CN117064766B - 一种复合ros响应型水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种复合ROS响应型水凝胶及其制备方法与应用,属于水凝胶技术领域。本申请的复合ROS响应型水凝胶的制备方法包括以下步骤:在D‑甘露醇溶液中加入海藻酸钠、小细胞外囊泡,得到含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液;将上述的含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液、RhB‑AC单体溶液和Ca2+缓释剂、交联剂、引发剂和催化剂混合进行交联反应,得到复合ROS响应型水凝胶。本申请的复合ROS响应型水凝胶通过将含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液与RhB‑AC单体、交联剂混合进行交联反应得到,具有操作性和生物相容性良好、能够缓释小细胞外囊泡的优点。
Description
技术领域
本申请涉及水凝胶技术领域,尤其涉及一种复合ROS响应型水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
当恒牙牙髓受到细菌、机械、化学等刺激出现感染和炎症反应时,最常用的治疗方案是根管治疗,但该种治疗方案未能保留具有营养、感知、免疫和修复功能的牙髓,且技术敏感性和治疗费用较高。近年来,随着牙髓微创治疗理念的发展和治疗手段的更新,活髓保存治疗逐渐成为牙髓炎的又一可行治疗方案。恒牙活髓保存治疗通过去除感染硬组织及受累牙髓,在近髓牙本质表面或已暴露的牙髓创面覆盖生物活性盖髓材料,以消除病变、促进受损牙髓的愈合。然而,目前的盖髓制剂主要适用于健康牙髓创面,对于炎性牙髓疗效不佳。研发新型盖髓材料用于炎症牙髓活髓保存,有望改善活髓保存治疗的临床疗效,最大化保存健康牙髓,对提高患者生活质量、降低牙髓疾病治疗成本具有重要意义。
发明内容
本申请的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种能够缓释小细胞外囊泡的复合ROS响应型水凝胶及其制备方法与应用。
为实现上述目的,本申请采取的技术方案为:
第一方面,本申请提供了一种复合ROS响应型水凝胶的制备方法,其包括以下步骤:
(1)在D-甘露醇溶液中加入海藻酸钠、小细胞外囊泡,得到含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液;所述小细胞外囊泡来源于牙囊干细胞;
(2)将步骤(1)的含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液、RhB-AC单体、Ca2+缓释剂、交联剂、引发剂和催化剂混合进行交联反应,得到复合ROS响应型水凝胶;所述RhB-AC单体溶液中RhB-AC单体的质量百分比为8.5-10%;所述RhB-AC单体的结构式如下式所示:
本申请通过将含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液与RhB-AC单体、助剂混合进行交联反应,得到一种操作性和生物相容性良好、能够缓释小细胞外囊泡的复合ROS响应型水凝胶。
本申请的小细胞外囊泡(sEV)来源于牙囊干细胞(DFSCs),牙囊干细胞是一类易于获取的牙源性间充质干细胞,具有促进炎性牙髓修复的作用,sEV是干细胞发挥旁分泌作用的重要效应分子,因此通过多步分离提取DFSCs中的sEV,通过体外实验验证发现来源于DFSCs的sEV具有缓解H2O2诱导的牙髓干细胞(DPSCs)氧化应激反应、减少细胞凋亡、促进细胞增殖以及修复DPSCs成牙本质向分化的能力;以DFSC-sEV作为盖髓材料盖髓至大鼠实验性牙髓炎模型中,实验结果表明DFSC-sEV能够缓解牙髓氧化应激损伤,促进创面牙本质桥形成,上述结果均表明DFSC-sEV可作为新型盖髓材料用于促进炎症牙髓的修复。然而,在实验的过程中,申请人发现sEV在体内应用时易被巨噬细胞清除,具有疗效不稳定的缺陷。在此基础上,申请人通过将sEV负载至具有ROS响应特性的水凝胶中,使水凝胶在浓度较高ROS水平的环境中“按需”释放sEV,克服了sEV在体内应用的不稳定性缺陷。
