CN113318274B - 一种水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种水凝胶及其制备方法和应用。一种水凝胶，其原料包括明胶、纤维蛋白原、凝血酶和牙髓间充质干细胞的外泌体。本方案的水凝胶可更有效的促进骨髓间充质干细胞的迁移、增殖、基质合成及组织融合。本方案可以解决现有的工程化牙髓组织构建体中的牙髓间充质干细胞的活性不能满足应用需求的技术问题。负载牙髓干细胞外泌体的纤维蛋白/明胶复合水凝胶作为支架材料具有良好的生物相容性，并可促进牙髓再生，在牙髓组织工程中具有良好的应用价值。

Description

一种水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

牙髓作为牙齿的重要组成部分，在形成牙本质、营养、感觉以及防御方面起了重要作用。牙髓炎及根尖周炎是口腔科常见的疾病，常表现为牙髓不可逆性的炎症以及根尖周组织的破坏，有时伴随剧烈的疼痛，极大地影响患者的生活质量。若牙髓根尖周炎发生在儿童及青少年发育中的年轻恒牙，情况则会更加棘手，其会导致牙齿停止发育，牙根短小，根管壁薄弱，根尖孔粗大。目前，根管治疗是临床上解决牙髓根尖周疾病最有效的治疗手段,即彻底清除感染坏死的牙髓组织，同时扩大成形根管系统，经过诊间封药控制炎症后严密充填根管避免再感染。虽然根管治疗术后患牙得以保留，然而随着治疗过程对牙本质的切削以及天然牙髓的丧失，保留的牙齿感觉功能消失，承受咬合力时折断等风险加大，这些问题促使我们寻求一种可以维持牙髓活力的治疗方法来替代传统的根管治疗。

随着牙髓组织工程的发展，以再生的牙髓样组织来替代感染坏死的牙髓，从而最大限度的保留牙齿的天然活力以及促进年轻恒牙的继续发育，这一尝试为牙髓根尖周疾病的治疗带来了新的可能。牙髓组织工程通过种子细胞，联合生物活性分子负载到支架上，形成工程化牙髓组织构建体，移植到根管内以实现牙髓组织再生。由于牙髓间充质干细胞(dental pulp stromal cells,DPSCs)具有多向分化的能力，大量基于牙髓间充质干细胞的牙髓组织工程研究展现出了较大的发展前景。虽然干细胞治疗具有一定优势，但是这种方法仍然存在一定局限，例如，由于根管腔十分狭窄，四周被坚硬的牙本质包裹，周围组织的血供和氧气难以扩散到根管内，致使移植的细胞难以在根管内长期存活。另外，干细胞的免疫原性也是一个潜在的风险，由于增殖能力的限制，干细胞长期培养的可能性亦受到诸多限制。亟需研究获得一种能够增加牙髓间充质干细胞增殖和迁移活性的方法，从而提高工程化牙髓组织构建体在牙髓组织再生中的功效。

发明内容

本发明意在提供一种水凝胶，以解决现有的工程化牙髓组织构建体中的牙髓间充质干细胞的活性不能满足应用需求的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种水凝胶，其原料包括明胶、纤维蛋白原、凝血酶和牙髓间充质干细胞来源的外泌体。

采用上述技术方案的原理以及有益效果：

纤维蛋白是从动物蛋白质来源的天然支架材料，有较好的机械和理化性能，可以作为细胞和信号分子的有效载体，以水凝胶形式为细胞黏附提供环境，并调节细胞生长的分化。明胶则是胶原蛋白水解产物，属于大分子蛋白质。在纤维蛋白和明胶形成的支架上加载外泌体，为细胞生长提供信号分子。对比单独明胶或者纤维蛋白支架，或者不加载外泌体，本方案的水凝胶可更有效的促进骨髓间充质干细胞的迁移、增殖、基质合成及组织融合。在本方案中，采用纤维蛋白/明胶复合水凝胶支架材料负载牙髓干细胞来源外泌体(dental pulp stem cells-Exosome，DPSCs-Exo)，形成水凝胶。

发明人通过体外实验探究了负载外泌体的水凝胶促进细胞迁移生长的情况，体内实验研究了异位根管内牙髓样组织再生的可能性。live/dead实验表明在纤维蛋白/明胶水凝胶支架上负载牙髓干细胞来源外泌体对细胞的生长有正向促进作用(P＜0.001)。Transwell实验表明纤维蛋白/明胶水凝胶负载外泌体可以有效促进细胞的迁移(P＜0.0001)。qPCR结果显示负载外泌体的纤维蛋白/明胶支架上牙髓细胞VEGF，DMP1，CXCR4的表达量较对照组明显上升，SDF1表达下降(P＜0.05)。表明牙髓干细胞来源外泌体可以在纤维蛋白/明胶三维环境下促进牙髓细胞成血管、成牙本质及细胞迁移，相关基因表达量上升状态。在裸鼠背部皮下植入含或不含外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶材料的牙根段，8周后取材切片观察，两组均有类牙髓样软组织长入根管内，取出新生软组织HE染色，含外泌体组显示有更加丰富的富含红细胞的小血管结构。上述实验都说明了，本方案的水凝胶具有促进牙髓间充质干细胞增殖、迁移，促进血管生成和促进成骨分化的作用。

综上所述，负载牙髓干细胞外泌体的纤维蛋白/明胶复合水凝胶作为支架材料具有良好的生物相容性，能促进细胞迁移，并实现异位根管内组织新生，在牙髓组织工程中对促进牙髓再生具有潜在的应用价值。

进一步，所述外泌体由如下方法制备获得：使用α-MEM完全培养基培养P3-P7代牙髓间充质干细胞，然后将α-MEM完全培养基更换为无血清α-MEM培养基，培养后收集上清液；使用超速离心法从所述上清液中收集所述外泌体。

采用上述技术方案，P3-P7代牙髓间充质细胞具有良好的增殖活性和分泌功能，适合于作为分泌和制备外泌体的细胞。先使用带有血清的培养基培养细胞，使得细胞充分增殖并维持良好状态，以备后续的外泌体分泌。然后使用不带有血清的培养基培养细胞，一是可以刺激细胞释放外泌体，二是排除血清中本身存在的外泌体。

进一步，水凝胶的原料还包括牙髓间充质干细胞。

采用上述技术方案，在组织工程支架上接种牙髓间充质干细胞(种子细胞)，是牙髓组织修复的物质基础。

进一步，在所述水凝胶中，所述纤维蛋白原的浓度为5mg/mL，明胶的质量分数为4％，凝血酶的终浓度为0.5U/mL。

采用上述技术方案，当纤维蛋白原浓度为5mg/mL，明胶浓度为4％，凝血酶浓度为0.5U/mL时，结胶时间为6min，满足应用需求。纤维蛋白水凝胶在作为细胞载体支架，在浓度为5mg/mL时得到更好的剪切模量和刚度。明胶在较低含量时(例如4％)具有较好的杨氏模量。

