CN111748520A

CN111748520A - 牙囊干细胞外泌体、制法及应用、其组合物及制法

Info

Publication number: CN111748520A
Application number: CN202010607634.9A
Authority: CN
Inventors: 田卫东; 郭淑娟; 黄艳丽; 石维薇
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Chengdu Worldlink Health Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: CN111748520B

Abstract

本发明公开了牙囊干细胞外泌体、制法及应用、其组合物及制法，属于生物医药技术领域。本发明的牙囊干细胞外泌体经脂多糖刺激处理。其制备方法包括：收集P2‑P10代中的任意一代牙囊干细胞，加入脂多糖共同培养后，采用外泌体提取试剂提取，获得所述外泌体。本发明公开了该外泌体在制备治疗牙周炎药物、或/和促进牙周膜干细胞的成骨分化药物、或/和促进牙周组织再生药物中的应用。本发明所述的一种可注射的药物组合物，包括透明质酸、以及上述牙囊干细胞外泌体。本发明的牙囊干细胞外泌体，不仅具有治疗牙周炎的作用，还能促进牙周膜干细胞的成骨分化、促进牙周组织再生。

Description

牙囊干细胞外泌体、制法及应用、其组合物及制法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及牙囊干细胞外泌体、制法及应用、其组合物及制法。

背景技术

牙周病是一种感染性的疾病，据调查，近几年罹患牙周病的人越来越多。患有牙周病的患者往往会出现牙结石增多的症状，严重者甚至出现牙龈萎缩的情况，有的患者牙槽骨也会出现不同程度的病变。同时，牙周病也是目前最为常见的口腔疾病之一，它是引起中老年人牙齿缺失的关键原因。牙周病的治疗方法包括：常规基础治疗，牙周手术治疗，中西医结合治疗等。实现牙周组织的再生是治疗牙周病的最佳方法。目前在Clinical Trial注册的干细胞或干细胞外泌体治疗牙周炎临床试验项目已有8项，临床研究发现干细胞治疗牙周炎所致骨下袋缺损，切实可行、安全可靠。

随着干细胞及其生物活性因子研究的深入，发现牙囊干细胞外泌体中富含维持牙周组织动态平衡的关键小分子物质：蛋白、miRNAs、生物活性因子等，对于牙周膜与牙槽骨的修复再生都具有积极的调节作用。因此，提供一种来源于牙囊干细胞的外泌体，能有效治疗牙周炎，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一种牙囊干细胞外泌体，其不仅具有治疗牙周炎的作用，同时还能促进牙周膜干细胞的成骨分化、促进牙周组织再生。

本发明的目的之二在于，提供该牙囊干细胞外泌体的制备方法。

本发明的目的之三在于，提供该牙囊干细胞外泌体的应用。

本发明的目的之四在于，提供含该牙囊干细胞外泌体的药物组合物及制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明所述的牙囊干细胞外泌体，其经脂多糖刺激处理。

本发明前期研究发现，脂多糖(LPS)不仅可以促进牙囊干细胞(DFCs)分泌更多外泌体，同时可以提高外泌体的免疫调节能力，促进炎症环境下牙周膜干细胞的成骨分化，促进牙周组织再生。

本发明所述的牙囊干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：收集P2-P10代中的任意一代牙囊干细胞，加入脂多糖共同培养后，采用外泌体提取试剂提取，获得所述外泌体；优选为P3-P6代中的任意一代，更优选为P5代。

本发明发现，P2-P10代的牙囊干细胞均具有良好的生物活性，其中以P3-P6代为较优。在制备外泌体时，在考虑牙囊干细胞生物活性的基础上，兼顾细胞数量的考虑，选择P5代牙囊干细胞。

本发明的部分实施方案中，所述牙囊干细胞与脂多糖共同培养时，每10ml培养基中，牙囊干细胞为1×10⁵～1×10⁷个，培养基中脂多糖浓度为100～250ng/ml。

