CN110664993A - 纤维蛋白原γ链在牙齿再生领域的新用途及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纤维蛋白原γ链作为制备牙髓牙本质再生试剂的应用，并提供一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒，包括有纤维蛋白原γ链，可作为促进牙髓干细胞成牙本质分化的生长因子，能够显著提高牙髓干细胞成牙本质分化的效率，为促进牙髓本质再生提供了新的方法，具有显著的牙齿再生作用。

Description

纤维蛋白原γ链在牙齿再生领域的新用途及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物试剂应用领域，具体涉及蛋白原细胞新用途应用领域。

背景技术

牙髓和根尖周感染是口腔临床最常见的疾病之一，根管治疗是临床上治疗感染牙髓的常规治疗手段。尽管其在感染控制和疼痛消除方面具有令人满意的临床功效，但是传统的治疗方式仅仅密封根管系统的空间而不能恢复原始牙髓组织功能和活力。失去牙髓组织提供的血液、神经和营养支持，根管治疗后的牙齿更容易发生牙冠变色、根折和再感染等各种并发症。长期研究表明，根管治疗后的牙齿缺失率远高于未治疗牙齿。因而通过组织工程技术达到牙髓牙本质复合体的再生成为临床迫切的需求。

组织工程和干细胞技术的进步为实现牙髓的原位再生或植入全新合成的生物替代牙髓开辟了新的方向。组织工程方法需要三个关键要素：干细胞，支架(或基质)和生长因子。这些关键要素可用于三种主要治疗策略：1)将新鲜分离或培养单个细胞或小细胞聚集体直接注射或者与可降解支架一起植入到受损组织中；2)先将细胞和支架在体外3D培养，一旦3D共培养复合物达到成熟，将其植入受损组织中；3)原位组织再生，即将支架直接植入受损组织并刺激受损部位自身周围细胞“归巢”以促进局部组织修复。无论哪种策略，干细胞是牙髓牙本质再生不可或缺的一个重要因素。牙源性干细胞作为一种新的成体干细胞群体在再生与修复领域倍受关注，包括牙髓干细胞(DPSCs)、牙周膜干细胞(PDLSCs)、根尖周组织干细胞(SCAP)、脱落乳牙干细胞(SHED)等。在牙髓牙本质再生研究中，成体DPSCs因为其具有成牙本质、成骨、血管和神经等多功能分化潜能，以及优良的免疫抑制特性，成为研究最多、应用最广泛种子干细胞之一。虽然已经有几种组织工程生物牙髓异位或原位移植的动物实验证实牙髓牙本质复合体的再生可能，但是其作为常规临床治疗手段仍然面临许多挑战：比如新形成的牙本质是骨样的类牙本质；以及移植后的DPSCs受到多种因素影响，导致成牙本质定向分化效率低下。因此，如何促进DPSCs有效稳定成牙本质向分化是基于干细胞的组织工程生物牙髓治疗的一个瓶颈。

生长因子参与控制干细胞包括增殖，迁移和分化等在内的相关生物学活动，尤其在诱导干细胞朝特定的方向分化成另一种细胞类型中扮演重要的角色。因而寻找高效促DPSCs分化的生物活性分子是目前学界研究的热点方向之一。纤维蛋白原γ链(FGG)和其他两条多肽链Aα，Bβ一起组成纤维蛋白的前体纤维蛋白原。纤维蛋白(原)和纤连蛋白等属于细胞外基质的重要组成部分非胶原糖蛋白。与其他粘附糖蛋白一起沉积到细胞外基质(ECM)中，可作为支架，支持生长因子的结合，或与细胞表面受体结合促进细胞粘附、迁移、增殖和分化。纤维蛋白原γ链(FGG)作为纤维蛋白原的主链部分，是否也具有和纤维蛋白原一样的生物学功能，纤维蛋白原γ链(Fibrinogen gamma chain，FGG)是一种分泌型血酶原，其活化需要通过蛋白质水解作用转变成胞浆素和血管抑素，分别减少血栓形成和抑制血管生成，目前国内外针对纤维蛋白原常规应用是针对肾病、糖尿病、恶心肿瘤、颅脑损伤等检测方面，比如公开号为CN107505461A的专利，公开的是一种纤维蛋白原γ链作为评估创伤性颅脑损伤严重程度的标记物，目前现有技术没有公开纤维蛋白原γ链在牙科领域的应用。