进一步，在所述水凝胶中，以蛋白浓度计，所述外泌体的终浓度为0.1mg/ml；所述牙髓间充质干细胞的终浓度为3×10⁴个/mL。

采用上述技术方案，上述浓度的外泌体可为牙髓间充质干细胞提供足够的生长信号，促进牙髓间充质干细胞生长、增殖、迁移和分化。上述浓度的牙髓间充质干细胞可为本组织材料提供足够的种子细胞。

进一步，一种水凝胶的制备方法，将明胶溶液、纤维蛋白原溶液、凝血酶工作液、DPSCs外泌体悬液和DPSCs混悬液混合，结胶后获得水凝胶。

采用上述技术方案，适用上述原材料混合制备具有牙髓修复功能的组织材料，可有效实现牙髓再生。利用扫描电镜观察了纤维蛋白/明胶水凝胶的形貌结构，证明其有利于细胞生长三维结构。纤维蛋白/明胶水凝胶上负载牙髓干细胞，发现纤维蛋白/明胶水凝胶与外泌体和牙髓间充质干细胞之间的生物相容性良好，并且牙髓间充质干细胞可以在孔隙内三维生长，呈长梭形，边缘伸展黏附在纤维丝上，生长状态良好；外泌体呈圆球形粘附在纤维表面，均匀分散，可在支架材料上稳定吸附。

进一步，在所述水凝胶上方加入α-MEM完全培养基。

采用上述技术方案，在水凝胶上加入α-MEM完全培养基可以为细胞生长维持良好环境和营养状态。

进一步，明胶溶液、纤维蛋白原溶液、凝血酶工作液、DPSCs外泌体悬液和DPSCs混悬液的体积比为500:250:50:100:100；所述明胶溶液中明胶的质量分数为8％，所述纤维蛋白原溶液中纤维蛋白原的浓度为20mg/mL，所述凝血酶工作液中凝血酶的浓度为10U/mL；以蛋白浓度计，所述DPSCs外泌体悬液中外泌体的浓度为1mg/ml；所述DPSCs混悬液中牙髓间充质干细胞的浓度为3×10⁵个/mL。

采用上述技术方案，可保证纤维蛋白原终浓度为5mg/mL，明胶终浓度为4％，凝血酶终浓度为0.5U/mL。在上述参数范围内，结胶时间为6min，满足实验需求。作为组织工程材料，临床上要求水凝胶结胶有一定的时间，方便医师操作，又不可过久影响患者就诊体验，以5-10min为宜。采用上述浓度和用量的DPSCs外泌体悬液，可为牙髓间充质干细胞提供足够的生长信号，促进牙髓间充质干细胞生长、增殖、迁移和分化。上述用量的牙髓间充质干细胞可为本组织材料提供足够的种子细胞，是牙髓修复的基础。

进一步，一种水凝胶在制备牙髓组织构建体中的应用。

采用上述技术方案，纤维蛋白/明胶水凝胶负载外泌体和牙髓间充质干细胞的组织材料可以应用于牙髓组织工程中，实现牙髓再生。在裸鼠背部皮下植入含或不含外泌体的负载牙髓间充质干细胞的水凝胶材料的牙根段，8周后取材切片观察，两组均有类牙髓样软组织长入根管内，取出新生软组织HE染色，含外泌体组显示有更加丰富的富含红细胞的小血管结构。实验证明，本方案构建的水凝胶可以有效促进牙髓再生，可以作为一种牙髓组织构建体应用到牙髓修复的实践操作中。在本方案中，牙髓组织构建体具体是指：牙髓组织工程通过种子细胞，联合生物活性分子负载到支架上，形成工程化牙髓组织构建体，移植到根管内以实现牙髓组织再生。

进一步，一种水凝胶在制备组织工程支架上的应用。

采用上述技术方案，纤维蛋白/明胶形成的水凝胶可以为细胞提供三维生长的环境，同时可以携带信号分子，有良好的细胞相容性，极小的细胞毒性，是组织工程支架材料的优良选择。在纤维蛋白/明胶支架上负载DPSCs外泌体对牙髓间充质干细胞的生长活力有正向促进作用，同时可以有效促进细胞的迁移，促进牙髓细胞成血管，成牙本质及促迁移等相关基因表达上升，可以实现体内异位根管组织新生，提示负载DPSCs外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶可能在牙髓组织工程中有潜在的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1的DPSCs形态学观察结果。

图2为本发明实施例1的流式细胞术鉴定DPSCs表面标记物结果。

图3为本发明实施例1的蛋白印迹法鉴定DPSCs-Exo标记蛋白CD63、CD9的结果。

图4为本发明实施例1的NTA检测外泌体粒径分布(横坐标：粒径大小纵坐标：粒子数)。

图5为本发明实施例1的透射电镜观察外泌体形态(白色箭头指示外泌体，呈双层膜囊泡结构)。

图6为本发明实施例2的纤维蛋白/明胶水凝胶的三维结构观察结果。

图7为本发明实施例2的负载有细胞和外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶的三维结构观察结果。

图8为本发明实施例2的live/dead实验分析结果。

图9为本发明实施例3的DPSCs-Exo染色示踪实验结果。

图10为本发明实施例3的live/dead染色实验检测细胞活力的结果。

图11为本发明实施例3的Transwell实验检测细胞迁移能力的结果。

图12为本发明实施例3的qPCR实验检测基因表达的柱状统计图。

图13为本发明实施例3的裸鼠背部皮下移植牙根段实验过程图。

图14为本发明实施例3的根管新生软组织HE染色结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1：DPSCs及DPSCs-Exo的分离培养及鉴定

DPSCs是牙髓组织中主要的间充质干细胞，形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。牙髓间充质干细胞外泌体(DPSCs-EXO)为双层脂质膜结构。本实施例通过从人离体牙中分离培养牙髓干细胞，并收集提取其外泌体，完成相关鉴定，为后续功能研究提供基础。

1.材料

本研究选用了牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)，受试者纳入标准为：①12到20岁之间因正畸治疗需要拔除的前磨牙的年轻患者；②全身情况良好，无系统性疾病、无恶性肿瘤、无急慢性传染病及血液系统疾病；③牙齿无明显龋坏、无牙髓病变及根尖周病变。排除标准为①患有系统性疾病、恶性肿瘤、急慢性传染病及血液系统疾病；②需拔除的牙齿有明显龋坏、牙髓病变或者根尖周病变；③根管治疗后的牙。

主要实验仪器和试剂包括：倒置荧光显微镜(日本Nikon)、普通光学显微镜(日本Nikon)、培养箱(美国Thermo Scientific)、流式细胞仪(美国BD influx)、纳米颗粒追踪分析仪(德国ZetaView)、透射电子显微镜(日本JEOL JEM-1400PLUS)、流式抗体(美国赛默飞)、BCA试剂盒(中国碧云天)、兔抗人CD9,CD63抗体(中国Bioworld)、山羊抗兔IgG/HRP抗体(美国ThermoFisher)。