本发明的部分实施方案中，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：

步骤1.收集P2-P10代中的任意一代牙囊干细胞，加入脂多糖共同培养后，弃去上清；

步骤2.加入不含外泌体血清的培养基，培养，收集细胞上清液；

步骤3.将步骤2收集到的细胞上清液离心后再过滤，收集滤液；

步骤4.将步骤3所得滤液进行超滤浓缩，收集浓缩液；

步骤5.将步骤4所得浓缩液加入外泌体提取试剂，混匀，孵育，而后离心，沉淀即为所述外泌体。

本发明的技术方案中，加入外泌体提取试剂提取，可按照提取试剂的说明书进行操作；也可按本领域的常规技术操作。

本发明的部分实施方案中，还包括牙囊干细胞的分离、培养。

作为本发明的一些实施例，所述分离、培养牙囊干细胞的具体操作为：

S1.收集健康受试者的需要拔除的未发育完全的智齿，收集围绕于牙冠周缘的牙囊组织；

S2.将所述牙囊组织置于含5％双抗的PBS中浸泡，PBS洗净后，剔去牙体硬组织后，再剪碎；

S3.消化：将细碎组织加入胶原酶混匀，加热消化；待组织呈流体较透明的团状物后，离心，弃去消化液，a-MEM培养基重悬洗涤，再次离心，弃去上清，吸取疏松的组织，均匀平铺于培养瓶中，加入含FBS的a-MEM培养基培养；

S4.当细胞密度达到70％-80％时，弃去培养基，PBS洗涤后，加入胰蛋白酶消化后，再加入含FBS的培养基终止消化；

S5.用移液枪反复吹打使细胞从培养瓶底脱落，吸取细胞悬液至离心管中，离心，弃去上清，加入培养基重悬细胞沉淀，混匀后，接种于新的培养瓶中，传代培养；优选地，按1：2-6的比例进行传代培养，更优选为1：3。

本发明所述的外泌体在制备治疗牙周炎药物、或/和促进牙周膜干细胞的成骨分化药物、或/和促进牙周组织再生药物中的应用。

本发明所述的一种可注射的药物组合物，包括透明质酸、以及上述牙囊干细胞外泌体；其中，牙囊干细胞外泌体的含量为200μg/ml-2000μg/ml，透明质酸的质量含量为0.01-0.05％。

本发明所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：将牙囊干细胞外泌体溶解于PBS中，再与透明质酸溶液混合均匀，即得。

作为本发明的部分实施例，所述PBS溶液与透明质酸溶液的体积比为1：0.125-0.5；优选为1：0.125。

所述透明质酸溶液的质量浓度为0.1-0.5％；优选为0.2％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次采用脂多糖与牙囊干细胞共同培养，不仅可以促进牙囊干细胞分泌更多外泌体，同时可以提高外泌体的免疫调节能力，促进炎症环境下牙周膜干细胞的成骨分化，促进牙周组织再生。

本发明采用透明质酸与牙囊干细胞外泌体制备成可注射的制剂，用于治疗牙周疾病，使用方便，效果确切，采用注射方式将药物直接注入病灶部位，能实现定点治疗。

附图说明

附图1A为牙囊干细胞培养图。

附图1B为牙囊干细胞表面标记物流式结果图。

附图1C为牙囊干细胞茜素红染色显微图。附图1D为牙囊干细胞油红O染色显微图。

附图2为LPS对牙囊干细胞增殖影响结果图

附图3A为L-D-Exo与D-Exo的透射电镜扫描图。

附图3B为L-D-Exo与D-Exo的纳米颗粒追踪分析图。

附图3C为实施例6的Western Blot检测牙囊干细胞外泌体表面标记物结果图。

附图3D为L-D-Exo与D-Exo分泌量的定量分析结果图。

附图4A为0.2％透明质酸凝胶的粘度及频率扫描测定图。

附图4B为0.2％透明质酸凝胶与牙囊干细胞外泌体体积比1：0.125的粘度及频率扫描测定图。

附图4C为0.2％透明质酸凝胶与牙囊干细胞外泌体体积比1：0.25的粘度及频率扫描测定图。

附图4D为0.2％透明质酸凝胶与牙囊干细胞外泌体体积比1：1的粘度及频率扫描测定图

附图5为透明质酸凝胶缓释D-Exo、L-D-Exo结果图。

附图6A为大鼠牙周炎模型建模过程图。

附图6B为实施例9的大鼠牙槽骨形态学分析图。

附图6C为实施例9的甲苯胺蓝染色后结果分析图。

附图7为实施例9的MicroCT扫描图。

附图8A为实施例9的HE染色结果图。

附图8B为实施例9的Masson染色结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例公开了本发明的牙囊干细胞外泌体的制备方法，具体为：

