CN104548212A - 一种促进牙髓及牙本质再生的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进牙髓及牙本质再生的组合物，包括血小板衍生生长因子PDGF和支架材料，血小板衍生生长因子PDGF为PDGF-BB、PDGF-AB和PDGF-AA中的一种或几种，支架材料为藻酸盐、阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶、明胶、几丁质、壳聚糖、壳聚糖醋酸盐、壳聚糖乳酸盐、硫酸软骨素、N，O-羧甲基壳聚糖、葡聚糖、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白原、天然血块、甘油、透明质酸、千味素、葡糖胺、蛋白聚糖、淀粉、乳酸、泊洛沙姆、甘油磷酸钠、胶原、糖原、角蛋白丝、合成外科密封剂和粘合剂中的一种或几种。本发明可以方便地注射到需要治疗的牙髓腔中，通过血小板衍生生产因子PDGF和支架材料的共同作用，修复细胞进入压髓腔并发挥修复作用，从而再生和修复患病牙髓和牙本质。

Description

一种促进牙髓及牙本质再生的组合物

技术领域

本发明涉及牙体治疗领域，具体是一种促进牙髓及牙本质再生的组合物。

背景技术

牙齿的大部分生物活性主要依赖于牙髓，目前，用惰性合成材料覆盖或替换，即根管治疗是治疗牙髓疾病的主要途径。较常见的充填材料是杜仲胶，杜仲胶是一种异戊二烯热塑性聚合物。治疗时，将坏死的牙髓取出后，熔化的热牙胶被注入到牙根管中。尽管根管治疗术近年来被广泛应用于牙体治疗，但仍然存在如下弊端：根管治疗后的牙体脆性增加，易折断；根管治疗后的牙齿频繁发生脱色，后期牙科美容手术费用高昂；尚无适用于婴儿的患病牙髓根管治疗方法。而且脱位牙发生牙髓坏死的概率为85-96％，挫入牙发生牙髓坏死的概率为70-100％。被忽视的牙体炎症可能是全身性感染的诱因。

理想情况下，改良的牙髓治疗方法应改善并恢复缺损组织的生物学活性。治疗后的牙髓组织可以进一步诱导或促进牙体结构与功能。

组织工程学已经被应用于颅面组织与骨骼的修复。美国专利申请号#5885829以及美国专利申请号#20050079470中大部分技术涉及到接种到哺乳动物细胞的支架材料的使用，接种细胞如牙髓干细胞、间充质干细胞，接种生物活性组分如骨形态发生蛋白BMPs。再生牙髓技术尚不成熟，几乎所有已公开的现存专利均未涉及到细胞移植。

美国专利申请号#20140099605公布了一种使用牙髓干细胞、具有生物活性的分子以及胞外基质来修复牙根管组织的方法，所述细胞包含至少一种牙髓腔细胞，生物活性分子包括SDF-1、血管内皮生长因子、G-CSF、SCF、MMP3、狭缝、GM-CSF、IGF、bFGF、PDGF、GDNF、BDNF、NGF、神经肽Y和神经营养素3，基质包括胶原蛋白、人造蛋白聚糖、明胶、水凝胶、纤维素、phosphophorin、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、藻酸、透明质酸、几丁质、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、羟磷灰石、b-TCP、碳酸钙、钛和金。该技术的局限性在于对细胞、生物分子和支架三种成分的复杂协调。将细胞接种到支架材料上的技术具有不宜准备和存储的显著缺陷，因为活细胞必须接种，培养并保存在支架材料上，另外，再生组织所需要的细胞源及其产率是有限的。美专利申请号#20100203481、#20090148486和专利号#5885829所公开的细胞及相关系统的类似技术均有此局限。

美专利申请号#20130183638中公开了使用患者自体血小板以及预成型纤维蛋白凝胶填充牙根管以促进牙髓血管生成的相似方法，然而这种方法因成本及技术局限性降低了实用性。并且，研究显示高浓度血小板无法产生牙髓再生的满意结果，预成型的纤维蛋白凝胶也不便于实际应用。