2.实验方法

2.1原代牙髓干细胞的分离和培养

①收集新鲜拔除的离体正畸牙，浸泡在含有5％双抗的PBS中，4℃运输保存；

②高速涡轮手机从釉牙骨质界处环颈部一圈磨离体牙，直到即将磨断时停止，保留最里面一层薄牙本质层，在超净台内，轻轻从牙齿颈部掰断，取出牙髓组织置于EP管中，EP管预先装好1mLα-MEM完全培养基，使用无菌剪刀剪碎组织；

③以1200r/min离心3min,弃上清液；

④加入1mL I型胶原酶，置于金属浴中在37℃消化40min；

⑤以1000r/min离心5min，移液枪小心弃掉上清，保留组织，加入适量血清；

⑥用巴氏管将其均匀涂布在T25细胞培养瓶底部；

⑦正面加入6mL完全培养基，翻转放置T25细胞培养瓶，使涂布面在上，置于37℃、5％CO₂的孵箱中培养；

⑧24h后轻轻翻转T25瓶，每3天更换培养基，当细胞密度接近80％-90％时细胞进行传代，第3代到第7代细胞用于实验处理。

2.2牙髓干细胞的流式细胞仪鉴定：按试剂盒说明书使用CD73，CD90，CD31，CD45，NESTIN抗体，对获得的牙髓间充质干细胞进行流式检测。

2.3牙髓细胞来源外泌体的提取

①不含血清的培养基的制备(去除血清中外泌体干扰，即无血清α-MEM培养基)：在α-MEM培养基中加1％双抗,混匀,4℃保存,用于外泌体提取的细胞培养上清收集。

②制备DPSCs上清液：选取状态良好的3-7代DPSCs，观察细胞生长至75％左右时，PBS洗一遍，去除原培养基血清干扰，更换为不含血清培养基(配制方法如上)培养24h，收集培养上清液，短期储存于-80℃。

③提前一天取出-80℃冻存的上清液，待完全融化后按照如下方法离心(超速离心法)：

4℃，300g离心10min，弃上清；4℃，2000g离心10min，弃上清；4℃，10000g离心30min，弃上清；4℃，100000g离心70min，轻弃上清，保留管底沉淀，PBS重悬；4℃，100000g离心70min，弃上清，100μL PBS重悬，-80℃保存。

2.4WB鉴定外泌体标记性蛋白

(1)提取外泌体中总蛋白

取200μL提取的DPSCs-Exo和PBS,按Exo:Ripa＝2：1(PBS:Ripa＝2：1)加入Ripa裂解液提取外泌体蛋白,冰上裂解30min,每五min振荡器震荡使外泌体充分裂解,14000g离心10min后收集上清液于新的EP管内；按照蛋白样品：蛋白上样缓冲液(5×)＝4：1的比例加入5×蛋白上样缓冲液,金属浴10min同时震荡，使其充分变性,-20℃保存。

(2)BCA法进行蛋白浓度的检测

本实验使用蛋白定量试剂盒(Beyotime)，按照说明书进行如下操作：

②制0.5mg/mL的蛋白标准液,-20℃保存。

②根据样品数量,A试剂∶B试剂按50：1配制适量BCA工作液,充分混匀；

③在96孔板的标准品孔中按照0、1、2、4、8、12、16、20μL的体积滴入蛋白标准溶液，加去离子水补足到20μL。

③5μL DPSCs-Exo蛋白样品到96孔板中,三组复孔,加ddH₂O补足到20μL，避免气泡；

⑤每孔加入200μL BCA工作液,37℃摇床孵育20-30min；

⑥测定562nm波长下OD值,绘制标准曲线,得出相应的公式,根据公式计算出相应样品蛋白浓度；

⑦调整蛋白浓度为1mg/mL，用于后续实验。

然后按照常规WB方法进行外泌体的蛋白检测。

2.5NTA鉴定外泌体

纳米颗粒跟踪分析可以对流体样本中纳米级范围内的颗粒进行分析和追踪，可以统计样本中颗粒粒径大小浓度等，目前广泛应用于外泌体研究领域。

2.6透射电镜观察外泌体

在对外泌体的研究中，透射电镜可以清楚的观察到外泌体形态，具体方法如下：

新鲜提取外泌体，稀释500倍后冰上转运；将稀释到合适倍数的外泌体滴到电镜铜网状栅上，等待10min；在铜网上滴加2％的醋酸双氧铀，等待3min，去离子水清洗两次，浮液可用滤纸小心吸掉，自然晾干；上机，选取合适的视野及倍数进行拍照。

3.实验结果

3.1DPSCs形态学观察

从人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，显微镜下见细胞第3天开始贴壁生长，围绕组织块出现集落式生长，细胞较大，形态呈长梭形，类似成纤维细胞样(图1A，第3天，原代DPSCs在组织块周围放射状生长，呈长梭形(×40))；第7天细胞持续增殖，组织块中心细胞密集，细胞呈放射状向外生长(图1B，第7天，原代DPSCs持续增殖生长(×40))；第10天消化传代后，细胞在培养皿表面均匀分散生长(图1C，经消化传代后，第1代DPSCs均匀分散生长(×100))。

3.2DPSCs流式细胞仪检测

对DPSCs进行流式细胞仪检测，选取表面分子标记物CD31，CD45，CD73，CD90，NESTIN，结果显示，如图2，CD73和CD90表达为阳性，CD31,CD45，NESTIN表达为阴性。在图2中流A为白细胞标记物CD31阴性表达；B为神经细胞标记物NESTIN阴性表达；C为造血细胞标记物CD45阴性表达；D-E为间充质干细胞标记物CD73，CD90阳性表达。

3.3蛋白印迹法鉴定外泌体标记蛋白

本研究选取外泌体表面特异性标记蛋白CD9，CD63进行检测。设置PBS为对照组，结果显示外泌体的CD9，CD63呈明显阳性，对照组为阴性(图3)，表明本实验通过超速离心法提取的外泌体有效。

3.4纳米颗粒跟踪分析检测外泌体

粒径分析结果显示：样本中91.59％粒径分布在30-150nm之间，平均粒径为84.06nm，符合外泌体特征(图4)。

3.5透射电镜观察外泌体

透射电镜观察外泌体，结果显示提取的外泌体直径在30-150nm,呈典型的双层膜囊泡结构，符合外泌体形态特征(图5)。

4.结果分析

牙髓是多能颅神经嵴细胞的间充质衍生物，在胚胎发育早期迁移至第一和第二腮弓。在本部分实验中，我们从拔除的正畸牙里提取牙髓组织，经过分离培养，生长的细胞呈长梭形，形态均一。使用流式细胞仪进行鉴定，结果显示CD90，CD73呈强阳性表达，CD31，CD45，NESTIN阴性表达。其中，CD90，CD73是间充质干细胞表面标志物，其表达阳性，说明牙髓组织中分离出的细胞符合间充质干细胞的特性。CD45广泛存在于白细胞表面，CD31是血管内皮细胞的标记物，NESTIN是神经干细胞标记物，本实验中分离的细胞上述标记物表达极低，呈阴性，表明牙髓组织中分离出的细胞非白细胞，血管内皮细胞或神经细胞来源。从形态学和流式细胞术结果来看牙髓组织分离出的细胞为间充质来源干细胞，符合以往文献报道。本实验分离提取的牙髓干细胞结果可靠，可以作为下一步实验的基础。

