CN104981547A

CN104981547A - 高功能植入体材料

Info

Publication number: CN104981547A
Application number: CN201380072455.8A
Authority: CN
Inventors: 上田实
Original assignee: QUARRYMEN CORP
Current assignee: QUARRYMEN CORP
Priority date: 2012-12-26
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2015-10-14
Also published as: JPWO2014104246A1; EP2940146A4; US20160193387A1; EP2940146A1; JP2017061486A; JP6033888B2; HK1211321A1; KR20150108843A; WO2014104246A1; SG11201505045SA

Abstract

本发明的目的在于提供一种植入体制造用的细胞生成物的制备方法、利用上述方法生成的生成物、使用了上述生成物的高功能植入体，该细胞生成物能够以简便的方法提高材料的表面特性，并且能够使骨与金属植入体材料在一定期间充分进行一体化。由骨髓间质细胞或永生化乳牙干细胞制备含有由这些细胞产生的Col-I、OCN、OPN、BSP、纤连蛋白和VEGF等生长因子的细胞生成物，使用所得到的细胞生成物和钙化溶液，可提供在表面固定有这些生长因子的高功能植入体。

Description

高功能植入体材料

技术领域

本发明涉及使用骨髓间质细胞(BMCs)或永生化乳牙干细胞的产生物的高功能植入体材料。更详细地说，本发明涉及在表面涂覆有上述BMCs骨髓间质细胞或永生化乳牙干细胞的产生物的高功能植入体材料。

背景技术

牙科治疗的目的之一在于使用人工材料来恢复缺损牙齿的功能和形状。因此，为了补上缺损的牙齿等，作为最普遍的治疗，使用植入体。

原本来说，为了使缺损的牙齿等发挥出充分的功能，需要使植入体稳定化，从而希望植入体与牙槽骨一体化。因此，作为这样的植入体材料，使用了生物玻璃、磷酸钙陶瓷(即羟基磷灰石和β-磷酸三钙)、其它生物活性材料和金属材料。

若从与骨一体化的方面考虑，则上述生物活性材料在生物体亲和性高这一点上是优异的。另一方面，由于对牙齿要施加较大的力，因而若从强度、耐久性之类的机械特性的方面考虑，则金属材料是优异的。于是，在这样的金属材料中，从生物体亲和性和成本等方面考虑，广泛使用钛(以下称为“Ti”)作为植入体材料。

作为提高植入体材料的表面特性的技术，有人提出了下述植入体，该植入体在表面能够吸引选自由人间叶干细胞和成骨细胞组成的一组中的细胞、或者能够吸引选自由牛血浆白蛋白、牛血清白蛋白(Fraction V)和牛血清纤连蛋白组成的一组中的蛋白质，且在表面具有带正电荷的金属氧化物(下文中称为“现有技术1”)。

另外，已知金属植入体在骨中的一体化要依赖于骨的再生能力。于是，为了提高该在骨中的一体化能力，在植入体材料表面进行了骨形成试剂或生长因子的应用。在迄今为止的报告(下文中称为“现有技术2”)中有人指出，在将多肽或细胞固定于利用粘多糖进行了涂覆的植入体上时，可改善移植后的骨融合和骨修复。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利公表2012-509750

专利文献2：日本专利公表2004-531461

发明内容

发明所要解决的课题

若与未对金属植入体材料表面进行处理的情况相比，则上述的现有技术在与骨的一体化方面有进步，从这方面考虑其是优异的。但是，若与使用生物体亲和性高的生物活性材料的情况相比，则其具有与骨的一体化仍不充分的问题。

另外，在金属植入体材料表面的处理中，按照首先进行对金属植入体表面进行活化的前处理、其后利用骨形成试剂进行处理或者应用生长因子的步骤来进行，因而操作复杂。进而，在金属植入体材料表面应用生长因子的情况下，固定于其表面的生长因子的保持期限会成为问题。这是由于，若在金属植入体材料表面的保持期限比骨与金属植入体材料的一体化所需要的时间短，则无法期待充分的一体化。

因此，对于可利用简便的方法提高材料的表面特性、并且可使骨与金属植入体材料在一定期间内充分达成一体化具有强烈的社会需求。

解决课题的手段

本发明是基于上述状况而完成的。

即，本发明的第1方式涉及一种细胞生成物的制备方法，其具备下述工序：预备培养工序，在含有5～15％血清、50～150U/mL青霉素和50～150μg/mL链霉素的培养液中加入5×10³～5×10⁴个/mL骨髓间质细胞或永生化乳牙干细胞，在5％CO₂存在下于34～37.5℃进行预备培养；细胞分选工序，分选出具有特定形状和粘附性的上述细胞；以及培养上清收集工序，对于通过上述分选工序分选出的细胞在与预备培养相同的条件下进行培养，对培养开始后40～56小时的培养上清进行收集。

此处，上述骨髓间质细胞优选由大鼠的大腿骨得到，永生化乳牙牙髓干细胞优选来源于选自由猪牙髓和人乳牙组成的组中的任意的细胞。上述细胞优选在37℃进行培养。

此外，上述细胞分选工序中的特定形状优选为梭状且为纺锤型。上述培养上清优选在培养开始后44～52小时进行收集、更优选在培养开始后48小时进行收集。

此处，上述培养液优选为选自由Dulbecco培养基、Iscove改良Dulbecco培养基、Ham’s F12培养基、和RPMI1640培养基组成的组中的至少一种以上的培养基。此外，上述血清优选为选自由胎牛血清、牛血清、马血清、人血清以及绵羊血清组成的组中的至少一种以上的血清。进而，上述培养液优选含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素以及100μg/mL链霉素。

另外，上述制备方法优选进一步具备下述工序：沉淀物制备工序，进行离心和乙醇沉淀处理来制备沉淀物；以及冷冻干燥工序，对通过上述沉淀物制备工序得到的沉淀物进行冷冻干燥。

本发明的第2方式涉及一种细胞生成物，其通过上述的制备方法来制备。在上述细胞生成物中优选至少含有I型胶原蛋白(Col-I)、纤连蛋白、核心蛋白聚糖和血管内皮生长因子(VEGF)，更进一步优选除此之外还进一步含有胰岛素样生长因子结合蛋白7、卵泡抑素相关蛋白、金属蛋白酶抑制剂I、组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂、肌动蛋白以及巯基氧化酶I、SPARC、胶原蛋白α2(IV)链、β-2-微球蛋白、RhoGTP酶激活蛋白18。

本发明还涉及一种高功能植入体的制作方法，其特征在于，其具备下述工序：清洗工序，利用有机溶剂清洗植入体材料的表面，制成清洗植入体材料；浸渍工序，将上述清洗植入体材料在具有特定组成的第1钙化溶液中在特定温度下浸渍3～6小时，制成浸渍植入体材料；以及处理工序，将上述浸渍植入体材料利用含有特定浓度的细胞生成物的第2钙化溶液进行2～5天培养处理。

此处，上述植入体材料优选由选自由钛、氧化锆、羟基磷灰石以及β-TCP组成的组中的任意材料形成。并且，上述有机溶剂优选为丙酮与60～80％乙醇。进一步地，上述第1钙化溶液优选为100～150mM NaCl、2.5～3.5mM CaCl₂·H₂O、1.5～2.5mMK₂HPO₄、25～75mM Tris-HCl(pH 7.2～7.6)，更优选为136.8mM NaCl、3.10mM CaCl₂·H₂O、1.86mM K₂HPO₄、50mM Tris-HCl(pH 7.4)。

进而，优选上述特定温度为36～38℃、浸渍时间为4小时。上述特定细胞生成物优选为上述细胞生成物的5～20mg/mL的水溶液、更优选为约10mg/mL。

本发明的第3方式涉及一种高功能植入体，其通过上述任意方法来制作。此处，上述植入体材料优选由选自由钛、氧化锆、羟基磷灰石以及β-TCP组成的组中的任意材料形成。

上述植入体优选在表面至少保有I型胶原蛋白(Col-I)、纤连蛋白以及核心蛋白聚糖，更优选在表面进一步具有选自由胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGF-binding protein7)、卵泡抑素相关蛋白、金属蛋白酶抑制剂I、组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂、肌动蛋白以及巯基氧化酶I组成的组中的至少1种以上的蛋白质。

发明的效果

利用本发明的制备方法能够制备一种细胞生成物，其由骨髓间质细胞或永生化乳牙牙髓干细胞产生，含有Col-I、核心蛋白聚糖、波形蛋白、IGF-结合蛋白7、纤连蛋白、SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)等。并且，使用该细胞生成物能够简便地制作高功能植入体。

进而还能够得到可在短期间内与骨进行一体化的高功能植入体材料。

附图说明

图1为使用扫描型电子显微镜(SEM)拍摄的Ti植入体表面的电子显微镜照片。图1中，图1(A)和图1(D)示出了利用PBS(磷酸缓冲生理盐水)进行处理的情况下的表面，图1(B)和图1(E)示出了利用DMEM(Dulbecco的α-MEM)进行处理的情况下的表面，图1(C)和图1(F)示出了利用CM(细胞培养的培养上清)进行处理的情况下的表面。

图2为示出了在如上述那样进行了处理的Ti植入体(下文中有时称为“Ti板”)表面接种1.0×10⁶个细胞、在24小时后发生了粘附的细胞数的图(ANOVA检验。图中，*表示p<0.05)。

图3为在具有经固定化的DMEM或CM的Ti板表面上培养的大鼠BMSCs的凝胶电泳像(A)～(C)以及将其定量化的曲线图(D)～(F)。

图4为体内的Ti植入体上的QD标记的生物体分子的检测图像。图中，PBS、DMEM和CM如上所述。

图5为表示从上述牙髓细胞中选择的永生化干细胞以及不是永生化干细胞的细胞的个体倍增次数与培养期间的关系的曲线图。图1中，SHED-T表示永生化干细胞、SHED-C表示不是永生化干细胞的细胞。

图6是表示SHED-C和SHED-T中的STRO-1表达的结果的曲线图(图2(A)～(D))。图中，PD20表示个体倍增次数＝20次、PD30表示个体倍增次数＝30次、并且PD40表示个体倍增次数＝40次。

图7为示出在图8所示的各个体倍增时间时的SHED-C与SHED-T的组织染色像的图。

图8为示出个体倍增时间(次数)与新生骨量的关系的曲线图，图中，**表示p<0.05、***表示p<0.01。新生骨量由下述计算式求出。新生骨量＝新生骨面积/视野面积×100

图9为表示大鼠的大腿骨Ti植入体的扭矩去除的值的曲线图(N＝3)。利用PBS、DMEM或CM进行28天观察(ANOVA检验。*表示p<0.05、**表示p<0.01)。

图10为表示大腿骨的海绵骨或皮质骨中的骨-植入体接触(Bone-to-implantcontact、下文中简称为“BIC”)的变化的曲线图(N＝3)。(A)表示海绵骨、(B)表示皮质骨。图中，在ANOVA检验的结果中，*表示p<0.05、并且**表示p<0.01。

图11为表示利用本发明的细胞生成物进行处理的情况下与未进行处理的情况下的植入体稳定性的经时变化的曲线图(N＝3)。图中，在ANOVA检验的结果中，*表示p<0.05。

图12为表示在利用PBS处理的情况下以及利用本发明的细胞生成物处理的情况下的细胞数的差异的曲线图(N＝3)。图中，P为在大气压下进行等离子体处理的情况，N为未进行等离子体处理的情况。另外，在ANOVA检验的结果中，*表示p<0.05、并且**表示p<0.01。

图13为利用DAPI(4',6-二氨基-2-苯基吲哚)和鬼笔环肽对图12的情况下的细胞增殖进行染色、并利用荧光显微镜进行观察的结果(N＝3)。图中，比例条表示100μm。

