WO2014104246A1 - 高機能インプラント材料 - Google Patents

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上田　実
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株式会社クオリーメン
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Definitions

  • the present invention relates to a highly functional implant material using a product of bone marrow stromal cells (BMCs) or immortalized deciduous stem cells. More specifically, the present invention relates to a highly functional implant material having a surface coated with a product of the BMCs bone marrow stromal cells or immortalized deciduous teeth stem cells.
  • BMCs bone marrow stromal cells
  • One purpose of dental treatment is to restore the function and shape of the missing tooth using artificial materials. For this reason, implants are used as the most common treatment to make up for missing teeth and the like. Originally, since it is necessary to stabilize the implant in order to exert a sufficient function on the missing tooth or the like, it is desirable that the implant be integrated with the alveolar bone. For this reason, bioglass, calcium phosphate ceramics (ie, hydroxyapatite and ⁇ -tricalcium phosphate) and other bioactive materials and metal materials have been used as such implant materials.
  • the above-mentioned bioactive materials are excellent in that they are highly biocompatible.
  • the metal material is superior from the viewpoint of mechanical properties such as strength and durability.
  • titanium hereinafter sometimes referred to as “Ti”) is widely used as an implant material in terms of biocompatibility and cost.
  • the prior art described above is superior in that integration into bone is progressing compared to the case where the surface of the metal implant material is not treated.
  • the treatment of the surface of the metal implant material is performed by a procedure of first performing a pretreatment for activating the surface of the metal implant and then treating with a bone formation reagent or applying a growth factor, so that the operation is complicated. there were.
  • a growth factor is applied to the surface of the metal implant material, the period during which the growth factor fixed on the surface is retained becomes a problem. This is because sufficient integration cannot be expected if the period of time held on the surface of the metal implant material is shorter than the time required for integration of the bone and the metal implant material.
  • 5 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 4 is contained in a culture solution containing 5 to 15% serum, 50 to 150 U / mL penicillin and 50 to 150 ⁇ g / mL streptomycin.
  • Cells having a predetermined shape and adhesion; a preculture step in which bone marrow stromal cells or immortalized deciduous dental stem cells are added and precultured in the presence of 34% to 37.5 ° C and 5% CO 2 ;
  • a method for preparing a product is described in a culture solution containing 5 to 15% serum, 50 to 150 U / mL penicillin and 50 to 150 ⁇ g / mL streptomycin.
  • the bone marrow stromal cells are preferably obtained from rat femur, and the immortalized dental pulp stem cells are derived from any cell selected from the group consisting of porcine pulp and human deciduous teeth. Is preferred.
  • the cells are preferably cultured at 37 ° C.
  • the predetermined shape in the cell sorting step is preferably a spindle shape and a spindle shape.
  • the culture supernatant is preferably collected 44 to 52 hours after the start of culture, and more preferably 48 hours after the start of culture.
  • the culture solution is preferably at least one medium selected from the group consisting of Dulbecco medium, Iskov modified Dulbecco medium, Ham F12 medium, and RPMI1640 medium.
  • the serum is preferably at least one serum selected from the group consisting of fetal bovine serum, bovine serum, horse serum, human serum, and sheep serum.
  • the culture solution preferably contains 10% fetal bovine serum, 100 U / mL penicillin, and 100 ⁇ g / mL streptomycin.
  • the preparation method may further include a precipitate adjustment step of preparing a precipitate by performing centrifugation and ethanol precipitation, and a freeze-drying step of freeze-drying the precipitate obtained in the precipitate preparation step. preferable.
  • the second aspect of the present invention is a cell product prepared by the preparation method described above.
  • the cell product preferably contains at least type I collagen (Col-I), fibronectin, decorin, and vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • insulin-like growth factor binding protein 7 follistatin Additional proteins, metalloproteinase inhibitor I, tissue plasminogen activator inhibitor, actin, and sulfhydryl oxidase I, SPARC, collagen ⁇ 2 (IV) chain, ⁇ -2-microglobulin, Rho GTPase activating protein 18 Is even more preferable.
  • the present invention also provides a cleaning step in which the surface of the implant material is cleaned with an organic solvent to form a cleaning implant material; and the cleaning implant material is placed in a first calcification solution having a predetermined composition at a predetermined temperature for 3 to 6 A dipping step of dipping for a time to obtain a dipped implant material; and a treatment step of incubating the dipped implant material with a second calcification solution containing a cell product at a predetermined concentration for 2 to 5 days.
  • This is a method for creating a highly functional implant.
  • the implant material is preferably made of any material selected from the group consisting of titanium, zirconia, hydroxyapatite, and ⁇ -TCP.
  • the organic solvent is preferably acetone and 60-80% ethanol.
  • the first calcification solution is 100 to 150 mM NaCl, 2.5 to 3.5 mM CaCl 2 ⁇ H 2 O, 1.5 to 2.5 mM K 2 HPO 4 , 25 to 75 mM Tris-HCl (pH 7.2 to 7.6). 136.8 mM NaCl, 3.10 mM CaCl 2 .H 2 O, 1.86 mM K 2 HPO 4 , 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) is more preferred.
