CN113321709A - 自组装多肽、缓释外泌体多肽水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
自组装多肽、缓释外泌体多肽水凝胶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种自组装多肽、缓释外泌体多肽水凝胶及其制备方法和应用，自组装多肽的氨基酸序列为KLDLKLDLGPLGMRGLDL KLDLKLDL(SEQ ID NO：1)。缓释外泌体多肽水凝胶由自组装多肽、无菌蒸馏水和外泌体混合制备。缓释外泌体多肽水凝胶的原料组成包括外泌体150～250重量份、自组装多肽200～400重量份，加无菌蒸馏水至40～60体积份。缓释外泌体多肽水凝胶能够治疗骨关节炎，缓释外泌体多肽水凝胶中的外泌体能够在多肽水凝胶的作用下缓慢释放，半衰期长，从而延长并提升外泌体治疗骨关节炎的疗效。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种自组装多肽、缓释外泌体多肽水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
骨关节炎是涉及退化关节的慢性关节炎性疾病，具有高发病率，高致残率，难治愈性的特点。传统治疗与药物治疗是早期骨关节炎的首选治疗措施，但都只能帮助缓解症状，但不能阻止疾病的发展。而随着疾病的进展，后期患者关节骨质增生明显，并伴有关节间隙重度的狭窄，关节畸形等，此时需要手术治疗。但是长期的药物治疗和手术带来的副作用会加剧患者的痛苦。
MMP-13是基质金属蛋白酶家族MMPs中的一员，是一种能够特异性地降解胶原分子中三维螺旋结构的酶，在所有基质蛋白酶中对于H型胶原的降解效率是最高的，骨关节炎患者关节腔中MMP-13的活性较正常人显著增加。
外泌体是一类粒径为50-150nm的细胞外囊泡，所有细胞都会分泌外泌体，其含有核酸、蛋白、脂质。外泌体主要参与物质运输和细胞间信号传递。间充质干细胞发挥的组织修复作用是由其外泌体介导的旁分泌机制而实现的，单用外泌体与使用间充质干细胞进行治疗两者疗效相似。而间充质干细胞衍生的外泌体在各种生理条件下比干细胞本身更加稳定，并且无免疫原性，非常适合用于无细胞治疗干预。
目前，外泌体在治疗骨关节炎方面已将显示出巨大潜能，且在治疗过程中对患者造成的痛苦小，但是外泌体在体内代谢较快，容易被巨噬细胞吞噬，丧失作用。
因此，针对现有技术不足，提供一种自组装多肽、缓释外泌体多肽水凝胶及其制备方法和应用以克服现有技术不足甚为必要。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种自组装多肽，能够被MMP13特异性降解，制备出MMP13敏感型缓释多肽水凝胶。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现。
提供一种自组装多肽，氨基酸序列为
KLDLKLDLGPLGMRGLDL KLDLKLDL(SEQ ID NO：1)。
本发明的第二个目的在于提供一种缓释外泌体多肽水凝胶，多肽水凝胶包裹外泌体构建出智能药物释放系统，多肽水凝胶内包含的外泌体能够缓慢释放。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现。
提供一种缓释外泌体多肽水凝胶，由上述的自组装多肽、无菌蒸馏水和外泌体混合制备。
优选的，原料组成包括外泌体150～250重量份、自组装多肽200～400重量份，加无菌蒸馏水至40～60体积份。
优选的，原料组成包括外泌体180～230重量份、自组装多肽230～300重量份，加无菌蒸馏水至45～55体积份。
优选的，原料组成包括外泌体200重量份，自组装多肽250重量份，加无菌蒸馏水至50体积份。
