 羟苯甲酯 0.1 %，丙三醇 1 %，透明质酸 1 %，分泌物 2%，胶原蛋白 7.5 %。

在本发明的另一实施例中，该表皮细胞修复液，包括下列重量份数的成份: 水 50%，分泌物 25 %，胶原蛋白 25 %。

在本发明的再一实施例中，该细胞修复液，包括下列重量份数的成份：水 68.5 % , 咪唑垸基脲 0.3 %，羟苯丙酯 0.2%，丙三醇 1 %，透明质酸 1 %，分泌物 15 %，胶原蛋白 14%。

由于本发明的间质性干细胞分泌物对皮肤纤维幼细胞有显著的保护作用。在对抗过氧化氢的损伤和修复纤维幼细胞的试验中显示，将培养液加入胎盘间质性干细胞物（CM) 后能显著降低过氧化氢损伤导致的细胞死亡率，进而提高存活的纤维幼细胞的存活率。在对抗过氧化氢的损伤和修复纤维幼细胞的试验中，在培养液加入胎盘间质性干细胞分泌物后能显著降低过氧化氢损伤导致的细胞死亡率，而且随着 CM量的增加，其纤维幼细胞的存活率也明显增高（见图 15所示）。

使用本发明的表皮细胞修复液，能促进成纤维细胞、血管内皮细胞的分裂繁殖及促进细胞外基质的合成分泌，从而促进肉芽组织的生长，使窦道变浅；促进上皮细胞的分裂繁殖，从而促进创面上皮化。将其应用到烧伤创面，能促进成纤维细胞、血管内皮细胞的分裂繁殖及促进细胞外基质的合成分泌，从而促进肉芽组织的生长，使创面变浅；促进残存毛囊、汗腺及伤口周围上皮细胞的分裂繁殖，从而促进创面上皮，参见图 16所示。关于本发明的分泌物在人体美容方面的应用，说明如下：胎盘间质性干细胞分泌物的美容作用就是利用胎盘间质性干细胞分泌的因子能够增加胶原蛋白的生成量和促进皮肤纤维原细胞的生长来实现的。皮肤之所以富有弹性，主要是因为皮肤真皮层内成纤维细胞分泌的胶原蛋白形成了皮肤的支架，这种分泌物使皮肤纤维原细胞制造的胶原蛋白的体积增加数倍，同时纤维原细胞的体积增加也超过百分之三十。所以源源不断产生自体胶原蛋白，就会使皮肤真皮层的厚度和密度增加，填平皱紋、消除疤痕、恢复皮肤弹性和光泽。

通常将间质性干细胞分泌物加到化妆品的配方中，这些分泌物含有的多种活性成份，尤其是细胞生长因子群和胶原蛋白群，可促进羟脯氨酸的合成，促使胶原及胶原酶合成，分泌胶原物质、透明质酸和糖蛋白，调节胶原纤维，故具有滋润皮肤，增强皮肤弹性，减少皮肤皱紋和防止皮肤衰老的作用。本发明上述的表皮细胞修复液也可用于减少皮肤皱紋和防止皮肤衰老，其效果参见图

17所示，明显改善皮肤弹性、皮肤变紧；眼角及额头皱紋变浅，皮肤细膩柔嫩，且色素沉着有所改善。

关于分泌物在保健品方面的应用，说明如下：

目前修复受损皮肤及红血丝外露皮肤最理想的高科技口服美容品通常富含各类活性因子，如碱性纤维细胞生长因子 (FGF)和表皮生长因子 (EGF)。而胎盘间质性干细胞能分泌大量的这些生长因子，这些生长因子不仅能调节表皮细胞的分化、增殖和促进皮肤的更新，还能增加皮肤的弹性、恢复皮肤滋润。它蕴含甘草等镇静修复的成分，对角质层进行修复，此外，丰富的葡萄籽 OPC 是抗氧化、抗自由基的有效成分，它能修复细胞，强化角质修复，还能保护角质层，避免角质层氧化发黄。因此，将本发明的间质性干细胞分泌物和葡萄籽 OPC添加到一般的美容保养品中，必然会功效倍增。根据本发明的教导，本领域技术人员知悉各种将本发明的分泌物应用到现有的化妆品、保养品和药品中的方法，并能够通过这些方法获得各种所需的化妆品、保养品和药品，在此就不再累述。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

权利要求书

1、一种从人或动物胚胎提取间质性干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A.基于人或动物胚胎取样，对样品进行离心处理；

B.利用酶类消化液对样品进行消化，并制成单细胞悬液，其中所述酶类消化液包括胰酶 -EDTA和 IV型胶原酶；

C.在分离的单细胞中加入间质性干细胞 A型培养液，进行细胞接种并培养；

D.对细胞进行贴壁纯化处理，并通过磁珠分选得到间质性干细胞。
2、根据权利要求 1所述的从人或动物胚胎提取间质性干细胞的方法，其特征在于，所述步骤 B中的酶类消化液包括：

胰蛋白酶 0.125g/L〜0.375g/L;