本申请的RhB-AC单体是一种含有聚合双键的化合物,能够响应所处环境中的HClO/ClO-,而HClO/ClO-属于ROS中的一种,当所处环境中的ROS水平到达一定的阈值(如HClO/ClO-浓度为50μM)时,RhB-AC单体中的聚合双键被解离,实现响应ROS的效果。
作为本申请所述制备方法的优选实施方式,在步骤(1)中,所述海藻酸钠、小细胞外囊泡、D-甘露醇溶液中D-甘露醇的质量比为海藻酸钠:小细胞外囊泡:D-甘露醇=2:0.0003:1;
在步骤(2)中,所述Ca2+缓释剂、交联剂、引发剂和催化剂体积之和与含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液、RhB-AC单体溶液的体积比为Ca2+缓释剂+交联剂+引发剂+催化剂:含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液:RhB-AC单体溶液=317.5:2700:25。
在优选配比条件下,本申请的复合ROS响应型水凝胶的成胶时间相对较长,可在4min内成胶,赋予了水凝胶良好的可注射性,并且得到的水凝胶形状均一、呈白色半透明状,内部结构为多孔、网络状结构,有利于负载sEV。本申请选用Ca2+缓释剂能够促进海藻酸钠凝结成网络,加入交联剂、引发剂和催化剂有助于产生自由基引发RhB-AC单体聚合形成网络状结构,再与海藻酸钠网络聚合可得到本申请的复合ROS响应型水凝胶。
作为本申请所述制备方法的优选实施方式,在步骤(2)中,所述交联剂、引发剂和催化剂的质量分数比为交联剂:引发剂:催化剂=0.164:0.164:0.008;所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺;所述引发剂为过硫酸铵;所述催化剂为四甲基乙二胺。过硫酸铵在四甲基乙二胺的作用下产生自由基,引发RhB-AC单体聚合,并在N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的作用下RhB-AC聚合物与海藻酸钠交联,形成复合ROS响应型水凝胶。
作为本申请所述制备方法的优选实施方式,所述Ca2+缓释剂包括可溶性钙盐和磷酸氢二钠,所述可溶性钙盐中的Ca2+与磷酸氢二钠的摩尔浓度比为Ca2+:磷酸氢二钠=0.08:0.0537。在优选配比条件下,可溶性钙盐和磷酸氢二钠组合为Ca2+缓释剂能够使海藻酸钠溶液与Ca2+发生离子交换反应的速度放缓,使复合ROS响应型水凝胶的形成速度控制在4min左右,使复合ROS响应型水凝胶在使用的过程中可以通过注射的方式施用至创面中,无需长时间等待即可成胶。
作为本申请所述制备方法的优选实施方式,在步骤(1)中,所述小细胞外囊泡根据以下方法提取得到:
S1、将牙囊干细胞接种至无血清培养基中培养,去除细胞碎片,离心,得到上清液a;
S2、将步骤S1的上清液a进行超速离心,得到沉淀a;所述超速离心的转速为100000-120000g;
S3、采用PBS重悬步骤S2的沉淀a,洗涤、离心,得到沉淀b,所得沉淀b为小细胞外囊泡。
本申请通过多步离心从牙囊干细胞中提取得到sEV,通过一系列的鉴定小细胞外囊泡的标志物确定上述提取方法得到的沉淀物为小细胞外囊泡。此外,申请人还通过生物学实验确定牙囊干细胞提取得到的sEV能够改善H2O2介导的DPSCs氧化与抗氧化失衡,减少细胞凋亡和增殖抑制,修复氧化应激环境DPSCs的成牙本质向分化能力,提示sEV具有缓解H2O2诱导的牙髓干细胞氧化应激损伤。