图14示出了在4℃、-15℃和-80℃将本发明的细胞生成物保存1周(1W)、2周(2W)和1个月(1M)、并将它们以同等量添加到培养基中后的细胞增殖率的变化(N＝3)。

具体实施方式

下面对于本发明的骨髓间质细胞的生成物的制备方法进行详细说明。

本发明的制备方法具备下述工序：(a)预备培养工序，在含有5～15％血清、50～150U/mL青霉素和50～150μg/mL链霉素的培养液中加入5×10³～5×10⁴个/mL骨髓间质细胞或永生化乳牙干细胞，在5％CO₂存在下于34～37.5℃进行预备培养；(b)细胞分选工序，分选出具有特定形状和粘附性的上述细胞；以及(c)培养上清收集工序，对于通过上述分选工序分选出的细胞在与预备培养相同的条件下进行培养，对培养开始40～56小时后的培养上清进行收集。

此处，出于获得和处理容易的原因，上述培养液优选为选自由Dulbecco培养基(以下有时称为“DMEM”)、Iscove改良Dulbecco培养基(以下有时称为“IMDM”)、Ham’s F12培养基(以下有时称为“Ham12”)、和RPMI1640培养基组成的组中的至少一种以上的培养基。上述培养基是被称作基本培养基的培养基，可由GIBCO社、SIGMA社等购入。这些培养基之中，还可以将两种以上合用，以混合培养基的形式进行使用。作为混合培养基的一例，可以举出将IMDM与HamF12等量混合得到的培养基(例如以商品名IMDM/HamF12(GIBCO社)进行市售)。

另外，出于细胞的增殖良好、不会在培养上清中产生会成为问题的蛋白质的原因，上述血清优选为选自由胎牛血清、牛血清、马血清、人血清以及绵羊血清组成的组中的至少一种以上的血清。

作为可在培养基中添加的成分，除了上述血清以外，还可以举出血清替代物(Knockout serum replacement(KSR)等)、牛血清白蛋白(BSA)；青霉素、链霉素、庆大霉素等抗生物质；维生素K、叶酸等各种维生素类；钙、镁等各种矿物质；精氨酸、色氨酸等氨基酸等。

在本发明的制备方法中，从可得到含有充分量的细胞增殖因子组的培养上清的方面考虑，优选使用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素以及100μg/mL链霉素的培养液。

此外，本发明还可以为进一步具备下述工序的方法：(d)沉淀物制备工序，进行离心和乙醇沉淀处理来制备沉淀物；以及(e)冷冻干燥工序，对通过上述沉淀物制备工序得到的沉淀物进行冷冻干燥。

出于能够确实地获得可稳定生成一定种类的细胞生长因子的细胞的原因，优选上述骨髓间质细胞来源于选自由大鼠的大腿骨、猪下颚和牙齿以及人乳牙组成的组中的任意细胞。

此处，细胞生长因子为参与特定的细胞的增殖、分化等的多肽性因子的总称，也包括对免疫系统进行调节的淋巴因子、细胞因子等。有时也被称为增殖因子、细胞增殖因子。下文中，有时将细胞生长因子简单称为“生长因子”。

已知生长因子参与生物体内的各种细胞进程、生理进程的调节，它们与位于靶细胞表面的受体蛋白(下文中有时简单地称为“受体”(receptor))特异性地结合并进行信号传递。

作为代表性的生长因子，可以举出：上皮生长因子(Epidermal growth factor：EGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor：IGF)、转化生长因子(Transforming growthfactor：TGF)、神经生长因子(Nerve growth factor：NGF)、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor：BDNF)、血管内皮细胞生长因子(Vesicularendothelial growth factor：VEGF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte-colony stimulatingfactor：G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage-colonystimulating factor：GM-CSF)、血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor：PDGF)、促红细胞生成素(Erythropoietin：EPO)、血小板生成素(Thrombopoietin：TPO)、碱性成纤维细胞增殖因子(basic fibroblast growth factor：bFGF或FGF2)、肝细胞增殖因子(Hepatocyte growth factor：HGF)等。

TGF-β为自然界中存在的增殖因子之一。与其它多种信号通路同样地，在组织的产生、细胞的分化、胚胎的发育中发挥出极为重要的作用。

β型变异增殖因子TGF-β在肾脏、骨髓、血小板等大致全部的细胞中产生，存在5种亚型(β1～β5)。TGF-β1～β3在骨基质中以无活性型的形式进行蓄积，在骨吸收时被破骨细胞释放出的酸所活化。TGF-β可促进成骨细胞的增殖和胶原蛋白等间叶细胞的合成、增殖，但对于上皮细胞的增殖和破骨细胞具有抑制性作用。

在具有酪氨酸激酶活性的上述受体中，由于生长因子的结合，蛋白质中的酪氨酸残基被磷酸化，引起细胞的增殖、分化。另外，在个体发生时，还有生长因子变成中胚层诱导物质的示例。

上述生长因子从它们的结构和进化方面可分类成相关的几个家族。作为这些家族，可以举出TGF-β、骨形成蛋白(bone morphogenic protein：BMP)、神经营养因子(neurotrophin)、成纤维细胞增殖因子(FGF)等。上述神经营养因子中包含NGF、BDNF、NT3等。生长因子目前在医疗中也积极使用。

另外，TGF-β是构成TGF-β超家族的1个成员，该超家族中包括在生物的骨形成中发挥出重要作用的骨形成蛋白(bone morphogenic protein：BMP)等。

在本发明的培养上清中优选含有胶原蛋白α-1(I)链、胶原蛋白α-2(I)链、波形蛋白、胶原蛋白α-1(IV)链、IGF结合蛋白7(IGFBP7)、纤连蛋白、核心蛋白聚糖、血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂1、肌动蛋白(细胞质性2)、巯基氧化酶1、SPARC、金属蛋白酶抑制剂-1、胶原蛋白α-2(IV)链、SCP2、72kDa IV型胶原酶、β-2-微球蛋白、Rho GTP酶激活蛋白18等各种蛋白质。

此处，胶原蛋白为由3根α链构成的三重螺旋结构的分子，已知有I型、II型、III型、IV型、V型等多种类型。各型分子由相同种类或不同种类的多肽链形成。该多肽链(α链)的种类已知有30种以上，被称为α1(I),α2(IV)等。

胶原蛋白的蛋白质家族被如下进行分类。

1)可形成特异的具有67nm的周期性横纹结构的纤维的分子组(I型、III型、V型(主要为软骨以外的组织))、II型、XI型(软骨组织)

2)在这些纤维表面结合的分子组(XII型、XIV型(软骨以外的组织)、IX型(软骨组织))

3)形成网眼状的缔合体的分子组(主要为形成基底膜的骨架的IV型胶原蛋白)、形成细胞外的微细纤维的VI型、用于形成从皮肤等的表皮基底细胞穿透基底板而存在的锚原纤维的VII型

4)形成六边形晶格的X型(在软骨向骨转变的时期暂时性存在)、形成眼睛的核膜的后弹性层的六边形结构(也在血管等组织中存在)并具有贯通细胞膜的结构域的XIII型、XV型、XVII型、XVIII型

波形蛋白是在成纤维细胞、白血球细胞等间叶系细胞中特异性表达的中间纤维蛋白。通过基于各种蛋白激酶的磷酸化，波形蛋白纤维的构建受到调节。已知其在发生的过程中暂时性表达。

胰岛素样增殖因子结合蛋白7(insulin-like growth factor-binding protein 7：IGFBP7)与IGF-1受体结合，抑制胰岛素样增殖因子对IGF-1受体的活化。因此，IGFBP7是一种其存在量与肿瘤的进展显示出逆相关的蛋白质。

纤连蛋白为形成细胞外基质的糖蛋白，分子量约为250kDa的多肽形成二聚物。主要促进成纤维细胞、肝细胞、神经细胞等的粘附。藉由作为细胞膜表面的特异性受体的整联蛋白的作用，除了参与细胞粘附外，还参与细胞移动、吞噬作用的促进等，进而在组织损伤部位也发挥出作用。

核心蛋白聚糖是在小型硫酸皮肤素蛋白聚糖、骨蛋白聚糖II、PG-40、PG-II、PG-2、DS-PGII、38kDa(分子量3.8万)的核心蛋白中具有1根硫酸软骨素混合链的蛋白聚糖，与胶原蛋白纤维结合存在。广泛分布于软骨、骨、肌腱、皮肤、巩膜、大动脉等的动物结缔组织中。

血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂(PAI)与在纤维朊的溶解中发挥重要作用的组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂β结合并抑制其作用。最重要的是在血管内皮中产生的PAI-1，其也在血小板中存在。此外还有在胎盘中产生的PAI-2、抑制活化蛋白C(APC)的PAI-3。PAI-1在血中的浓度的增加成为血栓倾向的原因，是一种急性期蛋白质，午后高于午前，并且与血中的甘油三酯正相关。

肌动蛋白(胞质性2)为肌肉的收缩性蛋白质。细胞内的肌动蛋白被认为主要作为肌动蛋白纤维发挥功能。在肌细胞中，肌动蛋白纤维与II型肌球蛋白结合形成肌动球蛋白束，在肌收缩力中起到作用。在包含神经细胞的非肌细胞中，肌动蛋白纤维形成突起状的丝状假足(Filopodia)、作为细胞边缘的波动结构的叶状假足(Lamellipodia)、由与活化的II型肌球蛋白结合的肌动球蛋白束形成的应力纤维(Stress fiber)等多种肌动蛋白结构。

这些肌动蛋白结构的再组成通过藉由Rho家族低分子量G蛋白的细胞内信息传递而进行时空特异性的调节，在细胞运动或细胞分裂等细胞形态的动态调节中承担重要的作用。同时，藉由与非典型肌球蛋白的结合，在沿着肌动蛋白纤维的小胞输送中发挥作用。除了这样的动态效果以外，肌动蛋白纤维还在细胞膜的正下方聚集，形成细胞皮质(cell cortex)的衬里结构，并且还藉由α-链蛋白或粘着斑蛋白与作为细胞粘附因子的钙粘附蛋白结合以支持细胞间粘附。

巯基氧化酶1是将R’C(R)SH作为底物的硫醇氧化酶。

SPARC是在骨与牙本质中存在的30kDa的非胶原蛋白性蛋白质，其在真皮形成的功能中发挥出中心性的作用。其由成纤维细胞分泌出，提高胶原蛋白与透明质酸的合成。

金属蛋白酶抑制剂(TIMP、Tissue Inhibitors of Metallo-Proteinases)为控制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase：MMP)的活性的内源性抑制物质。MMP为锌金属蛋白酶家族，控制从细胞中分泌出的细胞外基质的代谢。目前，已知具有不同抑制形式的4种TIMP、也即TINP-1～4，根据组织的不同，与MMP的流入相应地以不同水平进行表达。TIMP-1与TIMP-2均与大部分的MMP活性部位结合，不可逆地抑制它们的活性。并且，这2种TIMP与各种细胞直接作用，显示出增殖促进活性。

SCP2是指以石油、天然气、醇、废糖蜜、农作物等作为发酵原料进行大量生产的微生物菌体或从菌体中提取的蛋白提取物。其也被称为“单细胞蛋白质”，有时也指对酵母、细菌、丝状菌、藻类等富含蛋白质的单细胞生物进行杀菌并进行干燥而得到的物质。

72kDa IV型胶原酶也被称为明胶酶，明胶酶之中，A酶被称为72kDa IV型胶原酶(MMP-2)。95kDa的B酶被称为MMP-9。MMP-2具有插入到催化剂结构域的3个重复II型纤连蛋白结构域，与MMP-9一起属于MMPs的明胶酶组。MMP-2相对于胶原蛋白I、IV、V、VII、X、XIV；明胶(gelatin)；弹性蛋白、层粘连蛋白-1、层粘连蛋白-5、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein)；MMP-1、MMP-9、MMP-13显示出直接或间接的底物特异性。