美专利申请号#20110256495中公开了使用釉原蛋白再生牙髓的方法。不过，目前釉原蛋白是否可以获得真正的包含血管与神经的再生牙髓尚不清楚。

综上所述，改进牙髓及根管治疗方法，特别是利用组织工程技术重建追在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用方便、实用性强的促进牙髓及牙本质再生的组合物，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种促进牙髓及牙本质再生的组合物，包括天然或重组的血小板衍生生长因子PDGF和天然或合成的支架材料，所述血小板衍生生长因子PDGF为PDGF-BB、PDGF-AB和PDGF-AA中的一种或几种，所述支架材料为藻酸盐、阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶、明胶、几丁质、壳聚糖、壳聚糖醋酸盐、壳聚糖乳酸盐、硫酸软骨素、N，O-羧甲基壳聚糖、葡聚糖、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白原、天然血块、甘油、透明质酸、千味素、葡糖胺、蛋白聚糖、淀粉、乳酸、泊洛沙姆、甘油磷酸钠、胶原、糖原、角蛋白丝、合成外科密封剂和粘合剂中的一种或几种。

作为本发明进一步的方案：所述血小板衍生生长因子PDGF的浓度为0.01ng/mL-1mg/mL，血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管冠端处浓度为100ng/ml-1mg/ml，且靠近根管根尖末端处浓度不超过250ng/ml。

作为本发明进一步的方案：所述血小板衍生生长因子PDGF中的PDGF-BB在组合物中的终浓度为1-1000ng/mL。

作为本发明进一步的方案：所述支架材料采用21-25号针头进行注射且注射后支架材料留存于根管和牙髓腔内。

作为本发明进一步的方案：所述支架材料中含有纤维蛋白原组分和凝血酶组分，且纤维蛋白原组分和凝血酶组分位于根管冠端的密度高于其位于根尖末端的密度，纤维蛋白原组分终浓度为0.01-100mg/ml，凝血酶组分终浓度为0.1IU/ml-1200IU/ml。

作为本发明进一步的方案：所述纤维蛋白原组分位于根管冠端的终浓度为4.5-100mg/ml，凝血酶组分位于根管冠端的终浓度为1-1200IU/ml，所述纤维蛋白原组分位于根尖末端的终浓度为0.45-50mg/ml，凝血酶组分位于根尖末端的终浓度为0.1-120IU/ml。

作为本发明进一步的方案：所述支架材料在1-300s之内固化。

作为本发明进一步的方案：所述血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管根尖末端的释放量于两天后至少达75％，七天后至少达80％，血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管冠位置的释放量于两天后最多达65％，七天后最多达85％。

作为本发明进一步的方案：所述促进牙髓及牙本质再生的组合物的制备方法，具体步骤是：先将支架材料的各成分分别与血小板衍生生长因子PDGF进行混合得到混合物，再将各混合物进行混合得到组合物。

作为本发明再进一步的方案：所述促进牙髓及牙本质再生的组合物的使用方法，是将所述组合物充填入哺乳动物患病或创伤的牙根管和牙髓腔内。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明可以方便地注射到需要治疗的牙髓腔中，通过血小板衍生生产因子PDGF和支架材料的共同作用，修复细胞进入压髓腔并发挥修复作用，从而再生和修复患病牙髓和牙本质。

附图说明

图1为含抗生素的PBS培养液中纤维蛋白胶的体外降解曲线示意图。

图2为含抗生素的PBS培养液中PDGF-BB从纤维蛋白胶中的体外释放动力示意图。

图3为PDGF-BB直接加入到培养基中所对应的NIH₃T₃增殖示意图。

图4为从纤维蛋白胶中释放PDGF-BB所对应下的NIH₃T₃细胞增殖示意图。

图5为从纤维蛋白凝胶中释放与直接加入培养基中PDGF-BB下的NIH3T3增殖示意图。

图6为长期存储于纤维蛋白原溶液中PDGF-BB的生物活性稳定性示意图。

图7为根管中纤维蛋白凝胶成分示意图。

图8为根管中PDGF-BB成分示意图。

图9为根管中纤维蛋白胶与PDGF-BB的成分示意图。

图10为利用根管中的溢血/出血作为支架材料并结合PDGF-BB的根管治疗方法示意图。

图11为利用根管中的溢血/出血作为支架材料并结合注射PDGF-BB的根管治疗方法示意图。

图中：1-牙本质壁；2-PDGF-BB；3-低密度的纤维蛋白胶；4-高密度纤维蛋白胶。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