优选的，所述的外泌体来源于间充质干细胞；
所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或者胎盘间充质干细胞。
本发明的第三个目的在于提供一种缓释外泌体多肽水凝胶的制备方法，过程简单方便。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现。
提供一种缓释外泌体多肽水凝胶的制备方法，用于制备上述缓释外泌体多肽水凝胶。
优选的，包括以下步骤：
S1：将200～400重量份的自组装多肽溶于20～30体积份的无菌蒸馏水中，配置成自组装多肽水溶液；
S2：将150～250重量份的外泌体溶于16～24体积份的无菌蒸馏水中，配置成外泌体水溶液；
S3：将外泌体水溶液与自组装多肽水溶液混合并添加4～6体积份的水，混合均匀后获得缓释外泌体多肽水凝胶。
优选的，包括以下步骤：
S1：将250重量份的自组装多肽溶于25体积份的无菌蒸馏水中，配置成自组装多肽水溶液；
S2：将200重量份的外泌体溶于20体积份的无菌蒸馏水中，配置成外泌体水溶液；
S3：将外泌体水溶液与自组装多肽水溶液混合并添加5体积份的水，混合均匀后获得缓释外泌体多肽水凝胶。
本发明的第四个目的在于提供上述缓释外泌体多肽水凝胶作为制备治疗骨关节炎药物的应用。
本发明的自组装多肽能够被MMP13特异性降解，制备出MMP13敏感型缓释多肽水凝胶。缓释多肽水凝胶包裹外泌体制备出的缓释外泌体多肽水凝胶可以用于治疗骨关节炎，且制备过程简单方便。缓释外泌体多肽水凝胶是一种智能药物释放系统，缓释外泌体多肽水凝胶的缓释多肽水凝胶在骨关节炎患者关节腔中MMP-13酶的响应下能有效减缓外泌体的释放，延长其半衰期，并且释放的外泌体具有与新分离的外泌体相似的活性，能改善骨关节炎关节腔内炎症状况、减少炎症因子表达量，降低炎症因子造成的软骨细胞损伤，进而促进软骨组织的再生，及软骨基质合成分泌，达到修复骨关节炎软骨组织缺损的目的，临床应用前景良好。
附图说明
利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1是本发明的缓释外泌体多肽水凝胶的成胶效果图。
图2是本发明的缓释外泌体多肽水凝胶MMP13酶降解检测结果示意图。
图3是本发明的缓释外泌体多肽水凝胶的质谱鉴定结果示意图。
图4是本发明的缓释外泌体多肽水凝胶的HPLC鉴定结果示意图。
图5是本发明的缓释外泌体多肽水凝胶的生物相容性实验结果示意图。
图6是实施例6中的外泌体在透射电镜下的结构示意图。
图7是实施例6中的通过Westernblot检测外泌体标志蛋白ALIX、CD9和CD63的结果示意图。
图8是实施例6用纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径频度分布的检测结果示意图。
图9是实施例7中外泌体的细胞摄取实验结果示意图。
图10是本发明的缓释外泌体多肽水凝胶对外泌体的体外释放实验结果示意图。
图11是实施例9中实验组和对照组的Ⅱ型胶原蛋白mRNA相对表达量示意图。
图12是实施例9中实验组和对照组的SOX9 mRNA相对表达量示意图。
图13是实施例9中实验组和对照组的软骨蛋白聚糖mRNA相对表达量示意图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：缓释外泌体多肽水凝胶的制备
本实施例中的缓释外泌体多肽水凝胶，根据预实验结果(治疗效果)及实验动物(SD大鼠)及施用部位(大鼠膝关节)确定缓释体系如下表所示：
表1缓释外泌体多肽水凝胶的缓释体系
其中，自组装多肽KLDL-MMP13(KLDLKLDLGPLGMRGLDLKLDLKLDL)由上海波泰生物科技合成纯化。
本实施例的缓释外泌体多肽水凝胶的制备过程如下：