β-2-微球蛋白为构成组织相容性抗原(Class I)的二根链中的轻链。其不具有显示出组织相容性抗原特异性的抗原性。

Rho GTP酶激活蛋白是分子量为2～3万的不具有亚单位结构的一组G蛋白，构成超家族。该超家族被分类为Ras、Rho、Rab、Arf、Ran这5组。Rho GTP酶激活蛋白为属于其中的Rho的蛋白质。Rho蛋白质藉由肌动蛋白纤维的再组成对于平滑肌的收缩或细胞质分裂、细胞运动、细胞形态进行调节。

骨髓间质细胞是指存在于骨髓中、可通过骨髓穿刺容易地采集、且维持造血的细胞。此处，骨髓中包括大致分为血液细胞和对血液细胞进行支持的间质细胞这2种细胞，骨髓间质细胞包含在后者中。血液细胞进行培养时以悬浮状态进行增殖，而骨髓间质细胞进行附壁增殖。其形状与间叶系细胞相同，但在骨髓中采用细网结构。可与通常的成纤维细胞同样地进行培养。原本来源于间叶系的间质细胞分化成各种细胞。骨髓间质细胞被分化诱导为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞。

牙髓细胞为牙齿的神经中所含有的干细胞的一种。牙髓细胞受到牙齿之类的硬质材料所保护，由于牙齿不会透过紫外线或放射线，因而可以说基因也不容易被损伤。

永生化乳牙干细胞为对于从乳牙得到的牙髓干细胞进行永生化而得到的细胞，牙髓干细胞为牙齿的神经中所含有的干细胞的1种。牙齿由硬质材料形成，对牙髓进行物理性保护，不会透过紫外线或放射线，因而可以说基因也不容易被损伤。

永生化干细胞如下进行制作。首先，将脱落乳牙利用例如氯己定、聚维酮碘溶液等消毒药进行消毒。接下来，在将动物的大腿骨作为供源(ソール)的情况下，例如，在装满PBS等的注射器上选择可紧紧地插入该动物的大腿骨的髓腔处的粗度的注射针，从而冲压出骨髓细胞，由此进行取出。另外，在为猪的牙齿或人脱落乳牙的情况下，分离出各自的齿冠部，利用牙医铰刀回收牙髓组织。

将所采集的骨髓间叶细胞或牙髓组织悬浮在基本培养基、例如含有5～15％牛血清(下文中称为“CS”)和50～150单位/mL抗生物质的Dulbecco改良Eagle’s培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，下文中称为“DMEM”)中。接着，使用1～5mg/mL的胶原酶和1～5mg/mL的分散酶，在37℃处理0.5～2小时。

作为上述基本培养基，可向上述培养基、例如DMEM中添加胎牛血清，酶处理后，进行3～10分钟的离心操作(3,000～7,000转/分钟)，回收牙髓细胞。根据需要使用细胞过滤网进行细胞的分选。分选出的细胞利用例如3～6mL的上述基本培养基进行再悬浮，接种到直径4～8cm的贴壁细胞培养用培养皿中。

接下来，添加培养液、例如添加含有10％FCS的DMEM，之后利用5％CO₂培养箱在37℃进行培养，例如每2～3天交换培养基，进行2周左右的培养。期间进行2～4次的传代。确认到半融合后，除去上述培养液，利用PBS等对细胞进行1次～数次清洗。也可以不进行培养液的去除和细胞的清洗而回收形成有菌落的粘附性的牙髓干细胞。粘附性的牙髓干细胞例如利用0.025～0.1％的胰蛋白酶和0.3～1mM的EDTA在37℃处理数分钟，从培养皿剥离，接下来回收细胞。

在牙髓干细胞的情况下，在酶处理后进行3～10分钟的离心操作(3,000～7,000转/分钟)，回收牙髓细胞。根据需要使用细胞过滤网进行细胞的分选。分选出的细胞利用例如3～6mL的上述基本培养基进行再悬浮，接种到直径4～8cm的贴壁细胞培养用培养皿中。

接下来，添加培养液、例如添加含有10％FCS的DMEM，与上述同样地进行所期望期间的培养，利用PBS等对细胞进行1次～数次清洗，得到粘附性细胞。

在使用大鼠骨髓细胞的情况下，优选将有大鼠大腿骨的髄腔得到的骨液(约30～100μL/大腿骨)放入到含有约5～15％的胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素(和光纯药工业(株))的DMEM中，在5％CO₂培养箱中在37℃进行2～4代预备培养，选择具有所期望的特征的细胞。

例如，将骨液(约50μL/大腿骨)加入到含有10％FBS、上述浓度的青霉素和链霉素的DMEM中，在5％CO₂培养箱中在37℃进行3代预备培养，在后述的分选工序中选择梭状和具有粘附性等特征的细胞。

如上得到分选出的粘附性细胞(干细胞)。接下来，例如将干细胞接种在贴壁细胞培养用培养皿中，在5％CO₂、37℃的条件下进行培养。

在使用由大腿骨得到的BMSCs的情况下，仅选择梭状和具有粘附性等特征的细胞来使用。

关于传代培养，例如在用肉眼观察达到半融合或融合时，如上述那样使用胰蛋白酶和EDTA将细胞从培养容器中剥离并进行回收，再次播种到加入有培养液的培养容器中。

此处，半融合是指在培养容器中的细胞附着面的约70％有细胞附着的状态。例如，进行1～8次传代培养，使分选出的细胞增殖到必要的细胞数、例如约1×10⁷个/mL。在如上述那样进行培养后，回收细胞，保存在液氮中。由各种供体回收的细胞也可以以牙髓干细胞库的形态进行保存。

在制作永生化干细胞的情况下，对如上述那样得到的干细胞进行初期培养，得到初期化培养细胞。如下所述向该初期培养细胞中导入hTERT、bmi-1、E6、E7。制备用于插入上述基因的质粒，将其插入到穿梭载体、例如pSuttle2中，克隆上述基因。利用该穿梭载体转化大肠杆菌，选择卡那霉素抗性转化体。对所选择的卡那霉素抗性转化体的质粒DNA进行提纯，分析限制酶部位，鉴定重组体。

接着，使用限制酶、例如PI-Sce I和I-Cue I，将表达盒从上述穿梭载体中切出，将其与腺病毒载体、例如，Adeno-X病毒DNA连接。将所得到的连接产物利用Swa I切断，使用其来转化大肠杆菌。

此处，hTERT为端粒修复酶的基因，bmi-1是作为构成多梳复合物的蛋白质之一的Bmi-1的基因。此处，Bmi-1对于造血干细胞的维持是必要的，其具有可通过活性增强来增加造血干细胞这样的作用。

E6和E7为HPV-16或HPV-18的DNA的初期基因。另外，Oct3/4是与Sox2协同来活化靶基因的转录的基因。Klf4(Kruppel型转录因子4)对于与细胞分裂和胚胎发生相关的基因进行调节，作为消化器系统癌症的癌抑制因子而有关联。

Sox2属于SRY相关HMG盒基因家族，是已知参与维持功能的未分化性(多能性)的基因。c-Myc为致癌基因，是对于由c-Myc诱导的肿瘤内的细胞生存与死亡这两者进行促进的基因。p16INK4a是在癌细胞的细胞循环控制中发挥出重要作用的基因。

从所得到的转化体中选择氨苄青霉素抗性转化体。对插入有上述基因的重组腺病毒DNA进行提纯，分析限制酶部位，鉴定重组体。

接下来，利用Pac I消化重组腺病毒，将其转染至HEK293细胞。使重组腺病毒增殖，将其收集，测定病毒的滴度。按照常规方法提纯病毒，使其感染作为靶细胞的SHED。

将病毒感染后的细胞组按照常规方法利用FITC染色，使用流式细胞仪检测STRO-1阳性细胞。此处，STRO-1被认为是骨髓中的具有多分化能力的间叶系干细胞的标记之一，为细胞永生化的指标。

通过上述过程可得到骨髓间质细胞、牙髓细胞以及牙髓来源的永生化乳牙干细胞。

从用于得到这些细胞的原始资源容易获得、以及可稳定地得到生成上述生长因子的细胞的方面考虑，如上述那样得到的骨髓间质细胞、牙髓细胞和永生化乳牙牙髓细胞优选使用大鼠、猪或人乳牙来源的材料。并且，在(a)的预备培养工序中，优选在37℃对这些细胞进行培养。

另外，在上述细胞分选工序中，优选分选出梭状且为纺锤型的具有粘附性的细胞。进而，从为梭状且为纺锤型的具有粘附性的细胞含量多的方面考虑，优选在对上述培养上清开始培养44～52小时后的上述培养上清进行收集。另外，从可得到具有更高的粘附性的细胞的方面考虑，优选对培养开始48小时后的培养上清进行收集。

在上述培养上清中，出于促进金属植入体材料与骨的一体化的原因，优选至少含有上述分选出的细胞所产生的I型胶原蛋白(Col-I)、纤连蛋白、核心蛋白聚糖、血管内皮生长因子(VEGF)以及骨唾液酸蛋白(BSP)；出于进一步促进金属植入体材料与骨的一体化的原因，优选进一步含有选自由胰岛素样生长因子结合蛋白7、卵泡抑素相关蛋白、金属蛋白酶抑制剂I、组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂、肌动蛋白以及巯基氧化酶I、胰岛素样生长因子(IGF)-1、干细胞增殖因子(HGF)以及TGF-β组成的组中的至少一种以上的蛋白质。

接着，在沉淀物制备工序中，对如上述那样得到的培养上清进行离心，接下来进行乙醇沉淀处理来制备沉淀物。例如，在0～10℃，以1,000～2,000rpm离心3～10分钟、以2,500～3,500rpm离心1～5分钟，除去不需要的细胞。接下来，加入离心上清的约8～12倍容量的乙醇，在-5～15℃培养30～90分钟，在2～6℃以10,000～20,000rpm离心10～20分钟，去除上清，得到沉淀物。之后，对于上述沉淀物制备工序得到的沉淀物进行冷冻干燥。例如在80～95％的冰冷乙醇中进行再悬浮，在2～6℃以10,000～20,000rpm离心10～20分钟，去除上清，将沉淀物在-60～90℃冷冻进行冷冻干燥。

利用上述方法可得到上述细胞的生成物。从保持活性的方面出发，优选将所得到的上述细胞生成物在-20～-40℃进行保存。

接下来，使用如上述那样得到的冷冻干燥品，按下述方式制造高功能植入体。具体地说，通过具备下述工序的方法来制作：(f)清洗工序，利用有机溶剂清洗植入体材料的表面，制成清洗植入体材料；(g)浸渍工序，将上述清洗植入体材料在具有特定组成的钙化溶液中在特定温度下浸渍3～6小时，制成浸渍植入体材料；以及(h)处理工序，将上述浸渍植入体材料利用含有特定浓度的细胞生成物的溶液进行处理。

此处，从在生物体组织中的亲和性和加工性优异、获得的容易性的方面考虑，优选上述植入体材料由选自由钛、氧化锆、羟基磷灰石以及β-TCP组成的组中的任意材料形成。它们之中，出于利用干细胞培养上清进行的加工容易、效率也高的原因，进一步优选使用钛(Ti)。

另外，作为上述有机溶剂，出于植入体材料表面的清洗效果高的原因，优选使用丙酮与60～80％(v/v)乙醇。另外，使乙醇浓度为60～80％(v/v)的原因在于，若该浓度小于60％，则清洗力弱；而即使超过80％，也得不到在其以上的清洗效果。优选使用约70％的乙醇。