1.牙囊干细胞(DFCs)的分离和培养

1)取得患者或监护人知情同意后，收集12-20岁的健康受试者需要拔除的未发育完全的第三磨牙，可见牙囊组织围绕于牙冠周缘；

2)将收集的牙囊组织置于含10％双抗的PBS中浸泡30min，PBS洗净；

3)用剪刀剔去牙体硬组织，将牙囊组织置于培养皿中，剪刀将组织块剪碎；

4)将细碎组织转移至离心管中，加入10％I型胶原酶2ml混匀，置于37℃水浴锅消化30min，每10min震荡一次，使组织消化完全；

5)待组织呈流体较透明的团状物后，离心1000rpm/5min，弃去消化液，a-MEM培养基重悬洗涤，再次离心1000rpm/5min，弃去上清，吸取疏松的组织，均匀平铺于T25培养瓶中，滴加少量15％FBS的a-MEM培养基使组织处于润湿状态，置于细胞孵箱中(5％CO₂，37℃)，培养24h，待组织块贴壁，缓慢向培养瓶中加入2ml培养基，3天后再次换液；

6)当细胞密度达到70％-80％时，弃去培养基，PBS洗涤后，加入1ml0.25％胰蛋白酶，在37℃孵箱中消化1-2min，加入10％FBS的培养基终止消化；

7)用1ml移液枪反复吹打使细胞从培养瓶底脱落，吸取细胞悬液至离心管中，离心1000rpm/5min，弃去上清，加入适量培养基重悬细胞沉淀，混匀后，接种于新的培养瓶中，以1：3进行传代。进行传代培养，用于间充质干细胞鉴定或后续的外泌体分离，选择P5代牙囊干细胞提取外泌体。

2.牙囊干细胞外泌体的提取和鉴定

1)将P5代DFCs置于T175培养瓶中(25ml培养基)至80％，加入脂多糖(LPS)，使其在培养基中的含量为250ng/ml，孵箱中继续培养24h；

2)弃去上清，PBS清洗2次后，加入含3％无外泌体FBS的a-MEM培养48h，收集细胞上清液于50ml离心管中，4℃暂存；

3)将收集的细胞上清液在4℃、2000g/30min条件下离心，去除细胞碎片，将收集的上清通过0.22μm滤器过滤，去除大分子蛋白及囊泡；

4)将过滤后的上清至于100KD的超滤管中，离心5000g，30min，收取上层浓缩液；

5)将浓缩液按2：1的体积比加入外泌体提取试剂TotalExosomeIsolation^TMreagent，充分混匀，4℃孵育过夜，10000g离心60min，沉淀即为外泌体，加入PBS重悬，备用。

结果发现：在DFCs分离培养3天后，细胞开始从组织块中缓慢爬出，爬出的细胞以组织为中心呈放射状向周围排列，长梭形，胞体饱满，偶有散在上皮团从组织从分离，10d后大部分的细胞已分离爬出，组织块间爬出的细胞相互汇合，达培养瓶的60％-70％，如图1A所示。

实施例2

本实施例公开了DFCs表面标记分子的测定试验。

1)选用P3代的DFCs，消化为单细胞悬液(1*10⁶/ml)，1000rpm/5min离心，去除原培养基，用含2％FBS的PBS清洗2次；

2)将其分装于5个1.5mlEP管中(1*10⁵/管)，分别加入100μl含有CD31、CD34、CD73、CD90、CD106 1μl抗体的含2％FBS的PBS；

