CN115137694A - 一种用于脊髓损伤的水凝胶材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于再生医学技术领域，具体涉及用于一种用于脊髓损伤的水凝胶材料及其制备方法和应用。本发明以N‑丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土、单宁酸和小细胞外囊泡作为制备用于脊髓损伤的水凝胶材料的原料，单宁酸对损伤具有保护作用，尤其可以减轻炎症反应和改善氧化损伤，利用N‑丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶和纳米粘土负载单宁酸，能使单宁酸有效作用于脊髓部分；水凝胶具有运载及缓释小细胞外囊泡的作用，既能提高具有神经保护功能的小细胞外囊泡在组织内的驻留时间，提高小细胞外囊泡修复脊髓的疗效，又能抑制脊髓损伤后局部的氧化应激微环境，改善脊髓损伤微环境，进一步提高脊髓损伤的修复效果。

Description

一种用于脊髓损伤的水凝胶材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于再生医学技术领域，具体涉及一种用于脊髓损伤的水凝胶材料及其制备方法和应用。
背景技术
脊髓损伤会导致严重的神经功能障碍，包括瘫痪、大小便失禁和慢性疼痛，进而给患者的家庭和社会带来了巨大的负担。脊髓损伤的病理生理学特征是最初的原发损伤和继发的可治疗的继发性损伤。紧急手术减压结合皮质类固醇治疗继发性的损伤已被广泛应用，旨在挽救神经功能，但是脊髓损伤患者的总体治疗结果仍然很差，需要更有效的治疗方法。
继发性脊髓损伤会引起电解质异常、活性氧升高和兴奋性氨基酸的释放，进而导致损伤部位的缺血、水肿、细胞坏死和细胞凋亡。其中，自由基诱导的氧化应激可导致脊髓神经元、神经胶质细胞和微血管细胞的损伤；因此，这些有害条件被认为是继发性脊髓损伤的病理生理学的标志。此外，氧化应激可激活中性粒细胞合成致炎细胞因子，从而在继发性脊髓损伤中发挥有害作用。因此，改善脊髓损伤微环境，靶向抑制炎症反应和氧化应激可能成为继发性脊髓损伤治疗干预的有效手段。
近年来，间充质干细胞来源的小细胞外囊泡在脊髓损伤治疗中受到广泛关注。小细胞外囊泡是由多种免疫原性低、纳米大小的细胞分泌的纳米囊泡组成，其能够通过脑脊髓屏障发挥显著的治疗作用。研究证实了小细胞外囊泡对脊髓损伤的神经保护作用，其中包括神经营养、抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。这些发现表明，小细胞外囊泡在脊髓损伤治疗中具有巨大的潜力。然而，小细胞外囊泡不能直接针对损伤部位实现持续释放，且游离小细胞外囊泡不能长时间保留。因此，开发一种联合小细胞外囊泡，保证小细胞外囊泡持续释放，提高脊髓修复效果的水凝胶材料至关重要。
发明内容
本发明的目的提供一种用于脊髓损伤的水凝胶材料及其制备方法和应用，弥补现有技术的不足，运载及缓释小细胞外囊泡，抑制脊髓损伤后局部的氧化应激微环境，提高脊髓损伤的修复效果。
本发明提供了一种用于脊髓损伤的水凝胶材料，包括水凝胶和小细胞外囊泡；
所述水凝胶包括如下原料：N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和单宁酸。
优选的，所述N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶和纳米粘土的质量比为25：2：5。
本发明还提供了上述技术方案所述的水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：
将N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和水混合，利用光交联法生成第一水凝胶；
将第一水凝胶与单宁酸混合，得到所述水凝胶；
将所述水凝胶与所述小细胞外囊泡混合，孵育，得到所述水凝胶材料。
优选的，所述N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和水的混合物中，N-丙烯酰基甘氨酰胺的质量浓度为25％、甲基丙烯酸酰化明胶质量浓度为2％，纳米粘土质量浓度为5％。