发明内容

本发明公开了一种纤维蛋白原γ链作为制备牙髓牙本质再生试剂的应用，纤维蛋白原γ链作为生长因子在牙齿再生领域的新用途，并提供一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒，包括有纤维蛋白原γ链，可作为促进牙髓干细胞成牙本质分化的生长因子，能够显著提高牙髓干细胞成牙本质分化的效率，进而促进牙齿再生。

本发明公开一种纤维蛋白原γ链作为制备牙髓牙本质再生试剂的应用，纤维蛋白原γ链作为生长因子在牙齿再生领域的新用途。

优选的，所述纤维蛋白原γ链作为生长因子实现促进牙髓干细胞成牙本质分化的作用。具体是所述纤维蛋白原γ链提高了牙髓干细胞成牙本质分化的效率。

本发明还提供了一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒，包括有纤维蛋白原γ链，作为生长因子促进牙髓牙本质再生。

优选的，所述试剂盒还包括有：细胞培养基、胎牛血清、地塞米松、抗坏血酸。更优选的，还包括磷酸甘油、双抗药。

所述试剂盒具体包括有体积比的成分：

优选的，上述试剂盒还包括体积比的成分：

10mM的磷酸甘油 0.5-1.5％

双抗药 0.5-1％。

优选的，所述试剂盒包括有体积比的成分：

优选的，所述细胞培养基为DMEM培养基或L-DMEM培养基；所述双抗药为青链霉素混合液，或者为抗生素、抗真菌药。

本发明还提供了一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒的制备方法，按各成分的体积比逐一将8-15％胎牛血清(FBS)，0.5-1％的双抗药，0.5-1.5％的纤维蛋白原γ链，0.5-1.5％的10mM的磷酸甘油，1‰的100nM的地塞米松，1‰的50μg/mL的抗坏血酸，加入81-85％的细胞培养基中，摇晃混匀后，用小孔径的过滤器过滤后，放在4摄氏度冰箱保存备用。

本专利方案的优点在于：

(1)本发明人利用牙胚分泌蛋白条件培养基促进牙髓干细胞成牙本质分化的研究过程中，发现纤维蛋白原γ链(FGG)可作为促进牙髓干细胞成牙本质分化生长因子，能够显著促进牙髓干细胞分化的作用，发现了纤维蛋白原γ链在牙科再生领域的新用途。本发明方案的体外实验显示它能显著促进牙髓干细胞成牙本质分化的生物标志物DSPP，DMP1，BSP和OSX基因和蛋白上调，显示有显著促进成体牙髓干细胞的成牙本质分化的作用，带来了意想不到的技术效果。

(2)本发明提供的一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒，包括有纤维蛋白原γ链，作为促进牙髓干细胞成牙本质分化的生长因子。提供人工合成蛋白纤维蛋白原γ链(FGG)在制备促进成体牙髓干细胞的成牙本质分化的试剂组合，能够显著提高牙髓干细胞成牙本质分化的效率，为促进牙髓本质再生提供了新的方法，具有显著的牙齿再生作用。

附图说明

图1是qRT-PCR在基因水平检测FGG对牙髓干细胞成牙本质分化的影响图。

图2是Western blot在蛋白水平评估FGG对牙髓干细胞成牙本质分化的影响图。

图3是茜素红染色检测FGG促进牙髓干成牙本质分化的效果图。

图4是ALP染色检测FGG对牙髓干细胞成牙本质分化能力的影响图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步说明，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明提供一种纤维蛋白原γ链作为制备牙髓牙本质再生试剂的应用，并提供一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒，包括有纤维蛋白原γ链，可作为促进牙髓干细胞成牙本质分化生长因子能够显著促进牙髓干细胞分化效率，进而促进牙齿再生。

本发明还提供了一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒，包括有纤维蛋白原γ链(FGG)、细胞培养基、胎牛血清(FBS)、地塞米松、抗坏血酸。