作为本申请所述制备方法的优选实施方式,在步骤(2)中,所述交联反应为在20-30℃下搅拌30-40min。本申请复合ROS响应型水凝胶的制备方法快速便捷,只需在室温条件下通过搅拌即可实现交联反应,无需苛刻的反应条件以及较长的等待时间。
第二方面,本申请提供了一种复合ROS响应型水凝胶,根据上述制备方法制备得到。
第三方面,本申请提供了上述复合ROS响应型水凝胶在制备治疗牙髓炎或促进创面修复的材料中的应用。
申请人将复合ROS响应型水凝胶作为修复材料应用在治疗牙髓炎中,能够根据炎性牙髓中的ROS水平智能缓释sEV,起到保护氧化应激受损DPSCs、促进DPSCs成牙本质细胞向分化,在牙髓创面形成牙本质样屏障,实现炎症牙髓的保存和修复。
作为本申请所述应用的优选实施方式,所述材料为创面敷料、填充料、盖髓材料中的一种。
第四方面,本申请提供了一种生物盖髓材料,其包括上述复合ROS响应型水凝胶。
与现有技术相比,本申请的有益效果为:
(1)本申请通过将小细胞外囊泡(sEV)负载至能够响应ROS的水凝胶中制备为复合ROS响应型水凝胶,当复合ROS响应型水凝胶所处环境的ROS水平升高后,复合ROS响应型水凝胶能够快速、敏感地响应ROS,并发生降解,使sEV从水凝胶中被释放至所处环境中,实现缓释sEV的效果,具有促进炎症牙髓修复与保存的效果。
(2)本申请的复合ROS响应型水凝胶通过含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液与RhB-AC单体和交联剂发生交联反应得到,海藻酸钠和小细胞外囊泡在交联剂的作用下交联为一层网络,再通过交联剂与RhB-AC聚合为第二层网络,能够使小细胞外囊泡均匀分布,避免sEV在体内被巨噬细胞清楚,同时根据所处环境的ROS水平,智能缓释sEV,增强sEV对炎症牙髓的保护和修复作用。
附图说明
图1为本申请小细胞外囊泡(sEV)的表征及生物学鉴定结果,其中A为提取得到的sEV透射电镜图,B为提取得到的sEV直径大小分布图,C为sEV的特异性标志物检测结果;
图2为本申请通过不同浓度H2O2溶液处理牙髓干细胞(DPSCs)以建立的DPSCs体外氧化应激模型的结果图;
图3为本申请提取的sEV对DPSCs体外氧化应激模型的影响结果图,其中A为DPSCs胞内活性氧(ROS)水平流式荧光检测结果,B为DPSCs胞内ROS水平半定量结果,C为DPSCs的戊二醛(MDA)表达水平,D为DPSCs的超氧化物歧化酶(SOD)活性水平,E为DPSCs中DNA氧化损伤标记8-OHdG半定量结果,F为DPSCs中DNA氧化损伤标记8-OHdG分布图;
图4为本申请提取的sEV对DPSCs体外氧化应激模型的影响结果图,其中A为DPSCs的FITC Annexin V/7AAD染色关系分析图,B为DPSCs的凋亡率,C为BrdU染色法评估DPSCs增殖能力的荧光显微镜图,D为DPSCs的BrdU阳性细胞比例;
图5为本申请提取的sEV对DPSCs体外氧化应激模型的影响结果图,其中A为茜素红染色评估DPSCs的矿化结节形成水平,B为DPSCs成牙本质向分化标记物的相关基因表达水平,C为油红O染色评估DPSCs的脂滴形成水平,D为DPSCs成脂向分化标记物的相关基因表达水平;
图6为本申请复合ROS响应型水凝胶的表征数据结果,其中A为实施例1、实施例2、对比例1、对比例2复合ROS响应型水凝胶的结构显微镜图,B为复合ROS响应型水凝胶的合成示意图,C为复合ROS响应型水凝胶溶胀特性评估结果,D为复合ROS响应型水凝胶成胶时间;
图7为本申请复合ROS响应型水凝胶的负载和体外缓释sEV性能检测结果,其中A为复合ROS响应型水凝胶对HClO/ClO-的响应特性的评估结果,B为复合ROS响应型水凝胶在不同溶液环境下降解特性评估结果,C为sEV在复合ROS响应型水凝胶中的分布情况,D为复合ROS响应型水凝胶在HClO/ClO-溶液中缓释sEV的结果,E为复合ROS响应型水凝胶的降解产物对DPSCs增殖活性的影响,F为复合ROS响应型水凝胶的降解产物对DPSCs活力的影响;