(1)将250μg自组装多肽干粉溶解于25μl去离子水中，配制成10mg/ml的原液，取25μl加入1.5ml的EP管中；(2)取20μl浓度为10mg/ml的间充质干细胞来源的Exos加入EP管中，混匀。(3)加入5μl无菌蒸馏水，总共50ul溶液，吹打混匀获得本发明缓释外泌体多肽水凝胶，外泌体水溶液被包封在自组装多肽水溶液中。自组装多肽水凝胶成胶效果如图1所示。
本发明的缓释外泌体多肽水凝胶能有效减缓外泌体的释放，延长其半衰期，并且释放的外泌体具有与新分离的外泌体相似的活性，能降低炎症因子造成的软骨细胞损伤，促进软骨组织的再生。还通过改善骨关节炎关节腔内炎症状况、减少炎症因子表达量、进而促进软骨细胞再生及软骨基质合成分泌，达到修复骨关节炎软骨组织缺损的目的，临床应用前景良好。
实施例2：缓释外泌体多肽水凝胶的酶降解
将6份0.5g实施例1所制备的缓释外泌体多肽水凝胶分别置入6个预先称重的样品瓶，并将其均分为2个组。然后往1组各样品瓶中加入500μl的模拟体液(SPF)，2组各样品瓶中加入500μl的4mg/ml MMP13，在37℃摇床上孵育。分别在1d，7d，14d，21d更换一次新鲜的溶液，并记录水凝胶的重量。计算公式为凝胶质量(％)＝(水凝胶在各个时间点的湿重-降解前的初始湿重)/水凝胶在各个时间点的湿重×100。本实施例中的缓释外泌体多肽水凝胶酶降解趋势如图2所示。
实施例3：自组装多肽的质量分数与纯度鉴定
(1)质谱鉴定自组装多肽的方法
a，MS的自组装多肽样品溶解处理：先用甲酸溶解样品，再用纯水稀释到约1mg/ml。
b，离子化的方法：采用的是电喷雾离子化，样品流份经一毛细管，流出毛细管的瞬间在雾化气N2的作用下雾化。在所加的高电压(<5KV)作用下，由极性样品生成的原始液滴在外加电场的作用下，含有的两种极性的离子。带电液滴在电场作用下迅速移动，伴随大气压下溶剂的迅速蒸发，液滴体积缩小，而离子移向液滴表面，自身电场强度增大。当达到临界电场时，液滴表面电场排斥力大于维持液滴的表面张力，产生库仑爆炸，此过程反复进行，最终使样品离子解析出来，并在电场作用下被引入质谱检测器。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱证实了自组装多肽的成功合成。自组装多肽的质谱分析图如图3所示，分析结果如表2所示。
表2自组装多肽的质谱分析结果
自组装多肽的质谱分析
(2)HPLC鉴定自组装多肽的纯度
a，HPLC样品溶解处理：先用甲酸溶解样品，再用纯水稀释到约1mg/ml。
b，HPLC：其中PumpA为0.065％三氟乙酸的水溶液，PumpB为0.05％的三氟乙酸的乙腈溶液，流速为1ml/min，检测波长为220nm。自组装多肽的HPLC鉴定结果如图4所示。结果表明合成的两条多肽序列分子量符合预期，且纯度>95％，可进行后续实验。
实施例4：自组装多肽的细胞生物相容性实验
本实施例中，选用人软骨细胞作为细胞生物相容性实验的细胞模型。样品组处理过程为：将软骨细胞(3×104/ml)重悬于含有自组装多肽(5000μg/mL)的培养液中，每孔50ul种植在96孔板中，待凝胶成型后每孔加入50ul新鲜培养基，置于37℃的恒温培养箱中分别培养24小时、48小时和72小时。对照组软骨细胞(1.5×104/ml)每孔100ul种植在96孔板中，置于37℃的恒温培养箱中分别培养24小时、48小时和72小时。培养期间，两种处理的细胞每天更换一次培养液,每次100μl。达到培养时间后，弃去原有培养基，加入100μl新鲜培养基，再分别向每个孔中加入10μl MTT染色剂并于37℃恒温培养箱中温育4小时。再向每个孔中添加100μl SDS-HCl溶液并置于37℃恒温培养箱中温育4小时，细胞染色结束后，使用移液器再次混合每个样品，并在570nm处读取吸光度，利用酶标仪读取其吸光度值。实验中所测细胞的活性用实验的样品组与未处理的对照组的细胞活性百分比表示。其中，未处理的对照组细胞活性设为100％。所有样品都设有至少5个平行试验组且该实验至少重复三次。