3)将加入抗体后的细胞混匀，4℃避光孵育30min；

4)1000rpm/5min离心，弃去上清，加入含2％FBS的PBS洗涤2次；

5)加入200μl PBS重悬，过细胞筛(200目)，上流式机(BD Accuri^TM C6)检测。

结果如附图1B所示，DFCs阳性表达CD73、CD90、CD146表面标记物，不表达CD31、CD34，表明本发明的DFCs为间充质来源的干细胞，并非造血来源。

实施例3

本实施例公开了本发明的牙囊干细胞的成骨分化检测实验：

1)将P3代DFCs按照1×10⁵/孔的密度接种在12孔板进行常规培养，每孔加2ml培养基；

2)大约80％汇合时，用成骨诱导液(配方如下表)代替常规培养液进行成骨诱导；

3)成骨诱导液中培养15d后，用PBS冲洗3次，用4％多聚甲醛固定10min，在37℃条件下0.1％的茜素红溶液中孵育30min；

4)用PBS冲洗3次后，在倒置相差显微镜下进行常规观察及照相。

结果如图1C所示，镜下可见钙化结节形成表明本发明的牙囊干细胞具有成骨向分化能力。

实施例4

本实施例公开了本发明的牙囊干细胞的成脂分化检测实验：

2)大约80％汇合时，用成脂诱导液(配方如下表)代替常规培养液进行成脂肪诱导；

3)在成脂肪诱导液中培养4周后，用PBS冲洗3次，用4％多聚甲醛固定10min，在0.3％的油红O溶液中孵育15min；

结果如图1D所示:成脂诱导4周后，油红0染色后有发现有脂滴形成。

表明本发明的牙囊干细胞具有成脂肪分化的能力。

实施例5

不同浓度的LPS对DFCs增殖的影响

1)P3代DFCs以3000cell/well的密度接种于96孔培养，各孔分别加入100μL的、含不同浓度LPS的培养基；其中对照组的培养基不含有LPS，试验组的培养基中LPS的浓度分别为100、150、200、250ng/ml；

3)每孔加入10μL CCK8液体，37℃孵育2h，450nm波长下测OD值。

结果如图2所示：150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml LPS均可以明显促进DFCs的增殖，尤其250ng/ml LPS的促进作用最强。

实施例6

本实施例公开了未经脂多糖处理的牙囊干细胞外泌体及本发明的脂多糖处理后的牙囊干细胞外泌体的鉴定。

本实施例中所用的脂多糖处理后的牙囊干细胞外泌体为按实施例1的方法制成得的外泌体，以下简称为L-D-Exo。

本实施例中所用的未经脂多糖处理的牙囊干细胞外泌体(以下简称为D-Exo)的制备方法与实施例1中的脂多糖处理后的牙囊干细胞外泌体的制备方法相比，直接将P5代DFCs加入含3％无外泌体FBS的a-MEM培养，不加入脂多糖共同培养，其余条件均相同。

1.通过透射电子显微镜(Transmission electron microscope，TEM)观察外泌体的形态特征。

1)分别将L-D-Exo、D-Exo使用俄酸染色3min；

2)滴于铜网上，晾干；

3)透射电镜观察。

结果如图3A所示，L-D-Exo与D-Exo为直径在30-100nm的囊泡样结构，囊泡周缘可观察到脂质双分子层。

2 通过NAT检测外泌体粒径分布。

1)取L-D-Exo沉淀、D-Exo沉淀，分别采用生理盐水稀释溶解后得到L-D-Exo溶液、D-Exo溶液；

2)将L-D-Exo溶液、D-Exo溶液分别滴加于比色皿中，ZetasizerNano ZS检测分析L-D-Exo、D-Exo的粒径大小。

结果如图3B所示，L-D-Exo粒径分布趋势呈单峰状，峰值主要在100nm左右，D-Exo与其大小相似。

3通过蛋白印迹(Western blot)检测外泌体表面标记物

1)分别取50μg L-D-Exo沉淀、50μgD-Exo沉淀，溶解在RIPA裂解缓冲液中；

2)分别将每一种裂解液与蛋白缓冲液按3：1比例混合，得到L-D-Exo浓度为1μg/μl的溶液，以及D-Exo浓度为1μg/μl的溶液；

3)SDS-PAGE电泳

将制胶玻璃板清洗干净，吹干，固定，制胶厚度1.5mm。配置10％分离胶，混合均匀，灌至玻璃板适宜高毒，缓慢加入异丙醇封胶。待胶完全凝固后，倒出异丙醇，用纸吸干残余液体。制备浓缩胶，混匀后灌至分离胶上方，插入梳子，待胶完凝固后拔出梳子。将玻璃板固定至电泳槽中，加入适量1×电泳缓冲液。按照每泳道25μg蛋白上样，样品两侧泳道加入蛋白Marker，其余空白泳道加入平衡缓冲液。保持每泳道上样量一致。按照每块胶20mA恒流电泳90min。