图8为本申请复合ROS响应型水凝胶治疗炎症牙髓3天后的效果图,其中A为牙髓氧化应激损伤水平,B为8-OHdG表达水平半定量分析,C为DPSCs的CD90+氧化应激受损程度分析;
图9为本申请复合ROS响应型水凝胶治疗炎症牙髓7天后的效果图,其中A为牙髓矿化修复水平的DPSS免疫荧光评估结果,B为牙髓DPSS水平的半定量分析结果;
图10为本申请复合ROS响应型水凝胶治疗炎症牙髓28天后牙髓创面硬组织屏障形成强度;
图11为本申请复合ROS响应型水凝胶的作用机理示意图;
上述图中MFI表示为平均荧光强度,Control为空白对照组,SA-RhB为对比例1的复合ROS响应型水凝胶,SA-RhB@sEV为实施例1的复合ROS响应型水凝胶,LPS为炎症诱导物脂多糖,*为P<0.05,**为P<0.01,***为P<0.001。
具体实施方式
为更好地说明本申请的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本申请作进一步说明。
实施例、对比例和实验例所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例、对比例和实验例中的牙囊干细胞、牙髓干细胞、小细胞外囊泡由以下方法提取得到:
牙囊干细胞(DFSCs)的分离培养:取出生4-6d的大鼠,颈椎脱臼处死后钝性分离下颌骨,在显微镜下分离磨牙牙胚,剥离牙胚外层牙囊组织,α-MEM培养基洗涤牙囊组织2次,剪碎后均匀铺在原代培养基润湿的培养皿中培养过夜,再加入原代培养基,每3d换液,待细胞生长至80-90%汇合时进行传代培养,得到牙囊干细胞,对牙囊干细胞的活力进行鉴定,包括标志物检测、成牙本质向分化能力检测、成脂向分化能力,所述标志物包括CD29、CD45、CD90、CD34和CD44,能够检测到标志物并且具有成牙本质向分化和成脂向分化能力的第3-5代牙囊干细胞可用于后续实验。
牙髓干细胞(DPSCs)的分离培养方法与牙囊干细胞相似,不同之处为细胞来源于4-6周的大鼠,分离组织为牙髓,其余操作不变。
小细胞外囊泡(sEV)的制备:
S1、将牙囊干细胞接种至无血清培养基中培养48h,将培养液在3000g下离心15min去除细胞碎片,得到上清液a;
S2、将步骤S1的上清液a在120000g下离心90min,得到沉淀a;
S3、采用PBS重悬步骤S3的沉淀a,洗涤、离心,得到沉淀b,检测沉淀b为圆形囊泡、直径为30-200nm并且具有TSG101、CD63和CD9活性,即可鉴定为小细胞外囊泡。
RhB-AC单体的制备:将罗丹明B与联氨、甲醇进行还原反应,得到RhB-NH2,再将RhB-NH2与三乙胺、二氯甲烷和丙烯酰氯在0℃下发生取代反应,得到RhB-AC单体。
实施例1
本申请复合ROS响应型水凝胶及其制备方法的一种实施例,本实施例所述复合ROS响应型水凝胶由以下方法制备得到:
(1)在100mL 1wt%D-甘露醇溶液中加入2g海藻酸钠、0.0003g小细胞外囊泡,混合均匀,得到含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液;
(2)将2.7mL步骤(1)的含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液、0.025mL 10wt%RhB-AC单体溶液、0.275mL Ca2+缓释剂、0.02mL 0.164wt%N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、0.02mL0.164wt%过硫酸铵和0.0025mL 0.008wt%四甲基乙二胺混合在室温下搅拌30-40min进行交联反应,得到复合ROS响应型水凝胶,将所得水凝胶命名为SA-RhB@sEV;所述Ca2+缓释剂包括0.272M硫酸钙和0.054M磷酸氢二钠。