本实施例的生物相容性实验结果如图5所示，软骨细胞与自组装缓释外泌体多肽水凝胶共培养24小时、48小时和72小时后，细胞存活率均高于90％。该实验结果表明自组装缓释外泌体多肽水凝胶具有良好的细胞生物相容性。
实施例5：外泌体的制备
外泌体来源于间充质干细胞，间充质干细胞可以为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或者胎盘间充质干细胞。本实施例中，外泌体具体来源于髌下脂肪垫间充质干细胞，外泌体的制备过程如下：
(1)髌下脂肪垫间充质干细胞原代培养：取手术后废弃的髌下脂肪垫组织，放入无菌离心管，然后倒入无菌培养皿中，75％酒精浸泡，无菌DPBS清洗，剔除筋膜及血管后剪碎成糊状，以0.1％Ⅰ型胶原酶37℃震荡消化，吹打后使用100-150目筛网滤过，收集滤液，300g离心5min，弃上清，重悬沉淀，采用贴壁法获得间充质干细胞。
(2)培养基收集：
采用添加10％无外泌体胎牛血清(Exosome-depletedFBS，美国SBI公司)的DMEM/F12培养基(美国Gbico公司)培养间充质干细胞，定期收集培养上清。
(3)离心提取：采用差速离心方法提取外泌体：300g×10分钟离心去除活细胞，2000g×10分钟离心去除死细胞，10000g×30分钟离心去除细胞碎片，100000g×70分钟离心获得外泌体。获得的外泌体用DPBS清洗一次，再次100000g×70分钟离心获得纯净的外泌体，置于-80℃冰箱备用。
实施例6：外泌体的鉴定
本实施例中，使用透射电子显微镜鉴定外泌体形态，将实施例5提取的外泌体滴于200目的样品网上，室温静止2min，用滤纸吸干多余液体；在样品网上滴加20mg/mL醋酸铀溶液，室温静置1min，对样品进行负染，用滤纸吸干多余液体，并将样品网晾干；将制备好的样品置于透射电镜下观察，并采集照片。如图6所示，外泌体为杯状囊泡样结构，直径约为90-150nm左右。
通过Westernblot检测外泌体标志蛋白ALIX、CD9和CD63，检测结果如图7所示。
(1)蛋白样品制备：将超速离心后得到的外泌体沉淀中加入RIPA裂解液裂解外泌体，反复吹打后移入洁净1.5mLEP管中，在冰上裂解30min，每10min涡旋振荡一次，于4℃，12000rpm离心15min，将上清移入新的EP管中；使用BCA法测定外泌体蛋白浓度，其余蛋白液中加入5×上样缓冲液，在沸水中煮10min，保存于-80℃冰箱中备用。
(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳：将洁净晾干的玻璃板装于制胶架上，使底边吻合严密，用蒸馏水验漏。按照分离胶配方配制10％的分离胶溶液，充分混匀，用移液器加入4.5ml分离胶溶液至玻璃板缝隙中，立即轻柔加入蒸馏水将分离胶液面压平，约20min后分离胶凝固。按照配方配制5％的浓缩胶溶液，灌注1.5ml浓缩胶溶液到分离胶的上方，立即插入梳子，待浓缩胶凝固后便可使用。将配好的胶板放置到电泳槽内，注意短玻板向内侧，在两块玻板中间加入电泳液，将梳子拔出，按照测定蛋白浓度统一上样量，将蛋白样品加入上样孔中，添加电泳液至电泳槽标记处，盖好电泳槽盖，注意连接正负极，90V开始电泳，待溴酚蓝跑至分离胶时，将电压调至120V，直至溴酚蓝接近玻板底部时停止电泳。
(3)转膜：将转膜夹与海绵及滤纸浸泡于预冷的转膜缓冲液中，把聚丙烯酰胺凝胶
置于黑色夹板一侧，剪取适宜大小的PVDF膜，置于甲醇中活化60s，放置于胶上，除尽气泡，覆盖滤纸和海绵，按照转膜夹负极(黑色)-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵-正极(白色)顺序夹好转膜夹，放置于转膜槽中，添加转膜液，冰浴恒压120V转膜2h。