本发明还提供了一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒的制备方法，按各成分的体积比逐一将8-15％胎牛血清(FBS)，0.5-1％的双抗药，0.5-1.5％的纤维蛋白原γ链，0.5-1.5％的10mM的磷酸甘油，1‰的100nM的地塞米松，1‰的50μg/mL的抗坏血酸，加入81-85％的细胞培养基中，摇晃混匀后，用小孔径的过滤器过滤后，放在4摄氏度冰箱保存备用。

本发明实施例1提供的促进牙髓牙本质再生的试剂盒，包括有体积比的如下成分：

所述细胞培养基为DMEM培养基或L-DMEM培养基；所述双抗药为青链霉素混合液，或者为抗生素、抗真菌药。

本发明实施例2提供的促进牙髓牙本质再生的试剂盒，包括有体积比的如下成分：

本发明实施例3提供的促进牙髓牙本质再生的试剂盒，包括有体积比的如下成分：

实施例4：原代人牙髓干细胞(hDPSCs)的分离、培养和传代

1、试剂的配制，培养原代牙髓干细胞，为后续证明FGG促进牙髓干细胞成牙本质分化做准备，提供细胞材料，配制过程如下。

(1)20％FBS血清原代培养基：向390mL L－DMEM培养基中加入10mL青霉素-链霉素溶液和100mL胎牛血清，摇匀，分装至50mL离心管，置于4℃冰箱保存备用。

(2)Ⅰ型胶原溶解酶溶液：往300mgⅠ型胶原酶粉末中加入100mL L－DMEM培养基，配成浓度3mg/mLⅠ型胶原酶；往400mg分散酶粉末中加入100mL L－DMEM培养基，配成浓度4mg/mLⅠ型胶原酶；用3mg/mLⅠ型胶原酶与4mg/mL的分散酶以1:1比例混合，过0.22μm滤膜过滤除菌后，混匀即为溶解酶溶液，分装至15mL中置于-20℃冰箱保存备用。

(3)细胞冻存液：临用前配制，将完胎牛血清、DMSO按9:1比例进行混合，摇匀，备用。

(4)4％多聚甲醛：称取20g多聚甲醛固体倾入烧杯中，加入500mL的PBS溶液，保鲜膜封口后置于磁力搅拌器上60℃持续搅拌直至完全溶解。

2、原代hDPSCs的提取分离

(1)实验过程中的牙髓细胞来源于临床上正常以及龋病的第三磨牙和因正畸需要拔除的前磨牙，患者年龄15-25岁，患者全身情况良好。取得入组人员知情同意，并经南方医科大学附属口腔医院医学伦理委员会批准。

(2)将拔除的牙齿立即放入冰袋预冷的基础DMEM培养液中(含2％的100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)。

(3)在超净台上用碘伏冲洗牙齿表面后，用无菌生理盐水冲洗牙齿的表面至无血迹，用消毒后的咬骨钳沿釉牙骨质界打开髓腔，拔髓针取出牙髓，剪去根部的牙髓组织。

(4)用3mg/mLⅠ型胶原酶与4mg/mL的分散酶以1:1比例混合，两种酶以1:10的体积与剪碎的牙髓混合消化1小时，将消化后的组织置于离心机中离心，1000rpm/min离心5分钟，弃去上清液，加完全培养基，混匀、吹打，经70μm的细胞金属网过滤，获得的细胞悬浮液接种于10cm培养皿中，加入完全培养液(20％胎牛血清、L－DMEM、2％青霉素/链霉素)。培养条件：相对湿度100％，5％CO2，37℃。3-4天半量换液。

3、细胞传代培养

细胞融合达到70％-80％后，室温条件下，0.25％胰蛋白酶消化3分钟，1000rpm/min离心5分钟，弃除上清吹打沉淀，混匀后以1:3比例传代，每3天换液1次。选3代的细胞进行实验。