外泌体是活细胞分泌的双层膜状小囊泡，其直径约为30-150nm，广泛存在于各种生物体液中，参与细胞间信息传递，靶向发挥生物学功能。目前常用的提取外泌体的方法为超速离心法和试剂盒法(沉淀法，膜亲和柱法)，有相关研究证明，两种方法均能有效提取外泌体，但两者外泌体所含RNA略有差异，前者以microRNA为主，后者所含RNA以piRNA为主。同时，与试剂盒法相比，超速离心法虽耗时较长，但价格相对低廉，且提取的外泌体杂质较少，更适宜作为生物学研究，目前广泛应用于外泌体研究领域。故在本实验中，为得到浓度更高的外泌体，保证后续实验的可靠性，我们选择使用超速离心法从牙髓干细胞培养上清液中提取外泌体。取培养3至7代的牙髓干细胞，此时细胞生长处于对数期，增殖活力和细胞干性均较好，最大限度保证了DPSCs的良好状态，收集培养上清液之前先使用不含血清培养基培养24h，去除血清中外泌体的干扰，以期得到纯度更高的牙髓干细胞外泌体。

目前对于外泌体的鉴定多从其形貌及粒径大小，表面标志蛋白等方面进行。本部分实验通过透射电镜对外泌体形貌进行观察，呈椭圆形双层膜状小囊泡，内含丰富物质，同时观察到，提取的外泌体形态大小较均一，直径多在30-150nm之间符合以往研究对外泌体的认知。利用NTA粒径分析对提取的外泌体粒径大小进行分析，符合外泌体30-150nm大小的粒子占91.59％，平均粒径为84.06nm，符合外泌体特征，且纯度较高。Western Blot对外泌体表面标志蛋白进行鉴定，与对照组PBS相比，外泌体组的CD9和CD63表达均呈明显阳性，表明我们超速离心提取的外泌体有效。

综上，本实验成功从人的离体牙中分离培养出牙髓干细胞，细胞类似成纤维状细胞，呈长梭形，经流式细胞仪检测CD73，CD90阳性表达，符合牙髓间充质干细胞特性，为下一步实验奠定基础。继而，我们从培养的牙髓干细胞中通过超速离心法提取外泌体，透射电镜观察呈双层膜状小囊泡，NTA显示粒径分布在30-150nm之间，Western Blot提示CD9和CD63呈阳性表达，均表明我们提取的外泌体可靠稳定，可以作为后续研究使用，为研究牙髓干细胞来源外泌体的作用和功能提供了可靠的保障。

实施例2：纤维蛋白/明胶水凝胶的制备

1.材料与器材

牛纤维蛋白原(中国索莱宝)、凝血酶(中国索莱宝)、明胶(美国Sigma)、PBS(美国Hyclone)、Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒(中国碧云天)、扫描电子显微镜(日本Hitachi-SU8010)、激光共聚焦显微镜(德国Leika)。

2.纤维蛋白/明胶水凝胶制备方法

(1)储存液配制：

纤维蛋白原溶液：精确称量20mg纤维蛋白原粉末溶于1mL PBS，玻璃棒搅拌，待其充分溶解，即为20mg/mL纤维蛋白原溶液，4℃短期储存备用。明胶溶液：精确称量0.8g明胶粉末溶于10mL PBS，玻璃棒搅拌，待其充分溶解，即为质量分数8％明胶溶液，4℃短期储存备用。凝血酶溶液：按照说明书，1000U凝血酶冻干粉溶于1mL生理盐水，充分溶解搅拌，配制成1000U/mL的储存液，分装保存于-20℃。

(2)不同配比纤维蛋白/明胶水凝胶的制备

本实验设置纤维蛋白原终浓度为5mg/mL，明胶为4wt％，设置凝血酶浓度梯度分别为0.1U/mL、0.5U/mL、1U/mL、2U/mL，观察不同凝血酶浓度下复合水凝胶的结胶时间，探索最适合的终浓度。

各组分准备：取各组分储存液，纤维蛋白原溶液置于37℃水浴锅10min，明胶溶液(呈水凝胶状态)于60℃水浴锅加热至完全恢复为液体，凝血酶溶液于37℃水浴锅待其完全融化，超净台下将凝血酶溶液(储存液1000U/mL)稀释为10U/mL(凝血酶工作液)备用。

分别按以下配比制备水凝胶：

①明胶溶液500μL，纤维蛋白原溶液250μL，凝血酶工作液10μL，PBS 240μL；

②明胶溶液500μL，纤维蛋白原溶液250μL，凝血酶工作液50μL，PBS 200μL；

③明胶溶液500μL，纤维蛋白原溶液250μL，凝血酶工作液100μL，PBS 150μL；

④明胶溶液500μL，纤维蛋白原溶液250μL，凝血酶工作液200μL，PBS 50μL；

各组分充分混匀，室温下静置观察结胶时间。选择最佳组分配比用于后续实验。

3.负载牙髓干细胞和外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶

负载细胞的纤维蛋白/明胶水凝胶：胰酶消化细胞，重悬计数，调整密度至3×10⁵个/mL，制备细胞混悬液备用，获得DPSCs混悬液。制备负载牙髓干细胞的纤维蛋白/明胶水凝胶的具体配比如下：明胶溶液500μL，纤维蛋白原溶液250μL，凝血酶工作液50μL，DPSCs混悬液200μL。将上述成分充分混匀后，铺板于12孔板静置，待完全结胶后每孔加入约1mLα-MEM完全培养基，37℃，5％CO₂，培养24h。弃去培养基，PBS洗两遍，固定后待检测。其中，α-MEM完全培养基是指用α-MEM配置含10％的FBS、1％的双抗(青链霉素双抗)的完全培养基。

负载外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶：制备负载外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶。具体配比如下：明胶溶液500μL，纤维蛋白原溶液250μL，凝血酶工作液50μL，DPSCs外泌体200μL(按照实施例1中“2.3牙髓细胞来源外泌体的提取”部分的方法提取获得，DPSCs外泌体的含量为1mg/mL。充分混匀后铺板于12孔板静置，待完全结胶后每孔加入约1mLα-MEM完全培养基，放入细胞培养箱中，37℃，5％CO₂条件下培养24h。24h后弃去培养基，PBS洗两遍，固定后待检测。