接着，将如上述那样进行了清洗的植入体材料在具有特定组成的钙化溶液中浸渍3～6小时。从钙化效率的方面考虑，优选上述第1钙化溶液的组成为100～150mMNaCl、2.5～3.5mM CaCl₂·H₂O、1.5～2.5mM K₂HPO₄、25～75mM Tris-HCl(pH 7.2～7.6)，为了提高钙化的效率，上述组成更优选为136.8mM NaCl、3.10mM CaCl₂·H₂O、1.86mM K₂HPO₄、50mM Tris-HCl(pH 7.4)。

此处，使浸渍时间为3～6小时的原因在于，若浸渍时间不足3小时，则具有钙化不充分这样的问题；而即使超过6小时，也得不到在其以上的效果。为了进行充分的钙化，优选使浸渍时间为4小时。

另外，为了成为浸渍在后述第2钙化溶液中的事前准备，浸渍优选在36～38℃进行、更优选在37℃进行。

通过将如上所述进行了浸渍处理的植入体材料在含有特定浓度的培养物的第2钙化溶液中进行特定时间的培养处理，使Col-I、BSP、VEGF等生长因子进行附着。出于这些蛋白质的附着效率高的原因，上述第2钙化溶液优选为130～160mMKNO₃、1～2mM Ca(NO₃)₂·4H₂O、0.5～1.5mM K₂HPO₄(pH 7.0～7.8)的组成。

具体地说，出于能够使充分量的上述生长因子附着在植入体表面上的原因，优选对于以5～20mg/mL含有如上述那样得到的细胞培养物(细胞生成物)的冷冻干燥品的142.8mM KNO₃、1.5mM Ca(NO₃)₂·4H₂O、0.9mM K₂HPO₄(pH 7.4)的水溶液在室温下进行约2～5天的培养处理。从高功能植入体的制作效率的方面考虑，进一步优选培养时间为3天。

此处，水溶液的浓度为上述5～20mg/mL的原因在于，该浓度小于5mg/mL时，所附着的生长因子的量不足，具有与牙槽骨的粘附性弱的问题；另一方面，即使该浓度超过20mg/mL，也得不到在其以上的高粘附性。出于能够确保与牙槽骨的充分的粘附性的原因，进一步优选利用10mg/mL浓度的水溶液进行处理。

按照上述方式能够得到在其表面至少保有Col-I、骨唾液酸蛋白(BSP)以及VEGF的高功能植入体。在为上述植入体的表面进一步保有IGF-1、HGF以及TGF-β的高功能植入体的情况下，植入体与骨的一体化可在短时间内进行，稳定化效果更高。

实施例

下面使用实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不受下述实施例的任何限制。

(实施例1)

(1)材料与方法

(1-1)动物

6周龄的雌性SD大鼠(n＝15、体重200-230g)购自日本SLC(株)。全部实验按照名古屋大学医学部的实验准则来进行。这些动物在12小时的明暗循环下在室温进行饲养。自由摄取饲料和水。

(1-2)细胞培养

大鼠的BMSCs由大鼠大腿骨的髄腔获得。收集骨髓液(50μL/大腿骨)，在含有10％胎牛血清(FBS、和光纯药工业(株))、青霉素和链霉素(和光纯药工业(株))的Dulbecco改良MEM(DEMEM、Sigma-Aldrich社制造)中，在5％CO₂培养箱中于37℃进行3代预备培养。每2天进行培养基的交换。仅使用梭状和具有粘附性等特征的细胞。

(1-3)CM制备

使培养的BMSC进行增殖直至70～80％融合，利用温的磷酸缓冲生理盐水(PBS)清洗3次，加入含有青霉素和链霉素的无血清DMEM。收集48小时后的培养上清(下文中有时称为“CM”)，以1,500rpm离心5分钟，其后以3,000rpm离心3分钟，除去其它细胞。将5mL的CM与45mL的100％乙醇混合，在-20℃培养1小时。将该混合物在4℃、15,000rpm离心15分钟，除去上清。将CM的沉淀物再次悬浮在冰冷90％乙醇(-20℃)中，在4℃、15,000rpm离心15分钟。将最终沉淀物在-80℃冷冻，进行冷冻干燥，保存在-30℃直至进行使用。作为对照，使用未与细胞接触的无血清DMEM。

(1-4)CM固定Ti植入体螺丝的制备

Ti植入体螺丝(全长5mm、螺纹径2mm、以及螺距1mm)由西岛Medical(株))提供。这些Ti植入体在由前面研究得到的条件下进行制造。

Ti植入体的表面仅利用PBS进行处理、仅利用DMEM或还利用CM进行处理，分别制成PBS处理组(阴性对照组)、DMEM处理组(阳性对照组)和CM/DMEM处理组(试验组)。

各处理组如下进行制备。

首先，将Ti植入体利用丙酮和70％乙醇进行清洗，在第1钙化溶液[含有136.8mMNaCl、3.10mM CaCl₂·H₂O、1.86mM K₂HPO₄的50mM Tris-HCl(pH 7.4)(和光纯药工业株式会社制造)]中于37℃浸渍4小时。

与该浸渍处理并行地制备分别含有CM/DMEM(1mg/mL)、DMEM(3mL)、或者PBS(3mL)的3种第2钙化溶液[142.8mM KNO₃、1.5mM Ca(NO₃)₂·4H₂O、0.9mMK₂HPO₄(和光纯药工业株式会社制造)]。

将5根清洗后的各Ti植入体材料浸渍在上述3种钙化溶液3mL中，在37℃培养3天。培养终止后，取出各Ti植入体材料。

接下来，对于在第2钙化溶液中刚开始培养后和终止后的各Ti植入体材料表面利用扫描型电子显微镜(日本电子株式会社制造)进行观察，将所得到的显微图示于图1(A)～图1(F)。图1(A)～图1(C)以3,000倍进行拍摄、图1(D)～图1(F)以15,000倍进行拍摄。

(A)和(D)示出了对Ti植入体的表面进行机械研磨后的代表性表面形貌。(C)和(E)示出了雪景样的微细结构。(F)中观察到了Ti植入体表面的雪景样的微细结构和微小球(microsphere)。微小球由箭头表示。图中所示的线段在(A)～(C)中为10μm、在(D)～(F)中为2μm。

(2)细胞粘附分析

对于Ti盘(10×10mm；(株)Orpha制造)，按照与在Ti植入体上的固定同样的方法利用任意的PBS、DMEM或CM进行处理。将大鼠BMSCs(1.0×10⁶个)接种在如上述处理后的Ti盘上(N＝3)，使用含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM，在37℃、5％CO₂存在下培养24小时。

将粘附的大鼠BMSCs与0.05％胰蛋白酶-EDTA(Sigma-Aldrich社制造)进行10分钟培养，从Ti盘剥离。利用SEM对Ti盘进行观察，确认到所有的大鼠BMCs被剥离掉。使用血细胞计数器(Sunleadglass(有)制造)对剥离的细胞进行计数。反复3次实验，使用Scheff检验，利用显著性水平5％(p<0.05)，通过单因素方差分析(ANOVA)对统计学上的显著性差异进行统计。结果示于图2。

在PBS处理组和DMEM处理组之间以及PBS处理组和CM处理组之间分别见到了显著差异(*：p<0.05,ANOVA检验)。

(3)利用扫描型电子显微镜(SEM)进行的Ti植入体表面变化的观察

如上所述，利用PBS对表面进行了处理的Ti植入体显示出了图1(A)和(D)所示那样的机械研磨的代表性表面形貌。进行了DMEM固定化的Ti植入体不规则地较宽地显示出雪景样的微细结构(图1(B)和(E))。对于经CM覆盖的Ti植入体的表面来说，在雪景样的微细结构上显示出了微小球(参照图1(C)和(F)的箭头)。这些结果暗示出，CM或DMEM的固定化成分改变了植入体表面的表面形貌。

(4)利用LC/MS/MS进行的Ti植入体表面上的蛋白的鉴定

使用80％乙腈由上述得到的CM/DMEM处理组的Ti植入体材料的表面剥离蛋白质。对剥离后的蛋白质进行冷冻干燥将其粉末化。将粉末化的蛋白质1mg利用100μL的电泳用样品缓冲液稀释，将稀释后的缓冲液10μL使用12％丙烯酰胺凝胶的凝胶供于凝胶电泳。电泳后，使用CBB(考马斯亮蓝)溶液或者Silver Stain Kit(Therimo社制造)分别进行染色。染色后，使用手术刀切下凝胶。

将如上述那样切下的凝胶首先在含有100μL的30％(v/v)乙腈的25mM NH₄HCO₃中清洗20分钟，清洗2次，进行脱染色，其后利用CVE-3100(东京理化机械株式会社制造)进行干燥。关于蛋白质的胶内酶解(in-gel digestion)，使用含有20μg/mL的测序级胰蛋白酶(Promega社制造)的50mM碘乙酰胺(和光纯药工业株式会社制造)/100mM NH₄HCO₃(pH 7.8)100μL，在37℃泡发1小时，加入100μL的25mMNH₄HCO₃，在37℃通宵培养。在含有0.1％的TFA的60％乙腈中在室温下进行20分钟的肽提取，将肽样品在CVE-3100中进行干燥。

使用Paradigm MS4-LCQ Advantage(AMR社制造)进行肽质量指纹图谱法(PMF)。将所得到的肽质谱用于使用the Mascot search engine(www.matrixscience.com)的Swiss-Prot protein knowledgebase(限定于哺乳类的蛋白质)中的Query(检索要求)所使用的肽质量列表的生成。

关于检索参数，按照容许1missed trypsin cleavage的公差、质量公差6100ppm和甲硫氨酸残基的氧化的方式进行设定。关于Query，与所含有的4个以上的肽匹配，在具有与通过Mascot search engine生成的统计学上显著的Mowse(分子量检索；molecular weight search)分数一致的质量时，承认为所鉴定的蛋白质。

接着，利用LC/MS/MS对在Ti植入体上固定的蛋白质和培养上清(CM)中的蛋白质进行检测。在培养上清中检测出了约2,000种的蛋白质，该数目与Ti植入体的表面上大致相同。在Ti植入体的表面上检测出的全部蛋白质均在CM中检测出。由于细胞外基质包括蛋白质、信号传递、蛋白合成和加工、以及生长因子蛋白质，因而使用下述所示的正向引物和反向引物进行蛋白质的检测。

(ALP基因扩增用)

正向引物GCTGTGAAGGGCTTCTTGTC···序列编号1

反向引物CGCCTATCAGCTAATGCACA···序列编号2

(OCN基因扩增用)

正向引物TGAGGACCCTCTCTCTGCTC···序列编号3

反向引物GAGCTCACACACCTCCCTGT···序列编号4

(OPN基因扩增用)

正向引物AGGTCCTCATCTGTGGCATC···序列编号5

反向引物AGACTGGCAGTGGTTTGCTT···序列编号6

(BSP基因扩增用)

正向引物TTCTCGAGAAAAATTTCCA···序列编号7

反向引物TCACTGGTGGTAGTAATAAT···序列编号8

(Col-I基因扩增用)

正向引物CGATGCCATTTTCTCCCTTA···序列编号9

反向引物CTCTGGTACCGCTGGAGAAG···序列编号10

(GAPDH基因扩增用)

正向引物ATGACTCTACCCACGGCAAG···序列编号11

反向引物TTCAGCTCTGGGATGACCTT···序列编号12

[表1]

ALP：碱性磷酸酶；OCN：骨钙蛋白；

OPN：骨桥蛋白；BSP：骨唾液酸蛋白；Col-I：I型胶原蛋白

检测出了作为骨相关蛋白的I型胶原蛋白、骨唾液酸蛋白2、核心蛋白聚糖、骨桥蛋白、骨钙蛋白、纤连蛋白以及血管上皮生长因子A(VEGF A)。结果列于表2。

[表2]