优选的，所述第一水凝胶与单宁酸的混合物中单宁酸的质量浓度为5％。
优选的，所述光交联法包括：将所述N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和水的混合物与光起始剂混合，交联40min。
优选的，所述第一水凝胶与单宁酸混合的时间为24h。
优选的，所述孵育包括37℃孵育1h后4℃孵育24h。
本发明还提供了上述技术方案所述的水凝胶材料在下述a)～e)中任意一种中的应用：
a)制备治疗脊髓损伤的产品；
b)制备促进神经再生的产品；
c)制备促进脊髓损伤后运动功能的恢复的产品；
d)制备改善脊髓损伤微环境的产品；
e)制备提高脊髓损伤修复效果的产品。
本发明提供了一种用于脊髓损伤的水凝胶材料，包括水凝胶和小细胞外囊泡；所述水凝胶包括如下原料：N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和单宁酸。本发明单宁酸对损伤具有保护作用，尤其可以减轻炎症反应和改善氧化损伤，利用N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶和纳米粘土负载单宁酸，能使单宁酸有效作用于脊髓部分，并且生物相容性好，具备适宜的柔韧度，能承受脊髓周围组织带来的重复压缩力作用而不产生明显形变，并且不会对脊髓周围的组织产生挤压，提高脊髓损伤的修复效果；得到的水凝胶材料具有运载及缓释小细胞外囊泡的作用，既能提高具有神经保护功能的小细胞外囊泡在组织内的驻留时间，提高小细胞外囊泡修复脊髓的疗效，又能抑制脊髓损伤后局部的氧化应激微环境，改善脊髓损伤微环境，进一步提高脊髓损伤的修复效果。
进一步的，本发明通过限定N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和单宁酸的比例，能够最大化的提高水凝胶的机械性能和溶胀性能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡透射电镜图，图中标尺：200nm；
图2为人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡NTA检测粒径分布结果；
图3为人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡Western Blot结果；
图4为实施例3得到的NGL/T水凝胶的表征图，图中标尺：20μm；
图5为实施例3得到的NGL/T水凝胶的降解性能检测图；
图6为实施例3得到的NGL/T水凝胶的溶胀性能检测图；
图7为小细胞外囊泡体外缓释图，其中A为实施例3得到的sEVs-NGL/T中sEVs日释放曲线，B为实施例3得到的sEVs-NGL/T中sEVs累计释放曲线图；
图8为激光共聚焦显微镜检测小细胞外囊泡在NGL/T水凝胶中的黏附和分布，图中标尺：10μm。
图9为脊髓损伤大鼠植入实施例3得到的sEVs-NGL/T后运动功能评分图；
图10为脊髓损伤大鼠术后56天的脊髓组织HE染色结果；
图11为脊髓损伤大鼠术后56天定量分析脊髓损伤后空洞面积统计图，图中标尺：500μm；
图12植入7天实施例3得到的sEVs-NGL/T后，脊髓组织免疫荧光染色评估sEVs-NGL/T水凝胶的体内抗氧化功能，其中A为4-HNE的表达情况，B为8-OhdG的表达情况，图中标尺：100μm；
图13为假手术组大鼠和治疗组大鼠的主要器官HE染色结果，图中标尺：100μm。
具体实施方式
本发明提供了一种用于脊髓损伤的水凝胶材料，包括水凝胶(记为NGL/T水凝胶)和小细胞外囊泡；所述水凝胶包括如下原料：N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和单宁酸。
在本发明中，所述N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶和纳米粘土的质量比优选为25：2：5；所述N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和单宁酸的质量比优选为25：2：5：40。本发明通过限定N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶和纳米粘土的比例，能够最大化的提高水凝胶的机械性能和溶胀性能。