4.扫描电镜观察水凝胶的三维结构

扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)可以观察材料表面微观形貌，本部分实验利用SEM观察水凝胶的三维结构。具体实验方法如下：

CO₂临界点干燥：样品用2.5％的戊二醛固定，室温2h。PBS洗3次，乙醇脱水：20％，40％，60％，80％，100％，100％，100％，每次10min。样品转入临界点干燥仪样品室。运行临界点干燥程序。充入液体CO₂；置换乙醇，20－60min；升温升压达到CO₂临界点，维持4min；缓慢释放CO₂，保持温度和压力，大约30min。最后取样。然后，喷金，上机，设置电压15.0kV，观察。

5.live/dead实验分析纤维蛋白/明胶水凝胶的细胞相容性

本部分实验利用Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒对纤维蛋白/明胶水凝胶支架行live/dead实验，检测其细胞相容性。具体步骤如下：

(1)胰酶消化细胞，重悬计数，调整密度至3×10⁵个/mL，制备细胞混悬液备用。制备负载牙髓干细胞的纤维蛋白/明胶水凝胶。具体配比如下：Gelatin+500μL，Fibrin+250μL，Thrombin+50μL，DPSCs混悬液+200μL。充分混匀后铺板于激光共聚焦细胞培养皿静置，待完全结胶后每孔加入约1mLα-MEM完全培养基培养。每24h换液，培养3天。

(2)Calcein AM/PI检测工作液的配制:按照说明书，Calcein AM(1000X)+1μL，PI(1000X)+1μL，检测缓冲液+1mL，得到Calcein AM/PI检测工作液1mL。

(3)染色：取培养3天的负载牙髓干细胞的纤维蛋白/明胶水凝胶，弃去培养基，PBS洗两遍，去除酚红和血清的干扰。加入1mL Calcein AM/PI检测工作液，37℃避光孵育30min。

(4)检测：孵育结束后，在激光共聚焦显微镜下观察染色效果(Calcein AM为绿色荧光；PI为红色荧光)，拍照。

6.实验结果

(1)不同浓度纤维蛋白/明胶水凝胶结胶时间对比

在室温下，当凝血酶浓度为0.5U/mL时，结胶时间为6min，满足需求；当凝血酶浓度为0.1U/mL，结胶时间为13min；当凝血酶浓度分别为1U/mL和2U/mL时，分别在2min和30秒之内迅速结胶，均不利于本实验研究(表1)。本方案的水凝胶用于修复牙髓组织，因此，临床上要求水凝胶结胶有一定的时间，方便医师操作，又不可过久影响患者就诊体验，以5-10min为宜。

表1：不同凝血酶浓度下纤维蛋白/明胶复合水凝胶结胶时间对比

凝血酶浓度	0.1U/ml	0.5U/ml	1U/ml	2U/ml
					结胶时间/min	13	6	2	＜0.5

(2)扫描电镜观察纤维蛋白/明胶水凝胶的三维结构

纤维蛋白/明胶水凝胶经CO₂临界点干燥后，扫描电子显微镜观察：可见水凝胶呈疏松多孔的纤维网状，结构均匀一致(图6)。在图6中，电压15.0kV，放大倍数为(A)×1.00k、(B)×2.00k、(C)×5.00k。

(3)扫描电镜观察纤维蛋白/明胶水凝胶负载细胞和外泌体

分别在纤维蛋白/明胶水凝胶上负载牙髓干细胞和外泌体，37℃孵育一天固定，CO₂临界点干燥，扫描电子显微镜观察(图7)：牙髓干细胞在水凝胶支架内生长，呈不规则长梭形，细胞边缘伸长在支架材料上黏附，穿过水凝胶材料内部孔径呈现三维生长(图7A-C)。外泌体颗粒约为100nm大小，粘附在水凝胶材料表面，均匀分布，呈现圆球形(图7D-E)。在图7D-F)，电压15.0kV，放大倍数为(A)×1.00k、(B)×2.00k、(C)×5.00k、(D)×20.00k、(E)×40.00k、(F)×60.00k。

(4)live/dead实验分析纤维蛋白/明胶水凝胶的细胞相容性

纤维蛋白/明胶水凝胶负载牙髓干细胞后培养，在第三天行live/dead细胞活力染色，激光共聚焦显微镜下观察(图8)：活细胞呈绿色荧光广泛分布，死细胞呈红色荧光极少数点状分布。

7.结果分析

本部分实验首先根据水凝胶结胶时间的差异选择构建了最适合本研究的水凝胶浓度配比，然后以此为基础，探索该纤维蛋白/明胶水凝胶的三维结构，作为支架负载细胞及外泌体情况及它的细胞相容性，以证实该复合水凝胶可作为牙髓组织工程的良好支架材料。

作为支架材料，我们期望水凝胶可以携带细胞或信号分子快速结胶作用于指定部位，同时，又需要有一定的时间供研究者或临床工作者操作，因此我们预期水凝胶结胶时间以5-10min为宜。结胶时间受多种条件影响，包括温度，材料浓度，酸碱度等等。明胶可在35-40℃下缓慢结胶，纤维蛋白原通过凝血酶作用形成纤维蛋白而结胶，在两种材料混合体系下，我们可通过调整加入凝血酶的浓度来控制结胶时间。结果表明：室温下，当控制终体系纤维蛋白原浓度为5mg/mL，明胶浓度为4％时，凝血酶浓度控制在0.5U/mL可控制结胶时间在5-8min，满足下一步实验需求。

理想的组织工程支架材料应当满足以下特点：①良好的生物相容性和安全性；②可降解，无毒性，降解产物无害；③有合适孔隙的疏松多孔结构，有利于细胞黏附、培养及代谢产物的运输；④有利于细胞黏附的理想表面形态。因此我们利用扫描电子显微镜对纤维蛋白/明胶水凝胶的形貌进行了观察，结果显示该水凝胶具有均匀的疏松多孔的纤维网状结构，这种结构可以给细胞提供三维生长的环境，有利于细胞的黏附及代谢产物运输。为了进一步验证细胞在纤维蛋白/明胶水凝胶上的生长情况，我们在水凝胶上负载了牙髓干细胞，扫描电镜观察，可见牙髓干细胞边缘伸展黏附在支架上，在孔隙内呈长梭形三维生长，这一结果再次印证该复合水凝胶材料可以提供有利于细胞黏附的理想表面形态。除了利于细胞黏附生长以外，支架材料还需要可以负载信号分子到特定部位发挥生物学作用，因此，我们将外泌体负载到纤维蛋白/明胶水凝胶上，扫描电镜观察到外泌体颗粒呈圆球形紧密附着在材料表面，这表明该支架材料可作为负载外泌体实现牙髓组织工程的良好载体，为深入的研究奠定了基础。