实施例2
本申请复合ROS响应型水凝胶及其制备方法的一种实施例,本实施例所述复合ROS响应型水凝胶的制备方法与实施例1相似,不同之处为步骤(1)中的小细胞外囊泡用量为0.0006g,步骤(2)中的8.5wt%RhB-AC单体溶液的用量为0.03mL,其余步骤及参数不变,所得水凝胶命名为SA-RhB@sEV1。
实施例3
本申请复合ROS响应型水凝胶及其制备方法的一种实施例,本实施例所述复合ROS响应型水凝胶的制备方法与实施例1相似,不同之处为步骤(1)中的小细胞外囊泡用量为0.00045g,步骤(2)中的9.25wt%RhB-AC单体溶液的用量为0.0275mL,其余步骤及参数不变,所得水凝胶命名为SA-RhB@sEV2。
对比例1
本申请复合ROS响应型水凝胶及其制备方法的一种对比例,本对比例所述复合ROS响应型水凝胶的制备方法与实施例1相似,不同之处为步骤(2)中不加入RhB-AC单体,其余步骤及参数不变,将所得水凝胶命名为SA。
对比例2
本申请复合ROS响应型水凝胶及其制备方法的一种对比例,本对比例所述复合ROS响应型水凝胶的制备方法与实施例1相似,不同之处为步骤(2)中的8.5wt%RhB-AC单体溶液的用量为0.06mL,其余步骤及参数不变,所得水凝胶命名为SA-RhB@sEV3。
对比例3
本申请复合ROS响应型水凝胶及其制备方法的一种对比例,本对比例所述复合ROS响应型水凝胶的制备方法与实施例1相似,不同之处为步骤(1)中不加入小细胞外囊泡,其余步骤及参数不变,所得水凝胶命名为SA-RhB。
实验例1
牙髓干细胞(DPSCs)是来源于牙髓组织的一类间充质干细胞,是受损牙髓修复的关键因素,有研究表明牙髓炎组织具有氧化应激特征,表现为活性氧簇(ROS)水平异常升高,氧化与抗氧化失衡,导致DPSCs凋亡,抑制其多向分化的能力,严重削弱DPSCs介导的组织修复或再生功能,若能增强DPSCs对氧化应激环境的适应能力,则有助于炎症牙髓的损伤修复。因此,本实验通过建立DPSCs体外氧化应激模型并采用sEV处理测定DPSCs的相关指标判断sEV对氧化应激状态下的DPSCs的影响,探究sEV是否能够通过影响DPSCs实现修复炎症牙髓的效果。
1、对提取得到的牙囊干细胞来源sEV进行表征及生物学鉴定。
将提取得到的sEV按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书检测sEV总蛋白浓度;利用透射电镜以及Zeta View纳米颗粒跟踪分析仪检测sEV的形态以及大小分布;利用Westernblot检测sEV中是否表达特异性标志物TSG101、CD63以及CD9,以上结果见图1。
如图1所示,提取得到的sEV总颗粒浓度为(1.33±0.09)×108particles/ml,呈圆形、双层膜样结构,平均粒径为163.12±4.07nm,峰值为125nm,在小细胞外囊泡粒径范围内;并且能够特异性表达TSG101、CD63和CD9,表明本申请的方法能够成功提取得到活性较好的sEV。
2、采用H2O2建立DPSCs体外氧化应激模型。
将第3代DPSCs以3×103个/孔接种于96孔细胞培养板中,过夜培养至贴壁,分别加入终浓度为0、50、100、200、300、500、700μM的H2O2溶液,培养6h后更换为传代培养基培养24h,采用CCK8试剂盒评估DPSCs增殖活性,结果见图2。
如图2所示,200μM的H2O2溶液能够使DPCSs活力下降至正常细胞的60%,因此采用200μM的H2O2溶液处理DPCSs作为DPSCs体外氧化应激模型。
3、评估经sEV处理的DPSCs体外氧化应激模型的变化。