(5)体外大鼠BMSCs的RNA分析

将大鼠BMSCs在利用PBS、DMEM或CM进行了处理的Ti盘上进行培养。固定化和培养方法为与进行细胞粘附分析时相同的方法。对BMSCs进行1天、7天、14天培养。使用TRIZOL试剂(Invitrogen Lifetechnologies社制造)，按照厂家的实验方案从在各盘上培养的大鼠BMSCs提取总RNA。关于cDNA，在含有10×反应缓冲液、5mM dNTP混合物、1U/μL的RNase抑制剂、0.25U/μL的逆转录酶(M-MLV逆转录酶、Invitrogen社)以及0.125μM的随机引物(Takara-Bio(株))的20μL的反应液中由1μg的总RNA进行合成。

为进行sq-PCR，在PCR Thermal Cycler SP(Takara-Bio株式会社制造)中，在下述反应条件下进行25～35循环：95℃30秒、45～60℃30秒以及72℃30秒。

使用大鼠的甘油醛-3-磷酸·脱氢酶(GAPDH)引物作为内部标准。在体外(in vitro)基因表达分析中，使用Scion Image picture-imaging software(Scion社制造)对相对于所移植的培养细胞中的GAPDH的mRNA表达水平(％)进行测定。将所合成的cDNA作为使用表1所示特定引物的下述PCR扩增用的模板来使用。全部实验反复进行3次，对于数据按照显著差异水平5％使用Scheffe检验通过单因素方差分析(ANOVA)进行分析。

结果以OCN、OPN和Col I的基因表达图谱(参照图3(A)～(C))和对其进行定量化的曲线图(参照图3(D)～(F))的形式示于图3中。

(6)利用Qdot(注册商标)655ITK carboxyl quantum dots(QDs)进行的CM标记

按照厂家的作业指令使用QDs(Invitrogen Molecular Probes社制造)进行CM的标记。简而言之，将利用钙化溶液处理后的Ti被测物添加到25μL的8μM QDs、1mg/mL的CM、1mL的10mM硼酸缓冲液(pH 7.4)以及5.7μL的10mg/mL N-乙基-N’-二甲氨基丙基-碳二亚胺(交联试剂；Sigma-Aldrich社制造)的混合物中，在室温下轻柔地搅拌1小时。将无血清添加的DMEM或PBS的QD标记作为对照使用。结果示于图4。

图中，A、B以及C分别示出了试验开始前的Ti植入体的图像。A1示出了试验开始1天后、A7示出了7天后、A14示出了14天后、A28示出了28天后的图像。对于B和C也是同样的。

在经PBS处理的Ti植入体中，在贯穿观察期间，在其周围未检测出荧光。与此相对，在经DMEM或CM处理的Ti植入体中，在其周围有检测出的倾向。

如上可判断出，在经DMEM或CM处理的Ti植入体中，产生了生物体分子的局部化。

(实施例2)永生化乳牙干细胞制作用病毒的制作

(1)质粒提取用试剂

(1-1)试剂等

使用卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、LB液体培养基和LB琼脂培养基、糖原、琼脂糖、灭菌水、乙酸铵、乙酸钠、十二烷基硫酸钠和RNase A。制备50mg/mL的卡那霉素(Kan)和氨苄青霉素(Amp)，以原液的形式保存在-20℃。糖原制备成20mg/mL。制备10mg/mL的RNase A，保存在-20℃。制备10M(饱和)乙酸铵(NH₄OAc)、3M乙酸钠(NaOAc；pH5.2)。

(1-2)限制酶等

大肠杆菌感受态细胞(Supercharge EZ10电感受态细胞、产品编码636756)、SwaI(产品编码1111A、Smi I为等同品)、Xho I(产品编码1094A)、T4 DNA Ligase(产品编码2011A)、NucleoBond Xtra Midi(产品编码740410.10/.50/.100)、NucleoSpinPlasmid(产品编码740588 10/50/250)均购自Takara-Bio(株)。Pac I购自New EnglandBiolabs社。

(1-3)缓冲液等

制备1×TE缓冲液(含有1mM EDTA的10mM Tris-HCl[pH8.0])、经100mMTris-HCl(pH8.0)饱和的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1、下文称为“PCI混液”)。乙醇以100％和70％使用。为了提纯在小规模重组中使用的pAdeno-X质粒DNA，制备以下的缓冲液1～4。

缓冲液1：含有10mM EDTA和50mM葡萄糖的25mM的Tris-HCl(pH8.0)(高压灭菌后在4℃保存)

缓冲液2：含有1％SDS的0.2M NaOH(在即将使用前进行使用时的制备，密封，室温保存)

缓冲液3：5M KOAc(高压灭菌后在4℃保存)

缓冲液4：含有1mM EDTA、20μg/mL RNase的10mM的Tris-HCl(pH8.0)(在即将使用前添加RNase；在-20℃保存)

(2)腺病毒提纯和β-gal分析用试剂

使用经人5型腺病毒转化后的人HEK293细胞(ATCC#CRL1573)。HEK293细胞利用完全培养基培养。完全培养基的组成为添加有100单位/mL的青霉素G钠和100μg/mL的链霉素、4mM的L-谷氨酰胺和10％FBS的DMEM(基本培养基)。青霉素G钠溶液以10,000单位/mL制备、硫酸链霉素溶液以10,000μg/mL制备，以原液的形式保存。

培养中使用60mm微板、100mm微板、6-孔微板、T75和T175烧瓶。

胰蛋白酶-EDTA(产品编码CC-5012)由Takara-Bio(株)购入。制备磷酸缓冲生理盐水(PBS、不含有Ca²⁺和Mg²⁺)和Dulbecco磷酸缓冲生理盐水(DPBS、含有Ca²⁺和Mg²⁺)。另外，使用0.33％的中性红染色液、0.4％锥虫蓝染色液。

在β-gal分析中，将X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖[25mg/mL])二甲基甲酰胺(DMF)溶液在-20℃遮光保存。使用Luminescent β-gal Detection Kit II(产品编码631712)。

(3)预备试验

(3-1)含有lacZ的重组腺病毒(pAdeno-X-lacZ)的构建

将解冻后去除了DMSO的HEK293细胞再悬浮于10mL的上述完全培养基中，将全部量转移至100mm的培养微板中。在HEK293细胞附着后，去除培养液，将细胞利用灭菌PBS清洗1次，加入1mL的胰蛋白酶-EDTA溶液，进行约2分钟处理。

接着，加入10mL的完全培养基停止胰蛋白酶的反应，进行平稳悬浮。进行活菌计数，将10⁵个的细胞转移至加入有培养液10mL的100mm的微板中，进行均匀扩散。

使用pShuttle2-lacZ(包含在Adeno-X Expression System 1中的阳性对照载体)和包含在试剂盒中的Adeno-X病毒DNA(PI-Sce I和I-Ceu I digested)，按照试剂盒所附的实验方案，构建包含lacZ的重组腺病毒。使其感染靶细胞SHED，分析β-半乳糖苷酶的表达，确认载体的构建。

(3-2)重组pShuttle2质粒的构建

在重组pShuttle2载体(下文中称为“rpShuttle2载体”)构建前，利用试剂盒中包含的pShuttle2载体和pShuttle2-lacZ载体对DH5α大肠杆菌进行转化。在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂微板(下文中称为“LB/Kan”)上进行转化体的选择，将从单一菌落获取的菌体在新的LB/Kan上划线，在37℃培养一夜。

接下来，将hTERT、bmi-1、E6、E7按下述顺序克隆到pShuttle2中。利用适于这些基因的限制酶切断pShuttle2载体。

接下来，参照上述试剂盒中所附的pShuttle2载体Information Packet(PT3416-5)，确定与插入的DNA匹配的多克隆位点。将限制酶处理后的上述质粒利用碱性磷酸酶处理，进行提纯。

按照常规方法制备靶DNA碎片、进行提纯。将上述利用限制酶消化的载体与上述基因碎片连接，利用连接产物转化DH5α细胞(感受态细胞)。取上述感受态细胞的一部分，利用试剂盒中包含的对照载体pShuttle2-lacZ载体进行转化，作为阳性对照。

将含有转化后的大肠杆菌的混合液接种于LB/Kan琼脂微板，选择卡那霉素抗性(Kanr)的转化体(菌落)。选择5～10个Kan抗性克隆，接种于少量的液体培养基中进行扩增。在确认这些克隆具有rpShuttle2载体后，进行一夜培养。其后使用市售的二氧化硅吸附柱，按照常规方法对所构建的质粒DNA进行提纯。

将该质粒DNA利用限制酶处理，进行1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的重组质粒。通过测序确认所插入的碎片的方向和插入部位，鉴定阳性克隆。

将重组pShuttle2质粒DNA(下文中称为“rpShuttle2质粒DNA”)直接转染至靶细胞中，进行Western印迹法，对目的蛋白质的表达进行预检测。

(3-3)rpShuttle2质粒DNA的PI-Sce I/I-Ceu I双消化

利用PI-Sce I和I-Ceu I从如上制作的rpShuttle2质粒DNA中切出所导入的基因的表达盒。按照试剂盒中所附的实验方案所记载的体外(in vitro)连接法，将切出的表达盒插入到Adeno-X病毒DNA中。制备rpShuttle2质粒DNA的PI-Sce I/I-Ceu I双消化液30μL，将下述表1中记载的试剂装入到1.5mL的灭菌后微量离心管中，进行混合。

[表3]

试剂等	管1	管2(lacZ对照)
			灭菌水	19.5μl	19.5μl
10×双消化液	3.0μl	3.0μl
			rpShuttle2质粒DNA(500ng/μl)	2.0μl	－
pShuttle2-lac Z质粒(500ng/μl)	－	2.0μl
			PI-Sce I(1单位/μl)	2.0μl	2.0μl
I-Ceu I(5单位/μl)	0.5μl	0.5μl
			10×BSA	3.0μl	3.0μl
合计	30.0	30.0

接下来，在充分混合后装入微量离心管中轻柔地离心，其后在37℃培养3小时，将1kb条带(DNA尺寸标记)与上述双消化后的反应液(5μL)一起利用1％琼脂糖/EtBr凝胶进行电泳。

(3-4)苯酚：氯仿：异戊醇提取

在离心管中，向上述双消化液的残留物(25μL)中添加70μL的1×TE缓冲液(pH8.0)与100μL的PCI混液，利用漩涡混匀器充分搅拌。接下来，使用微量离心机，在4℃以14,000rpm离心5分钟，将水层转移至干净的1.5mL微量离心管中。向其中添加400μL的95％乙醇、25μL的10M乙酸铵以及1μL的糖原(20mg/mL)，利用漩涡混匀器充分搅拌。

接下来，在4℃于14,000rpm离心5分钟，吸引去除上清，得到颗粒。向该颗粒中加入300μL的70％乙醇，在室温下在14,000rpm离心2分钟。小心地吸引去除上清，将颗粒在室温下风干约15分钟。颗粒干燥后，将其溶解在10μL的1×TE灭菌缓冲液(pH8.0)中，使用前保存在-20℃。

(4)重组Adeno-X质粒DNA的构建

(4-1)表达盒在Adeno-X病毒基因组中的亚克隆化

将下述表4所示的试剂依序加入到1.5mL的灭菌后微量离心管中，温和地混合，轻柔离心后，在16℃培养一夜。

[表4]

试剂等	液量(μL)
		PI-Sce I/I-Ceu I消化后的pShuttle2质粒DNA	2.0
PI-Sce I/I-Ceu I消化后的pShuttle2-lac Z质粒DNA	－
		灭菌水	3.0
10×DNA连接缓冲液	1.0
		Adeno-X病毒DNA(250ng/μl)	3.0
DNA连接酶(1单位/μL)	1.0
		合计	10.0