本发明单宁酸对损伤具有保护作用，尤其可以减轻炎症反应和改善氧化损伤，利用所述N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶和纳米粘土搭载单宁酸制备得到的水凝胶具有能使单宁酸有效作用于脊髓部分，并且生物相容性好，具备适宜的柔韧度，能承受脊髓周围组织带来的重复压缩力作用而不产生明显形变，并且不会对脊髓周围的组织产生挤压，提高脊髓损伤的修复效果；所述用于脊髓损伤的水凝胶材料通过运载及缓释小细胞外囊泡，既能提高具有神经保护功能的小细胞外囊泡在组织内的驻留时间，提高小细胞外囊泡修复脊髓的疗效，又能直接改善脊髓损伤微环境，进一步提高脊髓损伤的修复效果，为脊髓损伤的治疗提供了一种有前景的策略。
本发明还提供了上述技术方案所述水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：
将N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和水混合，利用光交联法生成第一水凝胶；
将所述第一水凝胶与单宁酸混合，得到用于脊髓损伤的水凝胶；
将所述水凝胶与所述小细胞外囊泡混合，孵育，得到所述水凝胶材料。
本发明将N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和水混合，得到第一混合物。本发明所述第一混合物中所述N-丙烯酰基甘氨酰胺的质量浓度优选为25％；所述甲基丙烯酸酰化明胶质量浓度优选为2％；所述纳米粘土质量浓度优选为5％。
得到所述第一混合物后，本发明优选对所述第一混合物进行光交联反应，得到第一水凝胶(记为NGL水凝胶)。本发明所述光交联反应优选包括：将所述第一混合物与光起始剂混合，交联40min。本发明对所述混合时的温度没有严格要求，室温操作即可。本发明所述光起始剂与所述第一混合物的质量比优选为1：100；所述光起始剂优选包括光起始剂-1173。本发明所述光交联反应优选使用塑料模具。本发明得到的第一水凝胶溶胀性小，可降解，硬度类似脊髓组织。
得到所述第一水凝胶后，本发明优选将所述第一水凝胶与单宁酸混合，得到所述水凝胶。本发明对所述第一水凝胶与所述单宁酸的体积比没有严格要求，常规操作即可；所述混合的时间优选为24h；所述第一水凝胶与单宁酸的混合物中单宁酸的质量浓度为5％。本发明所述单宁酸优选以溶液形式存在，本发明对所述溶液中单宁酸的浓度没有严格要求。本发明所述单宁酸对损伤具有保护作用，尤其可以减轻炎症反应和改善氧化损伤。本发明制备得到的水凝胶负载了单宁酸，可以抑制脊髓损伤后局部的氧化应激微环境，具有更佳的损伤修复功能，能促进神经再生，促进脊髓损伤后运动功能的恢复。本发明所述水凝胶运输载体。
得到所述水凝胶后，本发明将所述水凝胶与所述小细胞外囊泡混合，孵育，得到所述水凝胶材料。本发明所述混合的方式优选包括将所述小细胞外囊泡注入所述水凝胶中。本发明对所述所述水凝胶与所述小细胞外囊泡的混合比例没有严格要求，常规操作即可；所述孵育优选包括37℃孵育1h后4℃孵育24h。本发明所述孵育促进小细胞外囊泡在水凝胶内的黏附。
本发明所述小细胞外囊泡优选通过间充质干细胞制备得到。所述小细胞外囊泡的制备方法优选包括：取原代间充质干细胞培养至第3-6代的传代细胞，培养取培养液，采用超速分离法分离纯化得到所述小细胞外囊泡。本发明对所述培养和超速分离法的方式没有严格要求，常规操作即可。本发明所述制备方法简单，得到的水凝胶材料具有生物相容性好，质地柔软，粘连性强，具有持续发挥作用、抗炎症抗氧化及促进脊髓神经再生修复的优良性能，实现了小细胞外囊泡的局部输送和长期缓释；小细胞外囊泡结合单宁酸的药物作用，可改善脊髓损伤微环境，抑制局部氧化应激及炎症反应。动物体内实验结果显示具有良好的促进神经元再生及运动功能恢复的作用，能够修复脊髓损伤。