另外，良好的生物形容性和安全性对应用于组织工程的支架材料来说尤为重要。纤维蛋白目前在临床已有大量应用，其来源于血浆，因此有极佳的生物相容性；明胶与胶原有同源性，属于蛋白质大分子，从材料来源上来看，纤维蛋白/明胶复合水凝胶应当具有极佳的生物相容性。对此我们设计实验加以验证，我们在纤维蛋白/明胶水凝胶上负载牙髓干细胞，live/dead染色实验观察其细胞毒性，结果显示：绝大部分细胞为活细胞，呈绿色荧光，极少数细胞为死细胞碎片，呈红色荧光。这表明该复合水凝胶有良好的细胞相容性，极小的细胞毒性，符合组织工程支架材料的要求。

综上所述，纤维蛋白/明胶水凝胶有疏松多孔的网状结构，有利于细胞的黏附伸展及外泌体的黏附，同时又有良好的细胞相容性，无明显细胞毒性，可作为牙髓组织工程的支架材料继续下一步的研究。

实施例3：负载外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶的制备和功能

1.主要材料和设备

α-MEM培养基(美国Hyclone)、链霉素/青霉素(美国Hyclone)、胎牛血清(乌拉圭Lonsera)、胰蛋白酶(美国Hyclone)、PKH26(美国Sigma)、Calcein AM(中国索莱宝)、DiluentC(中国索莱宝)、0.5％BSA(中国索莱宝)、Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒(中国碧云天)、RNA逆转录试剂盒(日本Takara)、PCR反应试剂盒(日本Takara)、PCR引物(日本Takara)。

全自动荧光成像系统(日本Nikon)、倒置荧光显微镜(日本Nikon)、普通光学显微镜(日本Nikon)、荧光定量PCR仪(新加坡BIO RAD)、激光共聚焦显微镜(德国徕卡)、Transwell细胞小室(美国康宁)。

2.实验方法

(1)使用负载外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶培养DPSCs细胞的方法

将明胶溶液500μL，纤维蛋白原溶液250μL，凝血酶工作液50μL，DPSCs外泌体悬液100μL，DPSCs混悬液100μL混合，按照实施例2中“(2)不同配比纤维蛋白/明胶水凝胶的制备”部分的方法配制，获得细胞-外泌体-凝胶混合物。DPSCs外泌体按照实施例1中“2.3牙髓细胞来源外泌体的提取”部分的方法提取获得，经过BCA法蛋白定量调整至1mg/mL。DPSCs混悬液按照实施例2中“3.负载牙髓干细胞和外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶”部分的方法制备获得。牙髓干细胞DPSCs按照实施例1中“2.1原代牙髓干细胞的分离和培养”部分的方法分离获得。将细胞-外泌体-凝胶混合物加入培养容器中，待完全结胶后，获得水凝胶，加入α-MEM完全培养基，获得培养体系，细胞-外泌体-凝胶混合物和α-MEM完全培养基的体积比为1:1。即，在培养孔中加入1ml细胞-外泌体-凝胶混合物，需要加入约1mlα-MEM完全培养基。此部分作为实验组。

作为空白对照，制备了不加入外泌体的凝胶来培养DPSCs细胞，具体过程参照实施例2中“3.负载牙髓干细胞和外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶”部分的方法。

(2)DPSCs-Exo染色示踪实验

提前一天将DPSCs接种于激光共聚焦培养皿；从-80℃冰箱取出冻存的DPSCs-Exo，用100μL PBS进行重悬，将重悬后所得的PBS-Exo溶液与500μL Diluent C混匀；2μL PKH26与500μL Diluent C混匀，将其加入上一步的混合液里,作用4min；使用2mL 0.5％BSA终止染色步骤，作用5min，使用试剂盒将染色后的DPSCs-Exo按流程重新提取出来；将上述步骤PKH26染色的DPSCs-Exo加入提前一天接种的DPSCs细胞中，作用30min；弃掉上述混合培养基,PBS洗三遍，按1:10比例稀释Calcein AM后加入细胞，培养20min；洗去上述混合液，PBS洗3遍，4％PFA固定15min；洗掉固定液，PBS洗三遍，加即用型Hoechst 100μL染核，作用5min；PBS洗三遍，保留部分PBS,进行激光共聚焦拍照。

(3)live/dead实验检测细胞活力

按照本部分(1)的方法获得水凝胶(实验组和对照组)，使用的培养容器为激光共聚焦细胞培养皿，放入细胞培养箱中，37℃，5％CO₂条件下培养。每24hPBS洗两遍，换液，培养3天。

Calcein AM/PI检测工作液的配制：按照说明书，Calcein AM(1000X)+2μL，PI(1000X)+2μL，检测缓冲液+2mL，得到Calcein AM/PI检测工作液2mL。

染色：取培养3天的负载牙髓干细胞的纤维蛋白/明胶水凝胶，弃去培养基，PBS洗两遍，去除酚红和血清的干扰。每皿加入1mL Calcein AM/PI检测工作液，37℃避光孵育30min。

检测：孵育结束后，在激光共聚焦显微镜下观察染色效果(Calcein AM为绿色荧光；PI为红色荧光)，拍照。

(4)Transwell实验检测细胞迁移能力

主要溶液配置：

10％血清α-MEM培养基：10mL FBS+1mL青霉素-链霉素+89mLα-MEM培养基；

1％血清α-MEM培养基：1mL FBS+1mL青霉素-链霉素+98mLα-MEM培养基；

0.1％结晶紫染液：10mg结晶紫粉末+10mL PBS；

24孔板下室铺水凝胶：按照本部分(1)的方法获得不含细胞的水凝胶(实验组和对照组)；铺于下室，待完全结胶后每孔加800μL 10％血清α-MEM培养基。

制备细胞悬液：消化细胞，用含1％血清的培养基重悬，调整细胞密度1×10⁵/mL。

接种细胞：每个小室(上室)加细胞悬液200μL，轻轻置于备好的实验组和对照组的24孔板，动作轻柔，勿产生气泡。37℃培养12h。

结晶紫染色：PBS洗两遍小室，4％PFA固定30min，风干。将小室置于述配制的0.1％结晶紫溶液中等待20min，染色完成后PBS洗掉多余染液，小棉签轻柔擦拭上层未迁移细胞，PBS洗3遍。

观察：体式显微镜下和光学显微镜下分别观察，拍照；随机选择五个视野，计数分析。

(5)qPCR检测基因表达

按照本部分(1)的方法获得水凝胶(实验组和对照组，负载有DPSCs细胞)，铺板于六孔板中三维培养细胞，每天换液，培养5天后收样提取RNA,检测VEGF，DMP1，SDF1，CXCR4等基因表达差异。

引物设计：

人GAPDH引物序列：

Forward:5’-CCACTCCTCCACCTTTGA-3’(SEQ ID NO.1)

Reverse:5’-CACCACCCTGTTGCTGTA-3’(SEQ ID NO.2)