为了便于观察采用PKH-67绿色荧光染料标记sEV,其余实验如无特别说明均采用经标记的sEV。本实验共设置3个处理组,分别为空白对照组、H2O2组和H2O2+sEV组。空白对照组不作H2O2溶液处理;H2O2组和H2O2+sEV组均加入200μM的H2O2溶液刺激6h,H2O2+sEV组在加入H2O2溶液前先用40μg/mL的sEV预处理24h。
将经H2O2溶液处理后的三个处理组分别采用流式细胞仪检测ROS水平,8-OHdG染色评估细胞DNA氧化损伤程度,按照试剂盒步骤检测细胞ROS、MDA、SOD、以及凋亡水平,Brdu法评估细胞增殖能力,qPCR、茜素红染色/油红O染色评估细胞成牙本质/成脂向分化能力,结果见图3-5。
如图3-A、3-B所示,H2O2+sEV组的细胞ROS水平低于H2O2组,与空白对照组的ROS水平接近,表明sEV可有效降低DPSCs体外氧化应激模型的ROS水平;如图3-C、3-D、3-E、3-F所示,H2O2+sEV组的细胞MDA、SOD水平、DNA氧化损伤程度均低于H2O2组,与空白对照组的接近,表明sEV可有效降低DPSCs体外氧化应激模型的MDA和SOD水平、以及DNA氧化损伤程度。
如图4-A、4-B所示,H2O2+sEV组的细胞凋亡水平低于H2O2组,与空白对照组的接近,表明sEV能够降低DPSCs体外氧化应激模型的凋亡水平;如图4-C、4-D所示,H2O2+sEV组的细胞增殖能力高于H2O2组,与空白对照组的接近,表明sEV能够提高DPSCs体外氧化应激模型的增殖能力。
如图5-A、5-B所示,H2O2+sEV组的矿化结节增多、细胞矿化标记物ALP、BSP和DCN水平高于H2O2组,低于空白对照组,表明sEV能够促进DPSCs体外氧化应激模型的成牙本质向分化能力;如图5-C、5-D所示,H2O2+sEV组的细胞成脂相关基因Adipsin、CEBPα和CEBPβ水平低于H2O2组,与空白对照组接近,表明sEV能够使DPSCs体外氧化应激模型的成脂向分化能力恢复至正常细胞的水平。
由以上数据可得,从DFSC提取得到sEV能够改善H2O2介导的DPSCs氧化和抗氧化失衡,减少细胞凋亡和增殖抑制,修复氧化应激环境下DPSCs的成牙本质向分化能力,即sEV具有缓解H2O2诱导的DPSCs氧化应激损失的效果。
实验例2
对复合ROS响应型水凝胶进行表征,并评估水凝胶的负载和体外缓释sEV性能。
1、对复合ROS响应型水凝胶进行表征。
(1)对实施例1-3、对比例1-2的复合ROS响应型水凝胶通过扫描电镜观察内部形貌;
(2)将实施例1的水凝胶浸于PBS中并定时称重,计算水凝胶的溶胀率;
以上结果见图6。
2、评估水凝胶的负载和体外缓释sEV性能。
(1)将实施例1的水凝胶浸泡于0、50、100、200、500、1000μM的HClO/ClO-溶液中,通过荧光光谱评估水凝胶对HClO/ClO-的响应能力;
(2)将实施例1的水凝胶分别浸泡在PBS,100、500、1000μM的HClO/ClO-溶液,500μM的HClO/ClO-+10mM EDTA溶液,20mM EDTA溶液中,观察水凝胶的降解情况,并得到降解后的水凝胶;
(3)对实施例1和对比例3的水凝胶采用激光共聚焦显微镜进行拍摄,并重建水凝胶三维图像,观察sEV在水凝胶中的分布;
(4)对实施例1的水凝胶浸泡在0、100、500、1000μM的HClO/ClO-溶液中,以100rpm在37℃摇床中孵育,在0、0.5、1、2、3、4、5d更换溶液,更换出来的溶液通过BCA法测定其蛋白浓度,计算sEV累计释放量百分比P,直至溶液中蛋白含量低于BCA的检测阈值,sEV累计释放量百分比计算公式如下:
P=(∑Ct)×2/300×100%
式中,Ct为不同时间的蛋白浓度,t为时间(天),t=0.5,1,2,3,4,5;
(5)将上述降解后的水凝胶与DPSCs共培养,通过CCK8和Live/Dead染色评估水凝胶降解产物对DPSCs的影响;