鉴于本发明所述用于脊髓损伤的水凝胶材料的优势作用，所述水凝胶材料在下述a)～e)中任意一种中的应用均属于本发明的保护范围：a)制备治疗脊髓损伤的产品；b)制备促进神经再生的产品；c)制备促进脊髓损伤后运动功能的恢复的产品；d)制备改善脊髓损伤微环境的产品；e)制备提高脊髓损伤修复效果的产品。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的用于脊髓损伤的水凝胶及其制备方法和应用、多功能微环境保护的水凝胶材料进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
人脐带间充质干细胞来源小细胞外囊泡的提取：
(1)脐带间质干细胞的原代培养：人体脐带组织在收集后5小时内剪碎成1～3mm3的组织块，在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的低糖DMEM培养液及37℃、5％二氧化碳的环境条件下培养。获得的传代细胞3～6代用于随后的实验。
(2)将步骤(1)原代培养得到的的脐带间充质干细胞培养至P3代开始加入无血清低糖DMEM进行培养上清的收集，收集时间为48h，收集的上清液的细胞密度在70％以上；原代细胞培养至P6代后停止上清收集；
(3)将收集的上清液依次在500g(4℃)和2000g(4℃)下离心10min，以去除死亡细胞和细胞碎片；取离心上清液在4℃，10000g下离心30min，去除细胞器。然后，将上清液转移到100kDa MWCO超滤离心管，在2000g下离心30min。然后，收集上管的浓缩液，在4℃，100000g的条件下超速离心70分钟，收集沉淀(即sEVs颗粒)。然后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将sEVs颗粒重新悬浮，并在100000g下再次离心70min，收集沉淀。最后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将sEVs颗粒重新悬浮，收集纯化的sEVs，并在0.22μm孔过滤器上过滤，得小细胞外囊泡悬液，将溶液储存在-80℃的冰箱保持备用。
实施例2
小细胞外囊泡的鉴定
(1)透射电镜观察小细胞外囊泡的形态：取适量的实施例1小细胞外囊泡悬液滴加于直径2mm的载样铜网上，于室温静置5min后，用滤纸轻轻吸去铜网边缘残余液体，然后将铜网倒扣于30g/L磷钨酸(pH 6.8)液滴上，室温下负染5min，最后将铜网在白炽灯下烘干，置于透射电镜下观察并拍照，结果如图1所示，根据图1可以看出，小细胞外囊泡为凹陷的圆盘状囊泡。
(2)纳米颗粒跟踪分析仪(nanoparticle tracking analysis，NTA)检测小细胞外囊泡的粒径：首先使用PBS将实施例1小细胞外囊泡悬液稀释至仪器检测的最适浓度，充分混匀后，用一次性注射器吸取1mL样品匀速注入样品室，小细胞外囊泡的粒径和浓度将通过仪器自带的软件呈现，结果如图2所示。根据图2可以看出，小细胞外囊泡的粒径主要分布在30-200nm之间。
(3)Westernblot检测小细胞外囊泡表面标记蛋白：将实施例1提取的小细胞外囊泡充分裂解后加入1/4体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸5min，按200μg蛋白质总量上样，进行电泳，转膜，后用含50g/L脱脂牛奶的TBS/T室温封闭1h，分别与兔抗人TSG101抗体、兔抗人CD81抗体、兔抗人calnexin抗体及兔抗人Alix(1:500)于4℃反应过夜，次日用TBST洗膜3次后，与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗37℃孵育1h，TBST洗膜3次后，加入预混HRP化学发光底物，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测，如图3所示。根据图3可以看出，脐带来源的小细胞外囊泡的标记蛋白TSG101，CD81和Alix呈阳性表达，calnexin呈阴性。
实施例3
多功能微环境保护的水凝胶材料的制备：
(1)将25w/v％的N-丙烯酰基甘氨酰胺(NAGA)、2w/v％的纳米粘土(Laponite)和5w/v％的甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)在37℃去离子水中溶解30min，得到NAGA/GelMA/Laponite溶液。