VEGF引物序列：

Forward:5’-TAGAGTACATCTTCAAGCCGTC-3’(SEQ ID NO.3)

Reverse:5’-CTTTCTTTGGTCTGCATTCACA-3’(SEQ ID NO.4)

DMP1引物序列：

Forward:5’-TTGACAATGAGGACCGGGTG-3’(SEQ ID NO.5)

Reverse:5’-TCCTGATGCTCTCTGGGTCA-3’(SEQ ID NO.6)

SDF1引物序列：

Forward:5’-GTGCCCTTCAGATTGTAGCC-3’(SEQ ID NO.7)

Reverse:5’-GGTACTCCTGAATCCACTTTAGC-3’(SEQ ID NO.8)

CXCR4引物序列：

Forward:5’-CACGCCACCAACAGTCAGAG-3’(SEQ ID NO.9)

Reverse:5’-GCAAAGATGAAGTCGGGAATAG-3’(SEQ ID NO.10)

按照现有技术的常规方法提取凝胶中生长的DPSCs细胞的总RNA，经过逆转录和qPCR检测，获得上述基因的表达量的信息。

(6)裸鼠背部皮下移植牙根段实验

牙根段准备

收集人单根管离体前磨牙，要求牙根完整，无龋坏，无裂纹，无充填体。高速涡轮手机截取牙根中段约3-5mm长度，镍钛旋转器械预备根管至Protaper 25#，然后将牙根段浸泡在2％的氯己定溶液中5min，无菌水超声波震荡3min，17％EDTA溶液浸泡10min去除玷污层，随后用5.25％的次氯酸钠处理10-15min，最后用生理盐水冲洗。Iroot BP plus封闭一端根管口，待Iroot BP plus完全固化后备用(图13B)。

动物准备

实验动物选择6周龄雌性免疫缺陷裸鼠10只。

动物手术

①制备含DPSCs-Exo的纤维蛋白/明胶水凝胶(实验组)和不含DPSCs-Exo的纤维蛋白/明胶水凝胶(对照组)，本部分实验所用DPSC-Exo已经过BCA法蛋白定量调整至1mg/mL。分别注入处理好的牙根段根管内，静置待其结胶。

②动物麻醉

③裸鼠背部碘伏棉签消毒，手术刀片在背部皮肤做纵向切口，长约1cm，左右各一，钝性分离皮下空腔。

④将第①步制备好的牙根段埋入皮下空腔，左右各一，左边为对照组，右边为实验组。

⑤对位背部皮肤，5号可吸收缝线缝合伤口，每个切口缝合3-4针。再次对切口碘伏棉签消毒。

⑥关闭小动物呼吸麻醉机，观察裸鼠状态，活跃后放入饲养笼，常规饲养8周。

⑦8周后保留裸鼠背部皮肤切口完全愈合，若有未完全愈合导致牙根段暴露的不纳入最终结果。断颈处死裸鼠，取出牙根段，4％多聚甲醛固定24h。

HE染色：取出固定的牙根段，从根管内取出新生软组织，使用常规方法进行切片以及HE染色。

在本实施例中，所有的实验均独立重复三次，定量数据结果用平均值±标准差表示。使用Graphpad Prism(8.0)软件进行数据统计及分析，使用独立样本t检验比较组间差异，P＜0.05认为有统计学意义。

3.实验结果

(1)DPSCs-Exo染色示踪实验

如图9所示，外泌体被PKH26标记为红色荧光，细胞核被Hoechst标记为蓝色荧光，细胞质被Calcein AM标记为绿色荧光。结果显示，DPSCs-Exo加入DPSCs 0.5h后，可见外泌体被细胞摄取进入细胞，广泛分布在细胞质内，尤其是细胞核的周围分散。该结果表明牙髓干细胞来源外泌体可以在短时间内被细胞内摄，这与以往对外泌体的研究保持一致，证实外泌体携带的信号物质可以进入细胞发挥作用，给外泌体的相关研究提供了理论基础。

(2)live/dead实验检测细胞活力

分别在含外泌体和不含外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶上培养牙髓干细胞，live/dead实验染色显示细胞活力情况(图10)：激光共聚焦显微镜下观察，实验组和对照组均见大量活细胞(绿色荧光)，极少量死细胞(红色荧光)，两者相比，实验组的细胞活力优于对照组(P＜0.001)，表明在纤维蛋白/明胶水凝胶支架上负载牙髓干细胞来源外泌体对细胞的生长有正向促进作用。在图10中，A为激光共聚焦显微镜观察三维重建染色后的细胞(放大倍数：×200活细胞：绿色荧光；死细胞：红色荧光。imageJ软件计算荧光面积，以绿色荧光面积比红色和绿色荧光面积之和代表细胞活力)；B为独立样本t检验统计学分析，***P＜0.001。

(3)Transwell实验检测细胞迁移能力

实验组设置为含外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶，对照组为不含外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶，Transwell实验结果显示(图11)：经结晶紫染色后，迁移的牙髓干细胞被染成蓝紫色，实验组迁移的细胞明显多于对照组迁移的细胞，结果有统计学意义(P＜0.0001)。图11中，A为体视显微镜观察迁移细胞,肉眼观DPSCs-Exo组多于对照组；B为倒置相差显微镜观察迁移细胞，放大倍数：×40，×100；C为独立样本t检验进行统计学分析，****P＜0.0001。

(4)qPCR实验检测基因表达

如图12所示，本实验检测了在纤维蛋白/明胶水凝胶中三维培养牙髓细胞，在有无外泌体存在的条件下，qPCR检测了相关mRNA表达的差异。结果显示，在上述条件下培养牙髓细胞五天后，实验组的VEGF，DMP1，CXCR4的表达量明显上升，SDF1表达下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。

(5)裸鼠背部皮下移植牙根段实验结果

参见图13，8周后取材，可见根管内新生软组织。取出牙根段内新生软组织HE染色，结果显示(图14，放大倍数：×40，×100，黄色箭头指示小血管)，HE染色见细胞核被染成蓝紫色，细胞质被染成淡红色。在实验组和对照组中牙根段内均有新生软组织，且都见到大量细胞，表明具有细胞迁移至牙根段根管内生长，细胞及组织间可见到数个红细胞聚焦呈团形成血管样管状结构，且实验组新生小血管数量明显多于对照组。在图13中，A-C为动物手术，裸鼠背部纵形切口，左右各一，植入牙根段；D-E为牙根段准备，长约3-5mm，预备根管；F为8周后取材，见根管内新生软组织。

4.结果分析

外泌体是活细胞分泌的功能性的小囊泡，内含多种来源细胞的信号分子，包括mRNA，蛋白质等，靶细胞通过摄取这些携带信号分子的小囊泡，完成细胞间的信息传递和信号交流发挥功能。本部分实验检测了牙髓细胞对外泌体的内摄作用，通过PKH26荧光标记外泌体，激光共聚焦显微镜下观察，在0.5h后，外泌体可以进入牙髓细胞质内，并分布在细胞核周围。外泌体染色示踪实验表明，DPSCs-Exo可以被牙髓干细胞内摄，接收其携带的信号分子。