(4)封闭：将转膜完成的PVDF膜取出，用TBST溶液洗尽凝胶残渣，置于5％的脱脂牛奶(封闭液)中，水平摇床100rpm室温封闭1h。
(5)抗体杂交：①一抗孵育：用封闭液按照说明书稀释一抗(ALIX，1:1000稀释，CD9，1：1000稀释，CD63，1:1000稀释)，吸取2ml一抗置于抗体孵育盒中，对照蛋白Marker将目的条带剪下，浸泡于对应一抗中，4℃孵育过夜；②二抗孵育：将条带用TBST溶液清洗3次，每次5min，然后加入对应二抗，水平摇床100rpm室温孵育2h，孵育完成后用TBST洗3次，每次5min。
(6)发光检测：把发光液A/B按1:1比例进行混合配成工作液，在暗室中将发光液滴加在膜上，待目的条带发出绿色荧光时，用胶片进行曝光、显影及定影。
用纳米颗粒跟踪分析仪检测所提取外泌体粒径频度分布:将上述分离提取的外泌体稀释至1mg/ml，用0.22μm滤菌器过滤，在纳米颗粒跟踪分析仪样品池中加入100μl外泌体溶液进行检测，检测结果以粒径频度分布来表示。检测结果如图8所示，结果显示外泌体平均直径约为150nm。
实施例7：外泌体的细胞摄取实验
配置含有Pkh26标记的Exos(1μg/μl)的DMEM完全培养基，将外泌体与软骨细胞混培养6h、12h、24h、48h、72h、96h，弃去培养基，DPBS清洗2-3遍，使用4％多聚甲醛固定细胞，再用DPBS清洗2-3遍，DAPI染色5min，荧光显微镜下观测Exos被细胞摄取情况并拍照。
将PKH26标记的外泌体加入软骨细胞中培养后。如图9所示，可见大量荧光标记(图中灰白色)外泌体在胞浆中聚集，提示外泌体可被软骨细胞所摄取。
实施例8：缓释外泌体多肽水凝胶对外泌体的体外释放实验
将10μl浓度为1μg/μl的含有Pkh26标记的外泌体与50μl自组装缓释外泌体多肽水凝胶轻轻混匀，置于EP管底部，离心去除气泡后，37℃孵育10分钟；在管上部加入150μlDPBS，放入37℃孵箱中，在1d、4d、7d、14d、21d、28d收集上清100μl，每次收集后再加入PBS(100μl)；收集的上清样品放入4℃待统一检测。使用酶标仪读取OD值进行计算。体外释放曲线如图10所示，包裹于自组装凝胶中的外泌体释放速度较为较慢，直到第28天仍然有外泌体的释放。
从上述结果可知，本发明水凝胶能有效减缓外泌体在体外释放，具有延长外泌体半衰期的作用。
实施例9：缓释外泌体多肽水凝胶对于外泌体促进软骨修复的验证实验
实时荧光定量PCR实验:为了评价自组装多肽水凝胶缓释外泌体治疗骨关节炎的效果，通过MIA关节腔注射构建SD大鼠骨关节炎模型，将SD大鼠分为对照组与实验组，其中实验组给予关节腔注射实施例1自组装多肽溶液治疗。于给药后120h处死大鼠，收集大鼠关节软骨。软骨组织提取RNA，qPCR检测软骨相关蛋白RNA表达水平。
使用TRIzol法提取大鼠软骨组织内总RNA，通过反转录PCR法获得cDNA后，再使用Real-time PCR对软骨形成相关基因进行RNA水平的检测。实验结果中如图11、12和13所示，实验组的Ⅱ型胶原蛋白mRNA、SOX9 mRNA和软骨蛋白聚糖mRNA的相对表达量均比对照组高，表明被酶响应自组装多肽水凝胶包裹并缓释的干细胞来源的外泌体，可以更好的促进软骨形成相关基因的表达。
实施例10
一种自组装多肽，氨基酸序列为KLDLKLDLGPLGMRGLDL KLDLKLDL(SEQ ID NO：1)。该自组装多肽能够被骨关节炎患者关节腔中MMP-13酶酶解。
实施例11
一种缓释外泌体多肽水凝胶，原料组成包括外泌体150～250重量份、自组装多肽200～400重量份，加无菌蒸馏水至40～60体积份。该缓释外泌体多肽水凝胶的缓释多肽水凝胶在骨关节炎患者关节腔中MMP-13酶的响应下能有效减缓外泌体的释放，延长其半衰期，并且释放的外泌体具有与新分离的外泌体相似的活性，能改善骨关节炎关节腔内炎症状况、减少炎症因子表达量，降低炎症因子造成的软骨细胞损伤，进而促进软骨组织的再生，及软骨基质合成分泌，达到修复骨关节炎软骨组织缺损的目的，临床应用前景良好。