一种促进牙髓及牙本质再生的组合物，包括血小板衍生生长因子PDGF和支架材料，血小板衍生生长因子PDGF的浓度为20ng/mL，血小板衍生生长因子PDGF为PDGF-BB，PDGF-BB在组合物中的终浓度为10ng/mL，血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管冠端处浓度为100ng/ml，且靠近根管根尖末端处浓度为80ng/ml，血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管根尖末端的释放量于两天后达75％，七天后达80％，血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管冠位置的释放量于两天后达60％，七天后达80％；支架材料为纤维蛋白原组分和凝血酶组分，纤维蛋白原组分终浓度为8mg/ml，凝血酶组分终浓度为2.5IU/ml，纤维蛋白原组分位于根管冠端的终浓度为9mg/ml，凝血酶组分位于根管冠端的终浓度为20IU/ml，所述纤维蛋白原组分位于根尖末端的终浓度为3mg/ml，凝血酶组分位于根尖末端的终浓度为1IU/ml，所述支架材料采用21号针头进行注射且注射后支架材料留存于根管和牙髓腔内，支架材料在80s之内固化。

所述促进牙髓及牙本质再生的组合物的制备方法是先将纤维蛋白原组分和凝血酶组分分别与血小板衍生生长因子PDGF进行混合得到混合物，再将各混合物进行混合得到组合物；所述促进牙髓及牙本质再生的组合物的使用方法是将组合物充填入哺乳动物患病或创伤的牙根管和牙髓中腔。

实施例2

一种促进牙髓及牙本质再生的组合物，包括血小板衍生生长因子PDGF和支架材料，血小板衍生生长因子PDGF的浓度为500ng/mL，血小板衍生生长因子PDGF为PDGF-BB和PDGF-AB的混合物，血小板衍生生长因子PDGF中的PDGF-BB在组合物中的终浓度为140ng/mL，血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管冠端处浓度为500mg/ml，且靠近根管根尖末端处浓度为220ng/ml，血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管根尖末端的释放量于两天后达80％，七天后达85％，血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管冠位置的释放量于两天后达62％，七天后达82％；支架材料为纤维蛋白凝胶组分、纤维蛋白原组分和凝血酶组分，其中纤维蛋白原组分终浓度为25mg/ml，凝血酶组分位于根尖末端的终浓度为50IU/ml，所述纤维蛋白原组分位于根管冠端的终浓度为20mg/ml，凝血酶组分位于根管冠端的终浓度为200IU/ml，所述纤维蛋白原组分位于根尖末端的终浓度为12mg/ml，凝血酶组分终浓度为10IU/ml，所述支架材料采用23号针头进行注射且注射后支架材料留存于根管和牙髓腔内，支架材料在100s之内固化。

所述促进牙髓及牙本质再生的组合物的制备方法是先将纤维蛋白凝胶组分、纤维蛋白原组分和凝血酶组分分别与血小板衍生生长因子PDGF进行混合得到混合物，再将各混合物进行混合得到组合物；所述促进牙髓及牙本质再生的组合物的使用方法是将组合物充填入哺乳动物患病或创伤的牙根管和牙髓中腔。