实施例5qRT－PCR检测FGG对牙髓干细胞成牙本质分化RNA表达的效果

图1是qRT-PCR在基因水平检测FGG对牙髓干细胞成牙本质分化的影响图。图1中A为牙髓干细胞成牙本质分化培养14天后成牙本质标记物牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)、B为牙本质基质蛋白1(dental matrixprotein-1,DMP1)、C为骨涎蛋白(Bone Sialoprotein，BSP)、D为Sp7(Osterix，OSX)的基因检测结果。检测结果表明：FGG能明显提高牙髓干细胞的成牙本质分化能力，成牙本质标记物DSPP、DMP1、BSP和OSX的基因表达明显增高，提示FGG显著促成牙本质分化能力。

qRT-PCR检测过程如下：

(1)分组：对照组：正常矿化诱导的细胞培养液，

实验组：在对照组基础上加入15μg/mL FGG。

(2)以0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的牙髓干细胞制成单细胞悬液(细胞数1×105)，接种于24孔板，含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的L－EMEM培养基，每3天换液一次，培养至细胞融合度大于60-70％。

(3)改为对照组和实验组的培养基处理牙髓干细胞。每2-3天换液一次。

(4)7天后吸去培养基，PBS洗涤2次，每孔加入0.25ml的TRIzol，根据TRIzol商品使用说明书，使用TRIzol从细胞中提取总RNA，并通过添加DNase I消除基因组DNA污染。

(5)使用NanoDrop TM分光光度计检查所得RNA的质量和纯度。

(6)对于实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)，根据商品使用说明书，使用RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，#K1622)将1.5μgRNA转化为cDNA。

(7)使用单独的基因测定，Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(ThermoScientific，K0221)和ABI 7900系统使用以下程序进行qRT-PCR反应：5℃进行2分钟，95℃进行10分钟，50个循环的95℃进行15秒，60℃进行30秒和72℃进行30秒，然后进行解离步骤。

(8)每个测定一式三份进行以监测技术可变性和质量控制。GAPDH持家基因用作内部对照，用于跨样品的数据标准化。

(9)引物序列列于表1中。设计每个基因的引物序列是qRT—PCR试验的一个常规步骤，qRT—PCR实验在基因层面证实牙髓干细胞成牙本质分化的效果。

(10)使用2-ΔΔCt方法计算每个基因的Ct值的标准化和基因表达的倍数变化的测定(归一化至对照组)。

表1:牙髓干细胞成牙本质分化的基因引物设计

实施例6：Western blot检测FGG对牙髓干细胞成牙本质分化蛋白表达的效果

图2是Western blot在蛋白水平评估FGG对牙髓干细胞成牙本质分化的影响图。牙髓干细胞成牙本质分化培养14天后，成牙本质标记物牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白1(dental matrixprotein-1,DMP1)的BSP(Bone Sialoprotein，BSP)，OSX(Sp7/Osterix，OS X)表达。检测结果表明：FGG能明显提高牙髓干细胞的成牙本质分化能力，成牙本质标记物DSPP、DMP1、BSP和OSX的表达明显增高，提示FGG具有显著促牙髓干细胞成牙本质分化的能力。

Western blot检测过程如下：

(1)分组：对照组：正常矿化诱导的细胞培养液，

实验组：在对照组基础上加入15μg/mL的FGG。

(2)以0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的牙髓干细胞制成单细胞悬液(细胞数1×105)，接种于6孔板，含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的L－EMEM培养基，每3天换液一次，培养至细胞融合度大于60-70％。

(3)改为对照组和实验组的培养基处理牙髓干细胞。每2-3天换液一次。

(4)14天后吸去培养基，PBS清洗细胞1-2次，向细胞中加160uL RIPA裂解液，收集细胞至管中，冰上静置30min，离心12000rpm/min，30分钟后取上清，制备成蛋白样品供分析。

(5)将制备的蛋白加入上样缓冲液RSB，用100℃煮沸5分钟后，立即移入冰上冷却，作为电泳的上样样品。

(6)用5％浓缩胶和10％分离胶电泳分离，上样量为20ug/泳道，电泳电压，浓缩胶为70V，分离胶为100V，电泳时间约2.5h。内参为GD。

(7)检测结果表明：实验组中FGG能明显提高牙髓干细胞的成牙本质分化能力，成牙本质标记物DSPP、DMP1、BSP和OSX的表达明显增高。提示该FGG具有促成牙本质分化能力。