(2)将光起始剂-1173与NAGA/GelMA/Laponite溶液按照1：100的质量比混合，将光起始剂-1173溶解在NAGA/GelMA/Laponite溶液中。完全溶解后，将混合物浇注到塑料模具中并交联40分钟，得到NGL水凝胶。
(3)将步骤(2)得到的NGL水凝胶与单宁酸(TA)溶液混合，使混合物中单宁酸的质量浓度为5％，浸泡24h，得到NGL/T水凝胶。
(4)将冻干的NGL/T水凝胶在PBS中完全溶胀，紫外过夜消毒，然后用70％乙醇和PBS洗涤以进行灭菌。将实施例1用磷酸盐缓冲盐水(PBS)重新悬浮sEVs颗粒，得到的sEVs的悬浮液注入NGL/T水凝胶中。然后将NGL/T水凝胶包封的sEVs在37℃下孵育1小时，并在4℃下孵育24小时以制备多功能微环境保护的水凝胶材料，记为sEVs-NGL/T。
测验例1
NGL/T水凝胶的表征
通过扫描电镜观察水凝胶的形态(Merlin,Zeiss,Germany)；降解率、溶胀率检测按照相关公式进行：
Figure BDA0003747626670000081
Figure BDA0003747626670000082
其中，Wd表示水凝胶的干重，Ws为水凝胶的湿重，W0为样品初始重量，Wt为给定时间样品的重量。结果如图4～6所示，其中图4为电镜图；图5为降解率结果图；图6为溶胀行为图。根据图4～6可以看出，NGL/T水凝胶为网状多孔结构；NGL/T水凝胶第一个月的降解率很小，这有利于为缺损组织提供机械支撑；在最初的6小时内NGL/T水凝胶溶胀率增加，48小时达到溶胀平衡，溶胀率达到240％，整体溶胀率小。
测验例2
sEVs从NGL/T水凝胶中的释放
检测sEVs从NGL/T水凝胶中的释放，以预定的时间间隔收集500μL的上清液，并用等量的新鲜培养液替换。收集的样品进行BCA分析，以确定上清液中游离sEV的数量。计算一段时间内的累积和每日释放情况，并绘制成曲线，结果如图7，其中图7中A为NGL/T水凝胶的sEVs日释放曲线，B为NGL/T水凝胶的sEVs累计释放曲线图。根据图7可以看出，sEVs-NGL/T中的sEV持续释放约一周，超过80％的sEV从NGL/T水凝胶中释放。NGL/T水凝胶负载的SEV的持续释放进一步确保了其在有效治疗和脊髓损伤修复方面的潜在应用。
测验例3
检测sEVs在NGL/T水凝胶中的黏附和分布
检测sEVs在NGL/T水凝胶中的黏附和分布，为了证实sEVs被成功地装载到NGL/T水凝胶中，利用DiI标记实施例1得到的sEVs后，按照实施例3的步骤将标记后的sEVs包裹在NGL/T水凝胶中，得到DiI-sEVs-NGL/T水凝胶。随后，用共聚焦激光扫描显微镜对DiI-sEVs-NGL/T水凝胶进行了z-轴扫描，结果如图8所示。根据图8免疫荧光图像可以看出，较多的sEVs附着在多孔结构上，并显示这些sEVs均匀分布在水凝胶中。
实验例4
1.将实施例3得到的sEVs-NGL/T通过原位移植置于大鼠脊髓损伤处，实验方案：
(1)动物模型的建立：脊髓损伤大鼠模型：大鼠称重后，用10％水合氯醛(3mL/k)麻醉，置于手术台上俯卧位，老鼠背上的皮毛备皮，皮肤切开后，分离肌肉行椎板切除，显露T9-10节段，打开椎板，使脊髓暴露并剪断，形成2.0±0.5mm的间隙，大鼠出现后肢来回收缩和尾巴左右摇摆的现象，预示横断成功，术后大鼠双下肢瘫痪。
(2)实验分组与处理：分为损伤组(SCI组)，剪断脊髓后不做任何治疗处理；假手术组(sham)，只切除椎板，不进行脊髓的离断；NGL/T组，在损伤部位将NGL/T水凝胶制造成圆柱形2×1×1大小，移植到损伤缺损处；sEVs-NGL/T组，在损伤部位移植sEVs-NGL/T水凝胶。
2.以造模当天为第0天，分别于第7、14、21、28、35、42、49、56天，参照BBB运动评分细则对大鼠进行Basso Beattie Bresnahan(BBB)测试和评分，用于评估大鼠神经恢复情况，结果如图9所示。根据图9可以看出，严重脊髓损伤后，损伤组大鼠几乎完全瘫痪，而移植sEVs-NGL/T组和移植NGL/T组大鼠后肢运动功能均得到有效恢复，术后第56天sEVs-NGL/T组和NGL/T组与SCI组相比，BBB评分明显均改善，sEVs-NGL/T组和NGL/T组明显促进脊髓损伤后功能恢复，实现了最佳的运动功能恢复效果，并且sEVs-NGL/T组治疗效果比NGL/T组还要突出。