在各样品中加入90μL的1×TE缓冲液(pH8.0)和100μL的PCI混液，利用漩涡混匀器温和地搅拌。在4℃于14,000rpm离心5分钟，将水层转移至干净的1.5mL微量离心管中，向其中加入400μL的95％乙醇、25μL的10M乙酸铵以及1μL的糖原(20mg/mL)，利用漩涡混匀器温和地搅拌。

在4℃于14,000rpm离心5分钟，通过吸引去除上清，得到颗粒。与上述(3-4)同样地进行下述的乙醇沉淀操作。

颗粒干燥后，将其溶解在15μL的灭菌去离子水中。

(4-2)重组Adeno-X质粒DNA的Swa I消化

制备下述表5所示的消化液，加入到装入离心管中的各样品中，在25℃培养2小时。

[表5]

试剂等	液量(μL)
		连接产物	15
10×Swa I消化缓冲液	2.0
		10×BSA	2.0
Swa I(10单位/μL)	1.0
		合计	20.0

在各样品中加入80μL的1×TE缓冲液(pH8.0)和100μL的PCI混液，利用漩涡混匀器温和地搅拌。利用微量离心管在4℃于14,000rpm离心5分钟。与上述(3-4)同样地进行下述乙醇沉淀的操作，颗粒的溶解液在使用前保存于-20℃。

(4-3)利用重组Adeno-X质粒DNA进行的大肠杆菌转化的确认

使用Supercharge EZ10电感受态细胞(产品编码636756)，利用上述(4-2)中得到的Swa I消化产物对电感受态的大肠杆菌进行转化。

将转化混合液接种在向LB培养基中加入有氨苄青霉素(最终浓度100μg/mL)的琼脂微板(下文中称为“LB/Amp琼脂微板”)上，在37℃培养一夜，选择氨苄青霉素抗性(Ampr)转化体。得到约10⁶个菌落。将所得到的菌落利用产品所附的Adeno-X SystemPCR Screening Primer Set进行检测。

在5mL新鲜的LB/Amp液体培养基中接种来自单一菌落的菌体，培养一夜。翌日按照后述的小规模法提纯Adeno-X质粒DNA。

(4-4)重组Adeno-X质粒DNA的小规模制备

将处于对数扩增的培养液5mL于14,000rpm离心30秒，去除上清。将颗粒再次于10,000rpm离心1分钟，使用微量移液管去除上清。

向其中加入150μL的上述缓冲液1，温和地吸液，进行再悬浮。向该细胞悬浮液中添加150μL的缓冲液2，温和地转倒混合，在冰上放置5分钟。向冷却的细胞悬浮液中加入150μL的缓冲液3，再次转倒混合，在冰上放置5分钟。

将该细胞悬浮液在4℃于14,000rpm离心5分钟，将透明的上清转移到干净的1.5mL离心管中。向该上清中添加450μL的PCI混液，转倒混合，进行搅拌。其后在4℃于14,000rpm离心5分钟，将水层转移到干净的1.5mL微量离心管中。

与上述(4-1)同样地进行操作下述乙醇沉淀的操作，颗粒的溶解液在使用前保存于-20℃。靶rDNA利用后述的基于限制酶的分析和PCR进行鉴定。

(5)所得到的rAdeno-X质粒DNA的限制酶部位分析

使用PI-Sce I和I-Ceu I进行分析。将下述表6所示的试剂装入1.5mL的灭菌后微量离心管中，加入30μL的PI-Sce I/I-Ceu I双消化反应液，充分地搅拌，轻柔地旋转，收集内容物。

[表6]

试剂等	液量(μL)
		灭菌水	19.5
10×双消化液	3.0
		rpAdeno-X DNA(500ng/μl)(500ng/μl)	2.0
pShuttle2-lac Z质粒(500ng/μl)	－
		PI-Sce I(1单位/μl)	2.0
I-Ceu I(5单位/μl)	0.5
		10×BSA	3.0
合计	30.0

在37℃培养3小时，进行限制酶处理。将该处理后的反应液利用1％琼脂糖/EtBr凝胶进行电泳，得到培养液。

(6)重组腺病毒的产生

(6-1)HEK293细胞转染用rAdeno-X质粒DNA的制备

将下述表7所示的试剂等装入到1.5mL的灭菌后离心管中，进行混合，利用微量离心机轻柔地离心。其后在37℃培养2小时，对rAdeno-X质粒DNA进行Pac I限制酶处理。

[表7]

试剂等	液量(μL)
		灭菌水	20
pAdeno-X质粒DNA(500ng/μl)	10
		10×Pac I消化缓冲液	4
10×BSA	4
		Pac I(10单位/μL)	2
合计	40

添加60μL的1×TE缓冲液(pH8.0)以及100μL的PCI混液，利用漩涡混匀器温和地搅拌，利用微量离心机在4℃以14,000rpm离心5分钟。将水层小心地转移到干净的1.5mL灭菌后离心管中。

与上述(3-4)同样地进行下述乙醇沉淀的操作，颗粒的溶解液在使用前保存于-20℃。

(6-2)Pac I消化Adeno-X质粒DNA向HEK293细胞中的转染

在上述质粒DNA转染24小时前，按照在每一60mm的培养微板中的细胞数为1～2×10⁶(大致为100cells/mm²)的方式进行HEK293细胞的接种，在37℃、5％CO₂存在下下进行培养。

将Pac I消化后的10μL的Adeno-X质粒DNA转染至各培养微板中，按照标准的转染法(CalPhos Mammalian Transfection Kit产品编码631312)向HEK293细胞中导入Adeno-X DNA。自转染的翌日起确认是否发生了CPE(细胞变性效果)。

1周后，对于附着于培养微板的底面、侧面的细胞进行温和的搅拌，进行剥离。将所得到的细胞悬浮液转移至15mL的灭菌后圆锥离心管中，在室温下于1,500×g离心5分钟。

将所得到的沉淀悬浮在500μL的灭菌PBS中。反复进行3次在干冰/乙醇中冷冻、在37℃的恒温槽融解的冰冻融解操作，得到细胞充分融解的裂解液。接下来，轻柔地离心，去除悬浮物，将上清转移到灭菌后的其它管中，立即进行使用。未立即使用的部分保存于-20℃。

在60mm微板的培养细胞中加入250μL的上述裂解液，继续进行培养。另外使用Adeno-X Rapid Titer Kit(产品编码631028)中包含的抗Hexon抗体，按照该试剂盒的操作说明书(PT3651-1)测定腺病毒的滴度。

(6-3)用于制造高滴度病毒的病毒扩增

在开始进行该滴度测定的约24小时前，将HEK293细胞接种在T75烧瓶中，在37℃、5％CO₂存在下培养一夜，确认到50～70％融合。

翌日，更换为含有病毒的新培养基，利用MOI＝10感染。在37℃、5％CO₂存在下培养90分钟后，取出烧瓶，加入10mL的培养基。

在37℃、5％CO₂存在下培养3～4天，确认CPE。在50％的细胞发生剥离时，与上述同样地制成游离细胞悬浮液，转移到15mL的灭菌后圆锥离心管中。进行与上述同样的冰冻融解操作，使细胞融解。使用Adeno-X Rapid Titer Kit(产品编码631028)，得到10⁷PFU/mL的滴度。

进行Western印迹法，对封装的腺病毒基因组是否以具有功能的形态进行了靶基因特异性的转录单元的复制进行确认。

(7)腺病毒向靶细胞的感染

(7-1)向靶细胞的感染

在感染24小时前，将1×10⁶个SHED接种至6-孔微板。在接种的翌日去除培养基，将含有病毒的1.0mL的培养基添加到各微板的中心。使该溶液在SHED所形成的整个单层均一地扩展。

在37℃、5％CO₂存在下培养4小时，使病毒感染SHED。接下来，添加新鲜的培养基，进一步在37℃、5％CO₂存在下进行培养。在感染24小时后～48小时后对导入基因的表达进行经时性分析。

(7-2)感染细胞的β--半乳糖苷酶表达的分析

使用Luminescent β-gal Detection Kit II(产品编码631712、Clontec社)对于经Adeno-X-lacZ感染的粘附性细胞中的β--半乳糖苷酶的表达进行分析。

(实施例3)永生化乳牙干细胞的制作

(1)脱落乳牙牙髓细胞的制备

使用由10岁健康男孩得到的脱落乳牙。将该脱落乳牙利用聚维酮碘溶液消毒后，使用牙科用金刚钻，将齿冠沿水平方向切断，使用牙医铰刀回收牙髓组织。将所得到的牙髓组织在3mg/mL的I型胶原酶和4mg/mL的分散酶的溶液中于37℃消化1小时。接着，将该溶液使用70mm的细胞过滤网(Falcon社制造)进行过滤。

将滤出的细胞再悬浮于4mL的上述培养基中，接着在直径6cm的贴壁细胞培养用培养皿中。向该培养皿中添加含有10％FCS的DMEM，在调整为5％CO₂、37℃的培养箱中培养2周左右。将形成了菌落的粘附性细胞(牙髓干细胞)利用0.05％胰蛋白酶·EDTA在37℃处理5分钟，回收从培养皿剥离的细胞。

接着，将如上选择出的粘附性细胞接种在贴壁细胞培养用培养皿(胶原蛋白包覆培养皿)中，在调整为5％CO₂、37℃的培养箱中进行一次培养，作为原代培养细胞。在经肉眼观察呈半融合(细胞占据培养容器的约70％表面的状态)或融合时，利用0.05％胰蛋白酶·EDTA在37℃处理5分钟，将细胞从培养容器剥离，进行回收。

将如此得到的细胞再次接种在加入有上述培养基的培养皿中，进行数次传代培养，增殖到约1×10⁷个/mL。将所得到的细胞保存在液氮中。

其后，使用上述培养基，以约1×10⁴细胞/cm²的浓度对一次培养细胞进行传代培养。将1～3次传代的细胞用于实验。人BMMSCs(Bone Marrow Mesenchymal stemcells、骨髓间叶系干细胞)购自Lonza社，按照制造商的操作说明书进行培养。

如上得到人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。对于所得到的SHED，使用FACSTARPLUS(Becton Dickinson社制造)，如下对于各试样进行约1x10⁶个STRO-1阳性细胞的分选。

按照溴脱氧尿苷BrdU染色试剂盒的制造商(Invitrogen社制造)的操作说明书，进行12小时BrdU的插入，对SHED的增殖速度进行评价(各组中n＝3)。实验反复进行5次。在单因素方差分析后进行Tukey-Kramer检验，评价统计的显著差异。

为了利用免疫荧光检测出STRO-1，将SHED利用3％多聚甲醛固定，其后利用PBS漂洗2次，利用100mM的甘氨酸处理20分钟。接下来，将这些细胞利用0.2％的Triton-X(Sigma-Aldrich社)进行30分钟透过处理，其后在5％驴血清和0.5％牛血清白蛋白的混合物中培养20分钟。

接着，将细胞与作为一次抗体的小鼠抗人STRO-1抗体(1：100、R&D社制造)一起培养1小时，与作为二次抗体的山羊抗小鼠免疫球蛋白M-FITC抗体(1：500、Southern Biotech社制造)一起培养30分钟，使用VECTASHIELD DAPI(VectorLaboratories Inc)进行装配。