4)转膜

将适宜大小的PVDF膜及转膜使用的海绵和滤纸浸泡甲醇10min后，再浸泡于转膜液中。取下玻璃板，保留胶的有效部分，将转膜夹黑极朝下放置，铺海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵、最后闭合转膜夹，注意放膜时需一次性盖在胶上适宜位置并赶走多余气泡。将转膜夹黑极对应黑色电机放入转膜槽内，加入预冷的转膜液，装冰盒，按照200mA恒流转膜90min。

5)免疫杂交

取出PVDF膜，放入清洗干净的抗体孵育盒，加入适量5％脱脂牛奶，室温摇床封闭1h。用1％脱脂牛奶将一抗稀释至说明书推荐浓度。弃去封闭牛奶，加入相应抗体，4℃摇床孵育过夜。回收抗体。TBST清洗PVDF膜2次，每次10min。用1％脱脂牛奶将过氧化辣根酶标记的二抗按1：5000稀释，室温摇床孵育1h。弃去二抗，TBST清洗PVDF膜2次，每次10min。配置显影液，现用现配。将显影液滴加至PVDF膜上，上机显影，采集图像。

Wstern Blot结果如图3C示，提取物强阳性表达囊泡表面标记物CD63和Alix，不表达细胞表面标记物Actin，而细胞的表达结果及表面标记物相反。

进一步比较两种微环境下DFCs外泌体的产量(图3D)发现，采用BCA法测量外泌体中蛋白含量，结果显示经过LPS预处理后的每10⁶个牙囊干细胞能分泌出25.131μg外泌体，显著多于未处理的量17.970μg(p＜0.05)。

实施例7

本实施例考察了不同的比例的透明质酸与PBS溶液对制得的可注射制剂的粘度及弹性模量的影响。

本实施例采用的透明质酸质量浓度为0.2％。

先将L-D-Exo 200μg外泌体溶解在PBS中，将PBS与透明质酸以不同体积比例(0.125；0.25；0.5)混合均匀，得到本发明的可注射制剂。

使用流变仪(HAAKE Vicsotester iQ)在25±2℃下，控制速率CR模式，剪切速率0.01-100(1/s)进行粘度测试；

在25±2℃下，采用流变仪在剪切速率0.0Hz-10Hz下进行频率扫描，以粘性模量G"和弹性模量G'的log值与频率log值绘制坐标图。

测试结果如图4A-4D所示，：随着PBS比例增加，材料的动力粘度降低，说明材料的内摩擦力降低，材料的流动性增加；另外，通过检测材料的弹性模型G'和损耗模量G"，结果显示随着PBS比例增加，材料的G'＜G"，说明材料逐渐呈现出液体特征。

本实验选用的透明质酸(HA)凝胶是一种可以用于治疗牙龈炎含有0.2wt％透明质酸的医用材料，具有很好的可注射性，随着PBS比例增加，材料逐渐呈现液体特征。实际操作时，可根据需要采用相应比例的可注射制剂。

综合考虑混合材料的可注射性及流动性，PBS与透明质酸的体积比为0.125时性能最优。

实施例8

0.2wt％透明质酸凝胶可以缓释D-Exo、L-D-Exo试验

1.缓释出的D-Exo浓度的测定

1)将0.2wt％透明质酸凝胶与200μg D-Exo/L-D-Exo(溶解在PBS125ul中)按照体积比1：0.125混合均匀后，取300μl上述混合液在Tran-well上室，下室加入300μl PBS，放于孵箱中，分别在2h、1d、2d、3d、5d、7d后收集下室PBS，然后用BCA试剂盒法检测缓释出的D-Exo的蛋白浓度。