3.采用苏木精-伊红染色(HE染色)比较脊髓损伤后56天的脊髓组织学形态和损伤脊髓的空洞面积，结果如图10～11所示。根据图10～11可以看出，在脊髓损伤后56天，SCI组脊髓组织严重受损，并有明显的囊性空洞，定量统计分析表明sEVs-NGL/T组的相对空洞面积为(20.83±3.4)％和NGL/T组的相对空洞面积(38.83±6.06)％明显小于SCI组(64.73±8.21)％，sEVs-NGL/T组的空洞面积明显小于NGL/T组。结果表明，sEVs-NGL/T和NGL/T水凝胶均能有效改善脊髓损伤后的病理改变，抑制空洞形成，sEVs-NGL/T的效果更为突出。
4.治疗7天后，取各组大鼠的脊髓组织，制作切片，进行免疫荧光染色，评价4-羟基壬烯醛(4-HNE)和8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)的表达情况。4-HNE和8-OHdG分别是氧化应激引起的脂质过氧化和DNA氧化损伤的产物。结果如图12。根据图12可以看出sEVs-NGL/T能显著降低大鼠脊髓损伤后的氧化应激损伤。
5.造模56天后处死大鼠，取主要脏器进行苏木精-伊红染色(HE染色)，对sEVs-NGL/T治疗的安全性进行评估，结果如图13所示。根据图13可以看出，对经过sEVs-NGL/T治疗的大鼠全身组织，包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的HE染色观察，皆未见水凝胶治疗对全身组织的毒性作用，进一步说明了本发明sEVs-NGL/T的安全性。
本发明用于脊髓损伤的水凝胶及多功能微环境保护的水凝胶材料能够抑制脊髓损伤后局部的氧化应激微环境，改善脊髓损伤微环境，进一步提高脊髓损伤的修复效果。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种用于脊髓损伤的水凝胶材料，其特征在于，包括水凝胶和小细胞外囊泡；
所述水凝胶包括如下原料：N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和单宁酸。
2.根据权利要求1所述的水凝胶材料，其特征在于，所述N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶和纳米粘土的质量比为25：2：5。
3.权利要求1或2所述的水凝胶材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和水混合，利用光交联法生成第一水凝胶；
将第一水凝胶与单宁酸混合，得到所述水凝胶；
将所述水凝胶与所述小细胞外囊泡混合，孵育，得到所述水凝胶材料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和水的混合物中，N-丙烯酰基甘氨酰胺的质量浓度为25％、甲基丙烯酸酰化明胶质量浓度为2％，纳米粘土质量浓度为5％。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一水凝胶与单宁酸的混合物中单宁酸的质量浓度为5％。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述光交联法包括：将所述N-丙烯酰基甘氨酰胺、甲基丙烯酸酰化明胶、纳米粘土和水的混合物与光起始剂混合，交联40min。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一水凝胶与单宁酸混合的时间为24h。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述孵育包括37℃孵育1h后4℃孵育24h。
9.权利要求1或2所述的水凝胶材料或权利要求3～8任一项所述制备方法得到的水凝胶材料在下述a)～e)中任意一种中的应用：
a)制备治疗脊髓损伤的产品；
b)制备促进神经再生的产品；
c)制备促进脊髓损伤后运动功能的恢复的产品；
d)制备改善脊髓损伤微环境的产品；
e)制备提高脊髓损伤修复效果的产品。
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