其后，将添加有15％FBS的α-MEM加入到6孔微板中，接种分选出的细胞用于制作克隆体。将增殖的细胞中的约300个菌落汇合(pool)用于试验。

(2)基因的导入

按上述，将bmi-1、E6、E7和hTERT这4个基因插入到腺病毒载体中，制作表达这些基因产物的病毒载体。作为对照，制作未插入这些基因的对照载体。

将SHED以1×10⁶个接种在的胶原蛋白包覆培养皿中，加入添加有10％FBS的DMEM，培养至半融合。吸引去除该培养基，加入利用上述培养基稀释的病毒溶液500μL(MOI＝10)，在37℃于5％CO₂培养箱中培养1小时，使上述病毒载体感染。感染48小时后，将感染细胞在加入有嘌呤霉素(1pg/mL)的上述培养基中培养10天进行选择，汇合500～600个抗性克隆。每3～4天将约0.5x10⁵个SHED接种到的培养培养皿中，进行传代。将导入有基因的SHED作为SHED-T、未导入有基因的SHED作为SHED-C。

(3)SHED-C和SHED-T的成长速度的测定

图5中示出了SHED-T(进行了基因导入的SHED)的个体数的倍增状态。图中，纵轴为个体倍增次数(细胞分裂次数)、横轴为时间(培养天数)。此外，将培养中的SHED在1个月中未发生分裂的状态作为细胞老化的判断基准。

SHED-C在30次时停止增殖，进入老化或增殖停止阶段。与此相对，对于SHED-T，超过250PD，在经过800天后仍在增殖。

(3-1)流式细胞分析

为了得到单一细胞的悬浮液，将粘附性的单层细胞利用胰蛋白酶/EDTA进行消化。在2×10⁵个细胞中加入抗STRO-1单克隆抗体(1：100)，进行放置，使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson社)进行分析。与相应的同种型相同的对照抗体相比，在荧光水平为99％以上比例的高水平的情况下，表达为阳性。在SHED-T和SHED-C中，均将初期和后期的传代细胞固定，利用FITC结合STRO-1抗体进行染色。其后利用流式细胞术进行分析。试验分别进行二次。在SHED-C中，STRO-1阳性细胞的比例在PD20时为27％，在PD30时减少至15％(图6(A)和(B))。在SHED-T中，STRO-1阳性细胞的比例在PD20时为46％、在PD40时为41％(图6(C)和(D))。

(3-2)分化能力的研究

利用新生骨量的形成能力和组织染色对于PD0、PD10和PD20中的SHED-C和SHED-T的分化能力进行研究。

首先，将2.0×10⁶个SHED-C或SHED-T与40mg的羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)陶瓷粉末(奥林巴斯工业株式会社制造)混合，移植到10周龄的免疫缺陷状态小鼠(NIH-bgnu-xid,雌、Harlan Sprague Dawley社制造)的背侧表面的皮下。

移植8周后回收移植物，利用4％福尔马林固定、脱灰后，为了进行石蜡包埋，利用含有10％EDTA的PBS溶液进行缓冲。为了进行塑料包埋，将一部分保存在70％乙醇溶液中。

将石蜡切片脱石蜡化，对其进行水合后，利用苏木素和曙红(下文中称为“H&E”)进行染色。图7(A)～(C)中示出了SHED-T(永生化干细胞)的PD0～PD20，图7(D)～(F)中示出了SHED-C(正常细胞)的PD0～PD-20。为了对生物体内的新骨形成进行定量，选择特定的区域，对于SHED-T移植后形成的移植物或SHED-C移植后形成的移植物，分别计算出新生骨面积和视野面积，由这些数值求出新生骨量。

新生骨量＝新生骨面积/视野面积×100

图8中示出了在各个体数倍增次数(倍增时间)时SHED-T与SHED-C的新生骨量的变化。图中，**表示p<0.05、***表示p<0.01。需要说明的是，新生骨量由下述计算式求出。

如图8所示，在SHED-C中，随着个体数倍增次数增加，新生骨量减少，以PD20计时，降低至PD0的约1/5。与此相对，在SHED-T中，直至PD20为止，新生骨量几乎无变化；在PD20时，显示SHED-T形成了SHED-C的5倍以上的骨。

(3-3)致癌活性的评价

将1×10⁶个SHED-C和SHED-T细胞移植到免疫缺陷状态小鼠的皮下组织中。移植后进行30日以上观察，但在此期间，在移植了上述细胞的任一小鼠中均未形成肿瘤。并且，在SHED-T细胞中，40～200PD的培养细胞的全部克隆无形态变化。

如上所述显示出SHED-T无致癌活性。

(4)评价

在SEHD-T中，即使在超过260PD时，也显示出了具有在保持分化能力的同时进行增殖的能力；在SHED-C中，虽然具有分化能力，但在30PD以下发生老化。

上述显示出SHED-T为永生化细胞，适于大量生产高活性的SHED培养上清。

(5)CM固定Ti植入体螺丝的制备

与上述实施例1同样地进行CM固定Ti植入体螺丝的制造、细胞粘附分析、利用扫描型电子显微镜(SEM)进行的Ti植入体表面变化的观察、利用LC/MS/MS进行的Ti植入体表面上的蛋白的鉴定和体外SHED的RNA分析。

(实施例4)

(1)植入体和外科步骤

将Ti植入体(钛植体固位钉)按照已有的记载(文献编号40)插入到大腿骨中。将大鼠通过二乙醚蒸气(3mL/chamber)的吸入和戊巴比妥(20mg/kg)的腹腔内给药的组合进行麻醉。穿过末梢大腿骨形成10mm的切开口，使该骨露出。

使用牙科用圆棒(dental round bar、直径1.5mm)，在1500rpm以下的旋转速度下，在大腿骨的末梢起7mm处形成单皮质植入基底(unicortical implant floor)。将经CM、DMEM或PBS处理的植入体插入并埋入到皮质骨中。其后使软组织回复到它们的正常位置，利用3-0Vicryl(注册商标)SH-1(Ethicon社制造)进行缝合。

(2)In vivo成像分析

对具有固定化的QD-修饰CM的Ti植入体进行监测，使用成像系统(IVIS spectrum,Xenogen社制造)进行可视化。分别在移植后第1天、第7天、第14天以及第28天处死大鼠，取出具有埋入的Ti植入体的大腿骨。通过成像对于与所取出的大鼠大腿骨中的Ti植入体结合(associated with)的QD-标签进行检测。

各大鼠和所取出的大腿骨在下述条件下进行成像：

检体的高度：1.50cm

视野：13×13cm

暴露时间：1秒

f-stop：1

binding：8

激发滤光片：605nm

发射滤光片：655nm或检体的高度：0.01cm

视野：6.5×6.5cm,

暴露时间：2秒

f-stop：1

binding：8

激发滤光片：605nm

发射滤光片：655nm

(3)去除扭矩(Ncm)测定

在植入设置后1天、7天、14天和28天的时刻，对于每一实验组在深度麻醉下测定大腿骨植入的去除扭矩(Ncm)(各时刻的N＝5)。去除扭矩使用扭矩仪ATG 3CN(注册商标、测定范围：0.1-3Ncm；Tohnichi,Tokyo,Japan)和BTG 15CN-S(注册商标、测定范围：2-15Ncm；(株)东日制作所制造)进行测定。使用Scheffe检验，在显著差异水平5％，通过单因素方差分析对数据进行分析。

结果示于图9。在阴性对照组(PBS处理组)和阳性对照组(DMEM处理组)之间，在1天后以及7天后发现有显著差异，但在14天后未发现有显著差异。在试验组(CM处理组)中，在全部的测定时刻均显示出了高于对照组的值，直到14天后仍发现有显著差异(*表示p<0.05)。

(4)组织学的处理和骨移植接触(bone-implant contact(BIC))率(％)的测定

在去除扭矩测定后，在深度麻醉下处死大鼠(各组均为N＝5)，取出大腿骨植入体。将所得到的试样埋入到Technovit 7100(应研商事(株))中。将各块状物沿着植入的长轴方向移动，制作50μm厚的切片，使用甲苯胺蓝按照通常的方法进行染色。

在监视器上显示切片的显微镜图像并进行计算机输入，使用图像分析用软件(VMS-50VideoPro、Innotech株式会社制造)进行分析。骨接触率按照下式求出：

骨接触率(％)＝直接移植-骨接触/植入体周围长度。

使用Scheffe检验，在显著差异水平5％，通过单因素方差分析对数据进行分析。结果示于图10。

图10(A)示出了海绵骨的情况下的结果、并且图10(B)示出了皮质骨的情况下的结果。关于骨移植接触率，在海绵骨中，在移植7天后和14天后在阴性对照组与其它2组之间发现有显著差异。另一方面，在皮质骨中，自移植1天后起在试验组与阴性对照组之间发现有显著差异(ANOVA检验、*：p<0.05、**：p<0.01)。

由于试验组中BIC的值高，因而显示出促进了与骨的一体化。

(实施例5)人用高功能植入体的制作

(1)材料与方法

植入体使用Astra社制造的钛植入体(长度13mm、直径3.75mm，或者长度11mm、直径3.75mm)。

(2)含有生长因子的培养上清的制备

使用实施例1中得到的干细胞的培养上清制备含有生长因子的溶液，如下进行处理。

将该培养上清置入培养烧瓶中，向其中加入钛植入体材料，将盖子盖紧，进行充分振荡。利用超声破碎仪进行1分钟超声处理。接下来静置5分钟，再次在相同条件下进行1分钟超声处理。静置5分钟后，利用纯水清洗2次。按上述方式得到利用上述培养上清中所含有的生长因子进行了涂覆的钛植入体。仅使用DMEM来替换培养上清进行同样的处理，制备无处理的钛植入体材料。

(实施例6)高功能植入体的移植例

(1)患者等

将实施例5中制作的植入体移植到8名41岁～68岁男性的上颌无牙颌中。这些患者未患有糖尿病、高血压等对骨代谢有影响的基础疾病。并且饮酒量也不多，也没有吸烟习惯。

在某一患者中，在上颌臼齿部，将与上颌洞底的距离残留15mm以上的部位作为埋入部位。将8根经生长因子处理后的植入体(处理组)埋入到患者的一侧上颌臼齿部，将8根未经生长因子处理的植入体(无处理组)埋入到同一患者的相反侧上颌臼齿部。

(2)评价方法

在刚埋入上述16根植入体之后(埋入时)、6个月后以及12个月后的时刻，使用Ostell分析仪(Ostell Mentor,Ostell AB,Grothenburug,Sweden)通过ISQ(种植稳定系数，Implant Stability Quotient)的变动进行评价。

ISQ值根据植入体周围的骨的高度或骨质、骨与植入体的结合力的变化而变化，由1到100之间的数值表示。已知在成功植入时ISQ通常多为65±5的情况。计测结果示于图11，并且评价列于下表8。如图11所示，设置时的ISQ在对照组和SHED-CM处理组中均在该范围内。ISQ值在任一组中均经时性上升，但在经过了6个月的时刻，SHED-CM处理组显著增高(p<0.05)。该倾向在经过了12个月时也是同样的。

[表8]

*：无处理植入体 AstraTech植入体

如上述表8所示，在利用表面涂覆有永生化乳牙干细胞源性生长因子的钛植入体时，不论固位钉的长度如何，均显示出了可促进与骨的一体化。

(实施例7)培养上清中以及附着于高功能植入体表面的蛋白质的分析

(1)材料和方法

使用实施例1中得到的干细胞的培养上清中的蛋白质，利用LC/MS/MS(MS4HPLC系统(Michrom BioResources社制造)与LCQ高级质谱系统(Thermo Scientific社制造)进行鉴定。

测定条件如下所述。

LC：MS4 HPLC系统(Michrom BioResources社制造)

柱：Magic C18AQ(Michrom BioResources社制造,0.1mm(i.d.)×50cm)

洗脱液：溶液A(2％乙腈-98％水(含有0.1％甲酸))、溶液B(90％乙腈-10％水(含有0.1％甲酸)进行梯度洗脱(0分钟,95％A：5％B→45分钟,0％A：100％B)。