实施例3

一种促进牙髓及牙本质再生的组合物，包括血小板衍生生长因子PDGF和支架材料，血小板衍生生长因子PDGF的浓度为800ng/mL，血小板衍生生长因子PDGF为PDGF-BB、PDGF-AB和PDGF-AA的混合物，血小板衍生生长因子PDGF中的PDGF-BB在组合物中的终浓度为220ng/mL，血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管冠端处浓度为750mg/ml，且靠近根管根尖末端处浓度为240ng/ml，血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管根尖末端的释放量于两天后达85％，七天后达90％，血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管冠位置的释放量于两天后达65％，七天后达85％；支架材料为纤维蛋白凝胶组分、纤维蛋白原组分、透明质酸组分和凝血酶组分，纤维蛋白原组分终浓度为40mg/ml，凝血酶组分终浓度为24IU/ml，所述纤维蛋白原组分位于根管冠端的终浓度为42mg/ml，凝血酶组分位于根管冠端的终浓度为400IU/ml，所述纤维蛋白原组分位于根尖末端的终浓度为20mg/ml，凝血酶组分位于根尖末端的终浓度为20IU/ml，所述支架材料采用25号针头进行注射且注射后支架材料留存于根管和牙髓腔内，支架材料在120s之内固化。

所述促进牙髓及牙本质再生的组合物的制备方法是先将纤维蛋白凝胶组分、纤维蛋白原组分、透明质酸组分和凝血酶组分分别与血小板衍生生长因子PDGF进行混合得到混合物，再将各混合物进行混合得到组合物；所述促进牙髓及牙本质再生的组合物的使用方法是将组合物充填入哺乳动物患病或创伤的牙根管和牙髓中腔。

请参阅图1-11，根据根管再生治疗原则将血小板衍生生长因子PDGF和支架材料制成可注射性纤维蛋白胶，可注射性纤维蛋白胶在90-120min内固化，给予了根管治疗手术充裕的时间，可注射性纤维蛋白胶固化时间由支架材料中胶成份的浓度决定，通过调整胶成份的浓度，使纤维蛋白组分的浓度为3-42mg/ml，凝血酶组分的浓度为0.1-30lU/ml时，固化时间为90min，治疗效果最佳，所制可注射性纤维蛋白胶胶体呈现极高的机械强度。

请参阅图1，将含有28mg/ml的纤维蛋白放在8-12IU/ml凝血酶中反应后的得到的可注射性纤维蛋白胶胶体在37℃的PBS溶液中培育三周后可保留91％以上的重量，即通过调节胶体密度，可注射性纤维蛋白胶胶体可长时间保持稳定性，呈现可调节稳定性。因此可以作为支架材料用以细胞渗透与新器官生长。

未与凝血剂混合的非凝结性纤维蛋白在人体牙槽骨干细胞中表现出极强的剂量依赖趋化性。结块的凝血酶在与凝血酶混合并胶化后无趋化性，因此溶解性纤维蛋白可独自用作生物活性组分促进牙髓再生中的细胞修复。与血小板衍生生长因子PDGF结合后，可合成趋化性将促进细胞生长以及牙髓腔再生。因此，未结块的纤维蛋白可以独自，或与其它充填材料以及血小板衍生生长因子PDGF混合后用于促进牙髓腔再生。

请参阅图2，原始情况下用来制胶的纤维蛋白浓度为9-14mg/ml，1/3稀释情况下用来制胶的纤维蛋白浓度为4.5-7mg/ml，1/9稀释情况下用来制胶的纤维蛋白浓度为3-5mg/ml，凝血酶浓度保持在51U/ml。PDGF-BB从纤维蛋白胶中缓速释放，释放动力曲线随纤维蛋白浓度控制下的胶体密度的变化而变化。特别是由9-14mg/ml纤维胶元制成的胶体在混合PDGF-BB三天后释放65％，七天后释放85％。

请参阅图3，55-85mg/ml纤维蛋白与等体积的20-30IU/ml凝血酶混合制成PDGF-BB递送胶体，PDGF-BB递送胶体被加入到NIH₃T₃培养液中，NIH₃T₃培养液浓度为250ng/ml，两天后使用CellTiter法测细胞增殖。比对培养基则被直接注入PDGF-BB。纤维蛋白胶释放出极少量PDGF-BB，所剩培养基浓度不足10ng/ml。计算后结果显示仅有低于14％由纤维蛋白胶中释放。另一方面，胶体表现出良好的PDGF-BB存留力，因此本密度下的纤维蛋白胶适用于PDGF-BB的缓释。