以上结果见图7。
如图6-A、6-B所示,本申请实施例1-3的复合ROS响应型水凝胶的结构为RhB-AC与海藻酸钠形成互穿网络结构,内部为多孔、网络状结构,并且内壁表面较对比例1粗糙并且交联度增加,提示水凝胶形成第二层网络;对比例2的水凝胶交联度较实施例1-3的低,表明本申请在特定的配比下能够得到交联度更高、内壁表面更粗糙可容纳更多sEV的复合ROS响应型水凝胶。如图6-C、6-D所示,本申请复合ROS响应型水凝胶4min内可成胶,为均一、白色半透明凝胶,在PBS中的溶胀率约为20%。
如图7-A所示,本申请的复合ROS响应型水凝胶能够快速、灵敏地响应HClO/ClO-溶液并发出荧光,荧光强度随着HClO/ClO-浓度升高、接触时间延长而增加;如图7-B所示,本申请的复合ROS响应型水凝胶具有可降解性,在不同溶液中均具能够降解,并且降解速率随着HClO/ClO-浓度升高而加快;如图7-C、7-D所示,本申请的复合ROS响应型水凝胶中的sEV在水凝胶中均匀、密集分布,并且当水凝胶响应HClO/ClO-溶液时能够持续释放sEV,释放速率与HClO/ClO-浓度呈正相关,复合ROS响应型水凝胶在1000μM HClO/ClO-溶液中作用5d可释放约80%的sEV;如图7-E、7-F所示,本申请的复合ROS响应型水凝胶对DPSCs无明显细胞毒性。
由以上数据可得,本申请的复合ROS响应型水凝胶具有良好的操作性、生物相容性和sEV缓释特性。
实验例3
为了验证复合ROS响应型水凝胶在牙髓炎中的治疗效果,建立大鼠实验性牙髓炎并直接盖髓,测定相关指标评估复合ROS响应型水凝胶对牙髓炎的疗效。
1、建立牙髓炎模型:将大鼠麻醉,采用3%H2O2溶液消毒口腔,2.5%NaClO溶液消毒第一磨牙牙冠,对其双侧上颌第一磨牙咬合面近中窝开髓,用2.5% NaClO冲洗创面至露髓点无明显渗血,随后用PBS彻底冲洗创面,于露髓点注入5mg/mL的脂多糖(LPS)诱导牙髓炎症。
2、采用ROS响应型水凝胶进行盖髓术:将不同处理组的药物轻柔置于牙髓创面上,然后用iRoot BP Plus封闭创面,拭干窝洞,涂布自酸蚀粘结剂进行窝洞粘接,并用流体树脂修复牙体缺陷,调整下颌第一磨牙咬合面,预防充填体脱落。处理组包括空白对照组、LPS组、LPS+SA-RhB组、LPS+sEV组、LPS+SA-RhB@sEV组。
3、通过HE染色评估术后3、7、28d大鼠牙髓炎症及修复程度,通过8-OHdG/CD105免疫荧光染色评估术后3、7、28d大鼠牙髓及牙髓中DPSCs氧化应激受损程度,DSPP免疫荧光染色评估术后3、7、28d大鼠牙髓矿化修复水平,结果见图8、9、10。
如图8-A、8-B、8-C所示,术后3d LPS+SA-RhB组、LPS+sEV组和LPS+SA-RhB@sEV组与LPS组相比,牙髓组织中8-OHdG表达水平和8-OHdG+CD90+DPSCs比例显著降低,其中LPS+SA-RhB@sEV组的8-OHdG水平显著低于其余处理。
如图9-A、9-B所示,术后7d LPS+sEV组和LPS+SA-RhB@sEV组与其余处理组相比,牙髓矿化修复标记物DSPP表达水平显著上调,并且LPS+SA-RhB@sEV组的DSPP表达水平高于LPS+sEV组。
如图10所示,术后28d LPS+sEV组和LPS+SA-RhB@sEV组的创面均可见连续牙本质桥形成,并且LPS+SA-RhB@sEV组的牙本质桥形成情况显著优于LPS+sEV组。
由以上数据可得,本申请的复合ROS响应型水凝胶能够在体内响应ROS智能缓释sEV,进一步加强了sEV对炎症牙髓的保护和修复作用。