流速：1μL/分钟

MS1：LCQ高级质谱系统(Thermo Scientific社制造)

MS2：LCQ高级质谱系统(Thermo Scientific社制造)

将附着于植入体上的蛋白质按照10％EDTA、4M胍、80％乙腈的顺序利用液相色谱进行阶梯式萃取，按照各缓冲液的流量为2mL/分钟的方式进行采集，制备成蛋白量为2μg/mL。蛋白量利用缩二脲法测定。

培养上清使用100％乙醇、90％乙醇进行乙醇沉淀，之后进行冷冻干燥，制备成蛋白量为2μg/mL。蛋白量利用Bradford法进行测定。

分析结果列于表9。

[表9]

如表9所示，在实施例1中得到的干细胞的培养上清中，已知含有大量与细胞结构的形成相关的蛋白质。并且认为，根据对如上述那样得到的间叶系干细胞进行培养后的粘附细胞的比例的多少，胶原蛋白α-1(I)链、胶原蛋白α-2(I)链、纤连蛋白以及核心蛋白聚糖也会在植入体与牙槽骨的粘附中发挥出重要的作用。

(实施例8)培养上清对于细胞的粘附性的影响和冷冻保存的影响

(1)材料

将实施例1中得到的干细胞的培养上清作为试样，使用PBS作为阴性对照。

(2)对于细胞的粘附性的影响

将犬骨髓间质细胞(由年龄18-25个月、体重15-25kg的比格犬的髂骨采集10mL骨髓液，使用含有10％FBS和50～150U/mL青霉素、50～150μg/mL链霉素的DMEM培养基，在5％CO₂培养箱中在37℃进行3代预培养后得到的细胞)以1.5～3×10⁵个/孔播种(n＝3)于直径15mm纯钛板上，研究培养上清的有无对于细胞的粘附性的影响以及等离子体处理的影响。

培养中使用含有10％FBS和青霉素(50～150U/mL)、链霉素(50～150μg/mL)的DMEM，在37℃进行培养。在培养前，对于直径15mm的纯钛板，将大气压等离子体(MPS-01K01C,栗田制作所社制造)按照距离等离子体火焰前端为10mm的距离照射30秒，将钛板在37℃的条件下在培养上清或PBS中浸渍24小时。在培养开始后1小时以及24小时的时刻，利用胰蛋白酶-EDTA剥离粘附细胞，在血细胞计数器上对悬浮细胞进行统计，来计数并求出粘附细胞数。结果示于图12。图12中，N-PBS表示未进行等离子体处理而在PBS中的培养、P-PBS表示进行等离子体处理而在PBS中的培养、N-CM表示未进行等离子体处理而在培养上清中的培养、P-CM表示进行等离子体处理而在培养上清中的培养。

在N-PBS中，即使在24小时后也未见到粘附细胞数的大量增加；在P-PBS中有很大增加。另外，在N-CM和P-CM的两组中，24小时后的粘附细胞数增加。

在N-PBS组和P-CM组中，24小时后的粘附细胞数观察到了显著差异(p<0.01)。另外，在P-PBS组与P-CM组之间也观察到了显著差异(p<0.05)。

另外，关于24小时后的细胞的附着状态，使用DAPI和鬼笔环肽进行荧光染色，在250倍下利用荧光显微镜(激发波长：358nm(DAPI),560nm(鬼笔环肽)、测定波长：465nm(DAPI),575nm(鬼笔环肽)、A1+(Nikon社制造)进行观察。

结果示于图13。如图13所示，细胞的增殖状况在N-CM组和P-CM组中明显增多。

(3)冷冻保存的情况下对于细胞增殖的影响

将上述培养上清按照每管1mL分注到塑料制造的螺口管(容量2mL、Corning社制造)中，分别在4℃、-15℃以及-80℃保存1周、2周和1个月。

利用溴尿苷分析对该影响进行确认。作为分析试剂盒，使用BrdU标记&检测试剂盒II(Roche Applied Science社制造)，按照所附的使用说明书进行分析。

将与实施例1同样地得到的间叶系干细胞按照1×10⁶个/孔接种于96孔微板。按100μL/孔添加如上保存的培养上清，在5％CO₂培养箱中于37℃培养24小时，观察该干细胞的增殖，求出扩增率。结果示于图14。

在-80℃保存的情况下，与保存1周的情况相比，保存1个月的情况的活性有降低倾向，但未发现有显著差异。另一方面，在-80℃保存2周的情况与在-15℃保存1个月的情况之间发现有显著差异(p<0.05)。另外，在-80℃保存2周的情况与在4℃保存1个月的情况之间发现有显著差异(p<0.05)。在-80℃保存1周的情况与在4℃保存2周的情况之间也发现有显著差异(p<0.05)。

根据上述情况，可认为在-80℃进行冷冻保存的情况下，培养上清的保存期间为1个月，在-15℃的情况下为1个月、在4℃的情况下为2周。

根据上述情况显示出，通过利用培养上清对植入体进行处理，可促进上述生成再生因子的干细胞的增殖，使植入体与埋入该植入体的骨的粘附变得牢固。

工业实用性

本发明在牙科和医科领域中是有用的。

序列编号1：ALP用正向引物

序列编号2：ALP用反向引物

序列编号3：OCN用正向引物

序列编号4：OCN用反向引物

序列编号5：OPN用正向引物

序列编号6：OPN用反向引物

序列编号7：BSP用正向引物

序列编号8：BSP用反向引物

序列编号9：Collagen 1用正向引物

序列编号10：Collagen 1用反向引物

序列编号11：GAPDH用正向引物

序列编号12：GAPDH用反向引物

序列编号13：胶原蛋白α-1(I)链前体

序列编号14：胶原蛋白α-1(II)链前体

序列编号15：胶原蛋白α-1(XXVII)链前体

序列编号16：胶原蛋白α-2(I)链前体

序列编号17：纤连蛋白

序列编号18：纤连蛋白

序列编号19：核心蛋白聚糖

序列编号20：核心蛋白聚糖

序列编号21：骨钙蛋白

序列编号22：骨桥蛋白

序列编号23：骨唾液酸蛋白2

序列编号24：血管上皮生长因子A

Claims

1.一种细胞生成物的制备方法，其具备下述工序：

预备培养工序，在含有5～15％血清、50～150U/mL青霉素和50～150μg/mL链霉素的培养液中加入5×10³～5×10⁴个/mL骨髓间质细胞或永生化乳牙干细胞，在5％CO₂存在下于34～37.5℃进行预备培养；

细胞分选工序，分选出具有特定形状和粘附性的所述细胞；以及

培养上清收集工序，对于通过所述分选工序分选出的细胞在与预备培养相同的条件下进行培养，对培养开始后40～56小时的培养上清进行收集。

2.如权利要求1所述的细胞生成物的制备方法，其特征在于，所述骨髓间质细胞来源于选自由大鼠的大腿骨、猪牙髓以及人乳牙组成的组中的任意细胞。

3.如权利要求2所述的细胞生成物的制备方法，其特征在于，将所述细胞在37℃进行培养。

4.如权利要求3所述的细胞生成物的制备方法，其特征在于，所述特定形状为梭状且为纺锤型。

5.如权利要求1所述的细胞生成物的制备方法，其特征在于，对培养开始后44～52小时的所述培养上清进行收集。

6.如权利要求5所述的细胞生成物的制备方法，其特征在于，对培养开始后48小时的所述培养上清进行收集。

7.如权利要求1所述的细胞生成物的制备方法，其特征在于，所述培养液为选自由Dulbecco培养基、Iscove改良Dulbecco培养基、Ham’s F12培养基和RPMI 1640培养基组成的组中的至少一种以上的培养基。

8.如权利要求7所述的细胞生成物的制备方法，其特征在于，所述血清为选自由胎牛血清、牛血清、马血清、人血清以及绵羊血清组成的组中的至少一种以上的血清。

9.如权利要求1所述的细胞生成物的制备方法，其特征在于，所述培养液含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

10.如权利要求1～9的任一项所述的细胞生成物的制备方法，其进一步具备下述工序：

沉淀物制备工序，进行离心和乙醇沉淀处理来制备沉淀物；以及

冷冻干燥工序，对通过所述沉淀物制备工序得到的沉淀物进行冷冻干燥。

11.一种细胞生成物，其通过权利要求1～10的任一项所述的方法来制备。

12.如权利要求11所述的细胞生成物，其特征在于，在所述培养上清中至少含有I型胶原蛋白(Col-I)、纤连蛋白、核心蛋白聚糖和血管内皮生长因子(VEGF)。

13.如权利要求12所述的细胞生成物，其特征在于，在所述培养上清中进一步含有胰岛素样生长因子结合蛋白7、卵泡抑素相关蛋白、金属蛋白酶抑制剂I、组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂、肌动蛋白以及巯基氧化酶I。

14.如权利要求13所述的细胞生成物，其特征在于，在所述培养上清中进一步含有SPARC、胶原蛋白α2(IV)链、β-2-微球蛋白、Rho GTP酶激活蛋白18。

15.一种高功能植入体的制作方法，其特征在于，其具备下述工序：

清洗工序，利用有机溶剂清洗植入体材料的表面，制成清洗植入体材料；

浸渍工序，将所述清洗植入体材料在具有特定组成的第1钙化溶液中在特定温度下浸渍3～6小时，制成浸渍植入体材料；以及

处理工序，将所述浸渍植入体材料利用含有特定浓度的权利要求12～14的任一项所述的细胞生成物的第2钙化溶液进行2～5天培养处理。

16.如权利要求16所述的高功能植入体的制作方法，其特征在于，所述植入体材料由选自由钛、氧化锆、羟基磷灰石以及β-TCP组成的组中的任意材料形成。

17.如权利要求16所述的高功能植入体的制作方法，其特征在于，所述有机溶剂为丙酮与60～80％乙醇。

18.如权利要求16所述的高功能植入体的制作方法，其特征在于，所述第1钙化溶液为100～150mM NaCl、2.5～3.5mM CaCl₂·H₂O、1.5～2.5mM K₂HPO₄、25～75mM Tris-HCl(pH 7.2～7.6)，第2钙化溶液为130～160mM KNO₃、1～2mMCa(NO₃)₂·4H₂O、0.5～1.5mM K₂HPO₄(pH 7.0～7.8)。

19.如权利要求18所述的高功能植入体的制作方法，其特征在于，所述第1钙化溶液为136.8mM NaCl、3.10mM CaCl₂·H₂O、1.86mM K₂HPO₄、50mM Tris-HCl(pH7.4)，第2钙化溶液为142.8mM KNO₃、1.5mM Ca(NO₃)₂·4H₂O、0.9mM K₂HPO₄(pH7.4)。

20.如权利要求16所述的高功能植入体的制作方法，其特征在于，所述特定温度为36～38℃，浸渍时间为4小时。

21.如权利要求15所述的高功能植入体的制作方法，其特征在于，所述特定浓度的细胞生成物为5～20mg/mL的浓度。

22.一种高功能植入体，其通过权利要求15～21的任一项所述的方法来制作。

23.如权利要求22所述的高功能植入体，其特征在于，其在表面至少保有I型胶原蛋白(Col-I)、纤连蛋白以及核心蛋白聚糖。

24.如权利要求23所述的高功能植入体，其特征在于，其在表面进一步具有选自由胰岛素样生长因子结合蛋白7、卵泡抑素相关蛋白、金属蛋白酶抑制剂I、组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂、肌动蛋白以及巯基氧化酶I组成的组中的至少1种以上的蛋白质。

25.如权利要求22所述的高功能植入体，其特征在于，所述高功能植入体由选自由钛、氧化锆、羟基磷灰石以及β-TCP组成的组中的任意材料形成。