请参阅图4，PDGF-BB从纤维蛋白胶中的释放可由降低制成胶体的纤维蛋白浓度促进，通过将浓度为18-28mg/ml和55-85mg/ml的纤维蛋白胶分别与等体积浓度为20-30IU/ml的凝血酶混合制备两个胶体。将凝胶在0、50ng/ml、250ng/ml和1250ng/ml浓度下与PDGF-BB混合。将40ul的胶体小球加入到150ul的细胞培养基中。细胞培育两天后用常规CellTiterTM法测定细胞总数。55-85mg/ml纤维蛋白胶体释放极少量的PDGF-BB，因为高PDGF-BB浓度促进细胞增殖，纤维蛋白本身亦可促进细胞增殖；相比之下，由18-28mg/ml纤维蛋白制成的胶体有较高的PDGF-BB释放量。

请参阅图5，高水平表达的生物活性可以由低密度纤维蛋白胶中PDGF-BB的释放以及升高加载PDGF-BB浓度实现。将两种由不同浓度的纤维蛋白溶液制成的纤维蛋白凝胶进行比较。由18-28mg/ml纤维蛋白制成的胶体较55-85mg/ml有较高的PDGF-BB释放水平，相对应细胞增长数量亦较多。并且，只有加载较高剂量PDGF-BB的一组，例如250ng/ml或1250ng/ml显示出较高生物活性。在高密度凝胶组中，尽管PDGF-BB量高达1250ng/ml，细胞反应保持在较低水平。总体上，低密度纤维蛋白胶与高负荷浓度的组合表现较佳释放量与较好生物活性。

请参阅图6，预混合好的PDGF-BB与纤维蛋白长期存储后保持较高稳定性。50ug/ml的PDGF-BB与55-85mg/ml纤维蛋白混合后存储于4℃的冰箱中长达60天。使用细胞测定法测量ED50有效剂量平均值未体现明显变化，其中p＞0.0，n＝3。

请参阅图7-9，纤维蛋白胶梯度浓度可由向根管中充填不同胶体实现。低密度胶体包含低浓度纤维蛋白、凝血酶与PDGF-BB被充填在根管根尖部分。根管剩余部分由含有高浓度的纤维蛋白高密度胶体充填，两部分各占50％根管空间。

请参阅图10，利用根管中的溢血/出血作为支架材料并结合PDGF-BB的进行根管治疗，根管的填充物主体为根管中的出血形成的凝血。在靠近根冠部位添加含有PDGF-BB的材料，这个材料可以是根管中的溢血/出血，也可以是其它填充材料例如各种天然或合成的高分子材料、生物陶瓷以及它们的复合物或混合物等等，也可以同时使用凝血和其它填充材料。代表性填充物包括纤维蛋白胶、胶原蛋白胶、生物陶瓷或者用它们做成的海绵状材料。这个材料本身可以降解也可以不降解，但是必须能够释放PDGF-BB、这个材料中可以含有凝血酶或钙离子等以促进凝血。

请参阅图11，利用根管中的溢血/出血或其它填充材料作为支架材料填充，并结合注射PDGF-BB进行根管治疗，根管的填充物主体为根管中的出血形成的凝血，也可以是其它填充材料例如各种天然或合成的高分子材料、生物陶瓷以及它们的复合物或混合物等，也可以同时使用凝血和其它填充材料。代表性填充物包括纤维蛋白胶、胶原蛋白胶、生物陶瓷或者用它们做成的海绵状材料。填充完成后，用注射器向填充物中注射PDGF-BB溶液或混合物。这个含有PDGF-BB的溶液或混合物材料中可以含有凝血酶或钙离子等以促进凝血。