2)同法测定缓释出的L-D-Exo的蛋白浓度。

缓释结果如图5示：1周内0.2wt％透明质酸凝胶可以缓释D-Exo、L-D-Exo，其中1d达到缓释高峰。

实施例9

D-Exo、L-D-Exo对大鼠牙周炎的治疗作用

1.大鼠牙周炎模型构建

1)选取10周龄雄性SD大鼠为实验对象，所有的动物实验都得到四川大学小动物保护和使用委员会的批准，并按照动物实验机构的指导方针进行，适应性饲养1周；

2)戊巴比妥(1mg/kg)腹腔注射，待大鼠麻醉后；

3)3-0丝线结扎于大鼠右上颌第二磨牙；

4)3天后对结扎的牙行牙龈卟啉单胞菌33277涂抹，每周涂于丝线周围一次；

5)建模4周后，模型构建成功。

建模操作过程如图6A所示。

甲苯胺蓝染色结果图6B和6C所示：牙周炎大鼠右上第二磨牙牙槽骨的丧失量(釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离)均明显多于健康组(p<0.01)说明牙周炎模型成功建立。

2.试验及分组

1)分组：将建模成功后的牙周炎大鼠拆除丝线后，随机分为5组，每组5只大鼠：具体分组及用药为：

阳性对照组(HL组)：健康的、未建模的大鼠，不施用任何药物；

阴性对照组(PD组)：建立了牙周炎模型的大鼠，不施用任何药物；

PBS组：建立了牙周炎模型的大鼠，施用PBS溶液；

L-D-Exo组：建立了牙周炎模型的大鼠，施用实施例7制得的可注射制剂，其中PBS与透明质酸的体积比为0.125；

D-Exo组：建立了牙周炎模型的大鼠，施用D-Exo+透明质酸凝胶；其中Exo+透明质酸凝胶的制备方法与实施例7的可注射制剂相同，区别在于实施例7采用的为L-D-Exo，本组采用的为D-Exo。

2)PBS组、L-D-Exo组、D-Exo组分别注射100-200μl相应的药物于大鼠患牙的牙周袋内，给药频率为每周一次；

3)给药后第4周和8周，将大鼠安乐死，收取实验区颌骨样本，用4％多聚甲醛固定48h。

3 Micro-CT扫描

扫描区域右上颌磨牙区段。扫描参数如下：扫描分辨率17.75um，X射线源电压65kV，X射线源电流357uA，滤片1mmA1片，曝光时间300ms，扫描旋转步长0.400度，颌骨扫描360度。扫描完成后，采用FDK锥状束方法，使用NRecon软件进行重建，使用Ctan软件进行分泌，DataViewer软件进行图像处理。

MicroCT扫描结果代表性图片如图7，定量分析结果如下表所示：

表1

位置	近中舌根	远中舌根
			HL组	0.39±0.50<sup>**</sup>	0.24±0.01<sup>**</sup>
PD组	0.74±0.13	0.57±0.02
			PBS组	0.76±0.10	0.57±0.07
D-Exo组	0.55±0.12<sup>*</sup>	0.46±0.07<sup>*</sup>
			L-D-Exo组	0.48±0.39<sup>**</sup>	0.42±0.05<sup>**</sup>

如表1所示：L-D-Exo组与D-Exo组的附着丧失量即釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离明显少于PBS组以及阴性对照组(PD组)(p<0.05)；

与PD组相比，L-D-Exo组与D-Exo组约有0.19-0.26mm的骨增量；L-D-Exo组的效果优于D-Exo组。

4 组织学分析4.1样本处理

1)固定和脱钙：颌骨样本取材后，剪刀修剪掉多余肌肉筋膜组织，4％多聚甲醛固定48h后，浸泡于10％EDTA室温脱钙6周，每周更换1次脱钙液；

2)梯度脱水：75％乙醇1h，85％乙醇1h，95％乙醇(1)1h，95％乙醇(2)1h，95％乙醇(3)1h，无水乙醇(1)1h，无水乙醇(2)1h，无水乙醇(3)1h；