实施例12
一种缓释外泌体多肽水凝胶的制备方法，用于制备缓释外泌体多肽水凝胶，包括以下步骤：
S1：将200～400重量份的自组装多肽溶于20～30体积份的无菌蒸馏水中，配置成自组装多肽水溶液；
S2：将150～250重量份的外泌体溶于16～24体积份的无菌蒸馏水中，配置成外泌体水溶液；
S3：将外泌体水溶液与自组装多肽水溶液混合并添加4～6体积份的水，混合均匀后获得缓释外泌体多肽水凝胶。
该缓释外泌体多肽水凝胶的制备方法，简单方便，制备出的缓释外泌体多肽水凝胶能有效治疗骨关节炎。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 南方医科大学
<120> 自组装多肽、缓释外泌体多肽水凝胶及其制备方法和应用
<130> GZZRH0504-21-1-1227
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu Gly Pro Leu Gly Met Arg Gly Leu
1 5 10 15
Asp Leu Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu
20 25
Claims (10)
1.一种自组装多肽，其特征在于：氨基酸序列为
KLDLKLDLGPLGMRGLDL KLDLKLDL(SEQ ID NO：1)。
2.一种缓释外泌体多肽水凝胶，其特征在于：由权利要求1所述的自组装多肽、无菌蒸馏水和外泌体混合制备。
3.根据权利要求2所述的缓释外泌体多肽水凝胶，其特征在于：原料组成包括外泌体150～250重量份、自组装多肽200～400重量份，加无菌蒸馏水至40～60体积份。
4.根据权利要求2所述的缓释外泌体多肽水凝胶，其特征在于：原料组成包括外泌体180～230重量份、自组装多肽230～300重量份，加无菌蒸馏水至45～55体积份。
5.根据权利要求2所述的缓释外泌体多肽水凝胶，其特征在于：原料组成包括外泌体200重量份，自组装多肽250重量份，加无菌蒸馏水至50体积份。
6.根据权利要求2所述的缓释外泌体多肽水凝胶，其特征在于：所述的外泌体来源于间充质干细胞；
所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或者胎盘间充质干细胞。
7.一种缓释外泌体多肽水凝胶的制备方法，其特征在于：用于制备如权利要求2至6任意一项所述的缓释外泌体多肽水凝胶。
8.根据权利要求7所述的缓释外泌体多肽水凝胶的制备方法其特征在于：包括以下步骤：
S1：将200～400重量份的自组装多肽溶于20～30体积份的无菌蒸馏水中，配置成自组装多肽水溶液；
S2：将150～250重量份的外泌体溶于16～24体积份的无菌蒸馏水中，配置成外泌体水溶液；
S3：将外泌体水溶液与自组装多肽水溶液混合并添加4～6体积份的水，混合均匀后获得缓释外泌体多肽水凝胶。
9.根据权利要求7所述的缓释外泌体多肽水凝胶的制备方法其特征在于：包括以下步骤：
S1：将250重量份的自组装多肽溶于25体积份的无菌蒸馏水中，配置成自组装多肽水溶液；
S2：将200重量份的外泌体溶于20体积份的无菌蒸馏水中，配置成外泌体水溶液；
S3：将外泌体水溶液与自组装多肽水溶液混合并添加5体积份的水，混合均匀后获得缓释外泌体多肽水凝胶。
10.如权利要求2至6任意一项所述的缓释外泌体多肽水凝胶作为制备治疗骨关节炎药物的应用。
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