实施例7：茜素红染色法检测FGG对牙髓干细胞成牙本质分化能力的影响

图3是茜素红染色检测FGG促进牙髓干成牙本质分化的效果图。图3中A为牙髓干细胞成牙本质分化培养10天后ALP染色。B为茜素红染色半定量分析的统计学结果。检测结果显示实验组比对照组染色更明显，形成的矿化结节更多。说明FGG具有显著促进牙髓干细胞成牙本质分化能力。

茜素红染色检测过程如下：

(1)分组：对照组：正常矿化诱导的细胞培养液

实验组：采用实施例3的试剂盒，含有15μg/mL的FGG。

(2)以0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的牙髓干细胞制成单细胞悬液(细胞数1×105)，接种于24孔板，含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的L－EMEM培养基，每3天换液一次，培养至细胞融合度大于60-70％。

(3)改为对照组和实验组的培养基处理牙髓干细胞。每2-3天换液一次。

(4)10天后弃上清，每孔加入500uL PBS清洗细胞1-2次，

(5)室温下4％多聚甲醛固定细胞15分钟。

(6)去离子水轻柔的冲洗2遍。

(7)室温下茜素红染液染细胞半小时。

(8)轻柔的去除茜素红染液，最后用PBS清洗3-5次。

(9)每孔加入500ml的PBS，拍照。

(10)结果显示：与对照组相比，实验组中FGG能明显促进牙髓干细胞的成牙本质分化能力。

实施例8：ALP染色法检测FGG对牙髓干细胞成牙本质分化能力的影响

图4是ALP染色检测FGG对牙髓干细胞成牙本质分化能力的影响图。图4中A为牙髓干细胞成牙本质分化培养5天后ALP染色。图4中B为ALP染色半定量统计学结果。与对照组相比，FGG能更早、更显著促进牙髓干细胞ALP染色，说明FGG可以促进牙髓干细胞的成牙本质分化。

(1)分组：对照组：正常矿化诱导的细胞培养液，

实验组：采用实施例2的试剂盒，含有20μg/mL的FGG。

(2)以0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的牙髓干细胞制成单细胞悬液(细胞数1×105)，接种于24孔板，含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的L－EMEM培养基，每3天换液一次，培养至细胞融合度大于60-70％。

(3)改为对照组和实验组的培养基处理牙髓干细胞。每2-3天换液一次。

(4)5天后吸去培养基，弃上清，每孔加入500uL PBS清洗细胞2次，室温下用多聚甲醛固定液固定细胞3至5min；

(5)吸净固定液，避光下用0.5ml的染色液染细胞15min；

(6)轻柔的吸净0.5ml的染色液。

(7)最后用PBS清洗3-5次。拍照。

(8)结果显示：与对照组相比，实验组中FGG能明显促进牙髓干细胞的成牙本质分化能力。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (9)

1.一种纤维蛋白原γ链作为制备牙髓牙本质再生试剂的应用，其特征在于：纤维蛋白原γ链作为生长因子在牙齿再生领域的新用途。

2.根据权利要求1所述一种纤维蛋白原γ链作为制备牙髓牙本质再生试剂的应用，其特征在于：所述纤维蛋白原γ链作为生长因子促进牙髓干细胞成牙本质分化。

3.根据权利要求1或2所述一种纤维蛋白原γ链作为制备牙髓牙本质再生试剂的应用，其特征在于：所述纤维蛋白原γ链提高了牙髓干细胞成牙本质分化的效率。

4.一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒，其特征在于：包括有纤维蛋白原γ链，作为生长因子促进牙髓牙本质再生。

5.根据权利要求4所述一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒，其特征在于：还包括有：细胞培养基、胎牛血清、地塞米松、抗坏血酸。

6.根据权利要求5所述一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒，其特征在于：包括有体积比的成分：

7.根据权利要求5或6所述一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒，其特征在于：还包括体积比的成分：

10mM的磷酸甘油 0.5-1.5％

双抗药 0.5-1％。

8.根据权利要求7所述一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒，其特征在于：包括有体积比的成分：

9.根据权利要求4或5所述一种促进牙髓牙本质再生的试剂盒，其特征在于：所述细胞培养基为DMEM培养基或L-DMEM培养基；所述双抗药为青链霉素混合液，或者为抗生素、抗真菌药。

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