3)组织透明：二甲苯(1)30min，二甲苯(1)30min。

4)浸蜡：石蜡(1)1h，石蜡(2)2h，石蜡(3)过夜，次日包埋；

5)包埋：包埋时调整修正后的样本位置，使其舌侧牙面与包埋盒底平行，进行包埋。待石蜡完全凝固后，取下组织块室温保存；

6)切片：切片厚度5um。烤片30min后放入60℃烘箱过夜，取出室温保存。

4.2 HE染色

1)烘片：选取切片置于65℃烘箱中烘烤1h；

2)切片复水：二甲苯(1)10min，二甲苯(1)10min，无水乙醇(1)5min，无水乙醇(2)5min，无水乙醇(3)5min，95％乙醇(1)5min，95％乙醇(2)5min，95％乙醇(3)5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min；

3)染色：将切片晒至稍干，苏木素染45s，流水冲洗，伊红染5min，流水冲洗；

4)脱水：按照以下酒精梯度依次脱水5min，75％，85％，2×95％，2×100％乙醇；

5)透明：二甲苯(1)5min，二甲苯(2)5min；

6)封片：中性树胶滴于样本上，盖玻片封皮，过夜晾干，光学显微镜下采集图片。

HE染色结果如图8A所示，PD组和PBS组可见大量炎性细胞浸润，牙槽嵴尖而窄，边缘多处虫蚀状凹陷，而HL组、D-Exo组和L-D-Exo组未见明显炎性细胞浸润，牙槽嵴宽厚，边缘平滑。

4.3 Masson染色

1)采用Masson三色染色试剂盒对组织片进行染色；

2)烘片、复水步骤同HE染色；

3)铁苏木素A液与B液等体积混合滴于组织上染5min，流水冲洗2min；→1％盐酸酒精分化3s，流水洗5min→丽春红染液染5min，流水冲洗5min→磷钼酸溶液脱色约5min，不洗→甲苯胺蓝染液染5min→1％冰醋酸处理30s→脱水，从85％酒精开始，剩余酒精梯度同HE染色，脱水30s，无水酒精脱2min→组织透明、封片和图像采集步骤同HE染色。

Masson染色如图8B示：在结合上皮下方，与HL组相比，PD组和PBS组胶原变性水肿，排列稀疏，为无序的非结构物质，L-D-Exo组较D-Exo组的牙周胶原纤维排列更加致密有序。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims

1.一种牙囊干细胞外泌体，其特征在于，所述外泌体经脂多糖刺激处理。

2.根据权利要求1所述的一种牙囊干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：收集P2-P10代中的任意一代牙囊干细胞，加入脂多糖共同培养后，采用外泌体提取试剂提取，获得所述外泌体；优选为P3-P6代中的任意一代，更优选为P5代。

3.根据权利要求2所述的一种牙囊干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述牙囊干细胞与脂多糖共同培养时，每10ml培养基中，牙囊干细胞为1×10⁵～1×10⁷个，培养基中脂多糖浓度为100～250ng/ml。

4.根据权利要求2或3所述的一种牙囊干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤4.将步骤3所得滤液进行超滤浓缩，收集浓缩液；

5.根据权利要求2或3所述的一种牙囊干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，还包括牙囊干细胞的分离、培养。

6.根据权利要求5所述的一种牙囊干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述分离、培养牙囊干细胞的具体操作为：

S2.将所述牙囊组织置于含双抗的PBS中浸泡，PBS洗净后，剔去牙体硬组织后，再剪碎；

7.权利要求1所述的外泌体在制备治疗牙周炎药物、或/和促进牙周膜干细胞的成骨分化药物、或/和促进牙周组织再生药物中的应用。

8.一种可注射的药物组合物，其特征在于，包括透明质酸、以及权利要求1所述的牙囊干细胞外泌体。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中牙囊干细胞外泌体的含量为200μg/ml-2000μg/ml，透明质酸的质量含量为0.01-0.05％。

10.权利要求9所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将牙囊干细胞外泌体溶解于PBS中，再与透明质酸溶液混合均匀，即得；

所述PBS溶液与透明质酸溶液的体积比为1：0.125-0.5；优选为1：0.125；

所述透明质酸溶液的质量浓度为0.1-0.5％；优选为0.2％。