本申请根据上述结果绘制为复合ROS响应型水凝胶的作用机理示意图(图11)。如图11所示,当牙髓发生炎症时DPSCs会出现氧化应激现象,细胞的ROS水平上升,而本申请的复合ROS响应型水凝胶在ROS水平较高的环境下会开始降解,使穿插在水凝胶中的sEV被缓释至牙髓中,保护氧化应激受损的DPSCs,促进DPSCs成牙本质细胞向分化,在牙髓创面形成牙本质样屏障,实现炎症牙髓的保存与修复。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本申请技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种复合ROS响应型水凝胶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)在D-甘露醇溶液中加入海藻酸钠、小细胞外囊泡,得到含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液;所述小细胞外囊泡来源于牙囊干细胞;
(2)将步骤(1)的含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液、RhB-AC单体溶液、Ca2+缓释剂、交联剂、引发剂和催化剂混合进行交联反应,得到复合ROS响应型水凝胶;所述RhB-AC单体溶液中RhB-AC单体的质量百分比为8.5-10%;所述RhB-AC单体的结构式如下式所示:
;
在步骤(1)中,所述海藻酸钠、小细胞外囊泡、D-甘露醇溶液中D-甘露醇的质量比为海藻酸钠:小细胞外囊泡:D-甘露醇=2:0.0003-0.0006:1;
在步骤(2)中,所述Ca2+缓释剂、交联剂、引发剂和催化剂体积之和与含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液、RhB-AC单体溶液的体积比为Ca2+缓释剂+交联剂+引发剂+催化剂:含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液:RhB-AC单体溶液=317.5:2700:25-30;
在步骤(2)中,所述交联剂、引发剂和催化剂的质量比为交联剂:引发剂:催化剂=0.164:0.164:0.008;所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺;所述引发剂为过硫酸铵;所述催化剂为四甲基乙二胺。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述Ca2+缓释剂包括可溶性钙盐和磷酸氢二钠,所述可溶性钙盐中的Ca2+与磷酸氢二钠的摩尔浓度比为Ca2+:磷酸氢二钠=0.08:0.0174。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,所述小细胞外囊泡根据以下方法提取得到:
S1、将牙囊干细胞接种至无血清培养基中培养,去除细胞碎片,得到上清液a;
S2、将步骤S1的上清液a进行超速离心,得到沉淀a;所述超速离心的转速为100000-120000g;
S3、采用PBS重悬步骤S2的沉淀a,洗涤、离心,得到沉淀b,所得沉淀b为小细胞外囊泡。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在步骤(2)中,所述交联反应为在20-30℃下搅拌30-40min。
5.一种复合ROS响应型水凝胶,其特征在于,根据权利要求1-4任一项所述的制备方法制备得到。
6.如权利要求5所述的复合ROS响应型水凝胶在制备治疗牙髓炎或促进牙髓创面修复的材料中的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述材料为创面敷料、填充料、盖髓材料中的一种。
8.一种生物盖髓材料,其特征在于,所述生物盖髓材料包括权利要求6所述的复合ROS响应型水凝胶。
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