本部分实验以纤维蛋白/明胶水凝胶为载体负载外泌体，在三维条件下培养细胞，live/dead实验检测与不含外泌体相比，细胞活力有无明显差异，以此探究在纤维蛋白/明胶水凝胶上外泌体是否可以发挥相关的生物学作用。结果显示实验组和对照组均见大量活细胞(绿色荧光)，极少量死细胞(红色荧光)，两者相比，实验组的细胞活力优于对照组，表明在纤维蛋白/明胶水凝胶支架上负载牙髓干细胞来源外泌体对细胞的生长有正向促进作用。在牙髓再生损伤修复中，迁移到损伤部位的健康细胞的数量对治疗的效果有着重要的影响，尤其是在无细胞治疗中，内源性细胞归巢迁移到损伤部位是再生修复的第一步，因此，我们继续探索了外泌体在三维条件下对细胞迁移能力的影响，Transwell实验结果显示，含DPSCs-Exo的水凝胶组迁移的细胞明显多于不含DPSCs-Exo的水凝胶组，以上结果表明在纤维蛋白/明胶水凝胶支架上，DPSCs-Exo可以明显促进细胞的迁移。间充质干细胞来源外泌体较为明确的促迁移作用有望作为组织工程的良好信号分子，同时DPSCs在临床中更易得到，损伤更小，是组织工程的优良选择。qPCR检测了相关mRNA表达的差异。结果显示，在含DPSCs-Exo的纤维蛋白/明胶水凝胶条件下培养牙髓细胞，实验组的VEGF，DMP1，CXCR4的表达量明显上升，SDF1表达下降，且差异有统计学意义。VEGF是在发育，维持健康及疾病过程中调节血管新生和血管再生的主要调节因子(Apte R S,Chen D S,Ferrara N,VEGFin Signaling and Disease:Beyond Discovery and Development.[J].Cell,2019,176:1248-1264.)。DMP1是细胞外基质蛋白，对骨和牙本质的适当矿化至关重要，存在于骨和牙齿组织的各种细胞中(Sun Y,Lu Y,Chen L,et al.DMP1processing is essential todentin and jaw formation.[J]J Dent Res.2011，90(5):619-24.)。趋化因子SDF1与其受体CXCR4结合后，可通过促进CXCR4二聚体形成，空间构象改变，内化以及激活与其相偶联的G蛋白等机制而激活多种信号转导通路，进而影响细胞的趋化、运动、黏附、血管生成等多种生物学活动(Zhang H,He B.SDF1/CXCR4axis plays a role in angiogenesis duringthe degeneration of intervertebral discs.[J]Mol Med Rep.2019，20(2):1203-1211.)。该结果表明DPSCs-Exo可以在纤维蛋白/明胶三维环境下促进牙髓细胞成血管，成牙本质及促迁移等相关基因表达上升，这与我们HE染色及Transwell实验结果一致。

在牙髓组织工程中，利用牙根段植入裸鼠背部皮下是常见的动物模型。Huang等人将包含牙髓干细胞的胶原支架和ECM(细胞外基质)支架分别注入牙根段根管腔内并移植到免疫缺陷小鼠背部皮下，4周后观察根管内新生软组织血管等的差异(Huang C-C,Narayanan R,Warshawsky N et al.Dual ECM Biomimetic Scaffolds for Dental pulpRegenerative Applications.[J].Front Physiol,2018,9:495.)。在本研究中，我们借助这一动物模型探索负载DPSCs-Exo的纤维蛋白/明胶水凝胶对是否可以促进牙髓样组织再生。结果显示，牙根段根管内均有新生牙髓样软组织，对软组织进行HE染色观察到，在外泌体存在的条件下，新生软组织内明显可见更多的富含红细胞的小血管样结构，这提示我们牙髓干细胞来源外泌体在以纤维蛋白/明胶为支架时，或许有利于血管的新生或再生。牙髓是富含血管神经的软组织，恢复牙髓丰富的血流环境是牙髓再生的重要前提，因此我们的实验结果表明了纤维蛋白/明胶负载外泌体有望成为牙髓组织工程无细胞治疗的一个新的方向。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医科大学口腔附属医院

<120> 一种水凝胶及其制备方法和应用

<130> 2021/05/27

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccactcctcc acctttga 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caccaccctg ttgctgta 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagagtacat cttcaagccg tc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctttctttgg tctgcattca ca 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttgacaatga ggaccgggtg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcctgatgct ctctgggtca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtgcccttca gattgtagcc 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtactcctg aatccacttt agc 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cacgccacca acagtcagag 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcaaagatga agtcgggaat ag 22

Claims (6)

1.一种水凝胶，其特征在于：其原料包括明胶、纤维蛋白原、凝血酶、牙髓间充质干细胞来源的外泌体和牙髓间充质干细胞；在水凝胶中，纤维蛋白原的浓度为5mg/mL，明胶的质量分数为4％，凝血酶的终浓度为0.5U/mL；且以蛋白浓度计，所述外泌体的终浓度为0.1mg/mL；所述牙髓间充质干细胞的终浓度为3×10⁴个/mL；所述外泌体由如下方法制备获得：使用α-MEM完全培养基培养P3-P7代牙髓间充质干细胞，然后将α-MEM完全培养基更换为无血清α-MEM培养基，培养后收集上清液；使用超速离心法从所述上清液中收集所述外泌体；

所述水凝胶由如下方法制备：将明胶溶液、纤维蛋白原溶液、凝血酶工作液、DPSCs外泌体悬液和DPSCs混悬液混合，结胶后获得水凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种水凝胶的制备方法，其特征在于：将明胶溶液、纤维蛋白原溶液、凝血酶工作液、DPSCs外泌体悬液和DPSCs混悬液混合，结胶后获得水凝胶。

3.根据权利要求2所述的一种水凝胶的制备方法，其特征在于：在所述水凝胶上方加入α-MEM完全培养基。

4.根据权利要求3所述的一种水凝胶的制备方法，其特征在于，明胶溶液、纤维蛋白原溶液、凝血酶工作液、DPSCs外泌体悬液和DPSCs混悬液的体积比为500:250:50:100:100；所述明胶溶液中明胶的质量分数为8％，所述纤维蛋白原溶液中纤维蛋白原的浓度为20mg/mL，所述凝血酶工作液中凝血酶的浓度为10U/mL；以蛋白浓度计，所述DPSCs外泌体悬液中外泌体的浓度为1mg/mL；所述DPSCs混悬液中牙髓间充质干细胞的浓度为3×10⁵个/mL。

5.根据权利要求1所述的一种水凝胶在制备牙髓组织构建体中的应用。

6.根据权利要求1所述的一种水凝胶在制备组织工程支架上的应用。

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