本发明中所含生物活性组分可以与支架材料以任何已知方式混合，如通过注射、组合、包封、化学偶联或吸收等方法将组分种植于支架材料上，生物活性组分中血小板衍生生长因子PDGF，特别是PDGF-BB可以促进血管、牙源、纤维以及神经的发育。

生物活性组分还包含抗生素和镇痛剂，抗生素为青霉素V钾、阿莫西林、安奇、克林霉素或阿奇霉素，镇痛剂为乙酰氨基酚、双氯芬酸、酮洛芬、阿司匹林、萘普生、吲哚美辛、酮洛酸、布洛芬、吡罗昔康、塞来昔布、美洛昔康、甲芬那酸、罗非考昔、尼美舒利或前列腺素。

本发明可以方便地注射到需要治疗的牙髓腔中，通过血小板衍生生产因子PDGF和支架材料的共同作用，修复细胞进入压髓腔并发挥修复作用，从而再生和修复患病牙髓和牙本质。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一种促进牙髓及牙本质再生的组合物，包括天然或重组的血小板衍生生长因子PDGF和天然或合成的支架材料，其特征在于，所述血小板衍生生长因子PDGF为PDGF-BB、PDGF-AB和PDGF-AA中的一种或几种，所述支架材料为藻酸盐、阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶、明胶、几丁质、壳聚糖、壳聚糖醋酸盐、壳聚糖乳酸盐、硫酸软骨素、N，O-羧甲基壳聚糖、葡聚糖、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白原、天然血块、甘油、透明质酸、千味素、葡糖胺、蛋白聚糖、淀粉、乳酸、泊洛沙姆、甘油磷酸钠、胶原、糖原、角蛋白丝、合成外科密封剂和粘合剂中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的促进牙髓及牙本质再生的组合物，其特征在于，所述血小板衍生生长因子PDGF的浓度为0.01ng/mL-1mg/mL，血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管冠端处浓度为100ng/ml-1mg/ml，且靠近根管根尖末端处浓度不超过250ng/ml。

3.根据权利要求1所述的促进牙髓及牙本质再生的组合物，其特征在于，所述血小板衍生生长因子PDGF中的PDGF-BB在组合物中的终浓度为1-1000ng/mL。

4.根据权利要求1所述的促进牙髓及牙本质再生的组合物，其特征在于，所述支架材料采用21-25号针头进行注射且注射后支架材料留存于根管和牙髓腔内。

5.根据权利要求1所述的促进牙髓及牙本质再生的组合物，其特征在于，所述支架材料中含有纤维蛋白原组分和凝血酶组分，且纤维蛋白原组分和凝血酶组分位于根管冠端的密度高于其位于根尖末端的密度，纤维蛋白原组分终浓度为0.01-100mg/ml，凝血酶组分终浓度为0.1IU/ml-1200IU/ml。

6.根据权利要求5所述的促进牙髓及牙本质再生的组合物，其特征在于，所述纤维蛋白原组分位于根管冠端的终浓度为4.5-100mg/ml，凝血酶组分位于根管冠端的终浓度为1-1200IU/ml，所述纤维蛋白原组分位于根尖末端的终浓度为0.45-50mg/ml，凝血酶组分位于根尖末端的终浓度为0.1-120IU/ml。

7.根据权利要求1所述的促进牙髓及牙本质再生的组合物，其特征在于，所述支架材料在1-300s之内固化。

8.根据权利要求1所述的促进牙髓及牙本质再生的组合物，其特征在于，所述血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管根尖末端的释放量于两天后至少达75％，七天后至少达80％，血小板衍生生长因子PDGF在靠近根管冠位置的释放量于两天后最多达65％，七天后最多达85％。

9.一种如权利要求1-8所述的促进牙髓及牙本质再生的组合物的制备方法，其特征在于，具体步骤是：先将支架材料的各成分分别与血小板衍生生长因子PDGF进行混合得到混合物，再将各混合物进行混合得到组合物。

10.一种如权利要求1-8所述的促进牙髓及牙本质再生的组合物的使用方法，其特征在于，是将所述组合物充填入哺乳动物患病或创伤的牙根管和牙髓腔内。