EDTA 0.075g/L~0.125g/L_; 和

IV胶原酶 0.25g//L~0.75 g〃L。
3、根据权利要求 2所述的从人或动物胚胎提取间质性干细胞的方法，其特征在于，所述步骤 B中的酶类消化液的制备包括：

将 100ml含 0.05g胰蛋白酶和 0.02gEDTA -4Na的 D-HBSS与 lOOmml含 O.OlglV胶原酶的生理盐水按照 1 : 1的体积比混合。
4、根据权利要求 1所述的从人或动物胚胎提取间质性干细胞的方法，其特征在于，所述间质性干细胞 A型培养液包括：

碱性成纤维细胞生长因子 1 ng/ml〜100 ng/ml基质

表皮生长因子 1 ng/ml〜100 ng/ml基质

血小板衍生生长因子 1 ng/ml〜100 ng/ml基质

其中，所述基质包括下列重量份数的成份：

DMEM培养基 68%~97%

脐带血血浆 1%〜30%

抗生素和谷氨酰胺 1 %

非必须氨基酸 1 %

抗氧化剂 0〜0.1 %。
5、根据权利要求 4所述的从人或动物胚胎提取间质性干细胞的方法，其特征在于，所述步骤 D中的贴壁纯化处理包括：

用移液管将未贴壁的细胞吸出，加入生理盐水清洗并换上新的间质性干细胞 A型培养液继续培养，待贴壁细胞扩增到培养瓶的设定容积时用胰酶 -EDTA 消化，获得单细胞悬液。 6、根据权利要求 5所述的从人或动物胚胎提取间质性干细胞的方法，其特征在于，所述步骤 D中的磁珠分选包括：

采用免疫磁珠分离法，从所述单细胞中筛选出 CD271和 CD73双阳性的细胞群，即从胚胎分离出的间质性干细胞。
7、根据权利要求 1-6中任一权利要求所述的从人或动物胚胎提取间质性干细胞的方法，其特征在于，所述步骤 D之后还包括：

E.将所得的间质性干细胞进行增殖和传代；和 /或

F.提取出间质性干细胞的分泌物。
8、根据权利要求 7所述的从人或动物胚胎提取间质性干细胞的方法，其特征在于，所述步骤 F包括：

F1.利用酶类消化液对间质性干细胞进行消化处理；

F2.在收集的细胞中加入培养基进行接种培养，并加入间质性干细胞 B型培养液促进细胞产生分泌因子；

F3.对收集到的培养液离心过滤，得到分泌物。
9、根据权利要求 8所述的从人或动物胚胎提取间质性干细胞的方法，其特征在于，所述间质性干细胞 B型培养液中包括碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子。
10、一种提取间质性干细胞的分泌物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

Α'.利用酶类消化液对间质性干细胞进行消化处理；

Β'.在收集的单细胞中加入培养基进行接种培养，并加入间质性干细胞 Β 型培养液促进细胞产生分泌因子；

C'.对收集到的培养液离心过滤，得到分泌物。
11、根据权利要求 10所述的提取间质性干细胞的分泌物的方法，其特征在于，所述歩骤 A'进一步包括

A' l.利用 lOOmL含 0.05g胰蛋白酶和 0.02_gEDTA · 4Na的消化液对间质性干细胞进行消化处理；

A'2.当间质性干细胞变圆脱落时，用含有牛血清的 1640培养液终止消化。
12、根据权利要求 10所述的提取间质性干细胞的分泌物的方法，其特征在于，所述间质性干细胞 B型培养液包括：

碱性成纤维细胞生长因子 1 ng/ml〜100 ng/ml基质

血小板衍生生长因子 1 ng/ml~100 ng/ml基质

其中，所述基质由下列重量份数的原料配制成：

DMEM培养基 96.9%

丙酮酸钠 1% 保胶溶分防抗生素和谷氨酰胺 1 %

腐湿剂泌原、非必须氨基酸 1 %

物抗剂剂蛋氧化剂 0.1 %
13、根据权利要求 12所述的提取间质性干细胞的分泌物的方法，其特征在于，所述步骤 B'中加入间质性干细胞 B型培养液促进细胞产生分泌因子的步骤包括：当培养瓶中的细胞层扩增至设定容积时，吸出培养液并用磷酸盐缓冲液清洗；然后加入间质性干细胞 B型培养液，刺激间质性干细胞产生分泌因子。
14、根据权利要求 10所述的提取间质性干细胞的分泌物的方法，其特征在于，所述歩骤 B'中加入培养基进行接种培养的步骤包括：

在分离的单细胞中加入间质性干细胞培养基，摇匀并调整到 5~8 X 10⁴个细胞 /ml的细胞密度；

将调整后的细胞溶液接种到多个培养瓶中，置于 5〜10%CO₂、 37°C、饱和湿度的培养箱中培养。
15、根据权利要求 10-14中任一权利要求所述方法产生的分泌物。
16、根据权利要求 15产生的分泌物在人体美容方面的应用。
17、根据权利要求 15产生的分泌物在保健品方面的应用。

种表皮细胞修复液，其特征在于，包括下列重量份数的成份：

50-94%

0〜0.5%

0-3%

0.5-25%

白 5〜25%。