  • the predetermined temperature is 36 to 38 ° C. and the immersion time is 4 hours.
  • the predetermined cell product is preferably an aqueous solution of 5 to 20 mg / mL of the above cell product, and more preferably about 10 mg / mL.
  • the third aspect of the present invention is a highly functional implant produced by any of the methods described above.
  • the implant material is preferably formed of any material selected from the group consisting of titanium, zirconia, hydroxyapatite, and ⁇ -TCP.
  • the implant preferably retains at least type I collagen (Col-I), fibronectin, and decorin on the surface, and includes insulin-like growth factor binding protein 7 (IGF-binding protein 7), follistatin-related protein, More preferably, the surface further has at least one protein selected from the group consisting of metalloproteinase inhibitor I, tissue plasminogen activator inhibitor, actin, and sulfhydryl oxidase I.
  • a cellular product containing can be prepared.
  • a highly functional implant can be produced simply using this cell product.
  • a highly functional implant material that can be integrated with bone in a short period of time can be obtained.
  • FIG. 1 is an electron micrograph of the surface of a Ti implant taken using a scanning electron microscope (SEM).
  • SEM scanning electron microscope
  • FIG. 1 (A) and (D) are surfaces treated with PBS (phosphate buffered saline), and (B) and (E) are treated with DMEM (Dulbecco's ⁇ -MEM).
  • Surfaces (C) and (F) show the surfaces treated with CM (culture supernatant of cell culture).
  • FIG. 2 shows the number of cells that were seeded with 1.0 ⁇ 10 6 cells on the surface of a Ti implant (hereinafter sometimes referred to as “Ti plate”) treated as described above and adhered after 24 hours. It is a figure (ANOVA test. In the figure, * indicates p ⁇ 0.05).
  • FIG. 3 shows gel electrophoresis images (A) to (C) of rat BMSCs cultured on a Ti plate surface having immobilized DMEM or CM, and graphs quantifying the gels (D) to (F). It is.
  • FIG. 4 is a detection image of QD-labeled biomolecules on Ti implants in vivo.
  • PBS, DMEM and CM are as described above.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between the immortalized stem cells selected from the above-described dental pulp cells, the number of individual doublings of cells that are not immortalized stem cells, and the culture period.
  • SHED-T represents an immortalized stem cell
  • SHED-C represents a cell that is not an immortalized stem cell.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of STRO-1 expression in SHED-C and SHED-T (FIGS. 2 (A) to (D)).
  • FIG. 7 is a diagram showing tissue staining images of SHED-C and SHED-T at the individual doubling time shown in FIG.
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between the individual doubling time (number of times) and the amount of new bone, in which ** represents p ⁇ 0.05 and *** represents p ⁇ 0.01.
  • the amount of new bone was determined by the following calculation formula.
  • New bone mass New bone area / field of view x 100
  • P represents a case where plasma treatment is performed under atmospheric pressure
  • N represents a case where plasma treatment is not performed.
  • * indicates p ⁇ 0.05
  • ** indicates p ⁇ 0.01.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • the preparation method of the present invention comprises (a) 5 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 4 cells in a culture solution containing 5 to 15% serum, 50 to 150 U / mL penicillin and 50 to 150 ⁇ g / mL streptomycin.
  • the culture solution is Dulbecco's medium (hereinafter sometimes referred to as “DMEM”), Iskov modified Dulbecco's medium (hereinafter sometimes referred to as “IMDM”), Ham F12 medium (hereinafter referred to as “Ham12”) And at least one medium selected from the group consisting of RPMI1640 medium is preferable because it is easy to obtain and handle.
  • the above medium is a medium called a basic medium and can be purchased from GIBCO, SIGMA, or the like. Of these media, two or more types can be used in combination as a mixed medium.
  • the mixed medium a medium in which IMDM and HamF12 are mixed in equal amounts (for example, commercially available as trade name: IMDM / HamF12 (GIBCO)) can be mentioned.
  • the serum is at least one serum selected from the group consisting of fetal bovine serum, bovine serum, horse serum, human serum, and sheep serum. This is preferable because no protein is produced in the culture supernatant.
  • serum substitutes Knockout serum replacement (KSR), etc.
  • bovine serum albumin BSA
  • penicillin streptomycin
  • gentamicin gentamicin
  • vitamin K folic acid
  • the present invention also includes (d) a precipitate preparation step for preparing a precipitate by performing centrifugation and ethanol precipitation; (e) a freeze-drying step for freeze-drying the precipitate obtained in the precipitate preparation step; Can be further provided.
  • the bone marrow stromal cells are derived from any cell selected from the group consisting of rat femur, porcine lower jaw and teeth, and human deciduous teeth. It is preferable because cells that can be produced are surely available.
  • the cell growth factor is a general term for polypeptide factors involved in proliferation, differentiation and the like of specific cells, and also includes lymphokines and cytokines that regulate the immune system. Sometimes called growth factor or cell growth factor.
  • growth factor is sometimes simply referred to as “growth factor”.
  • Growth factors are known to be involved in the regulation of various cytological and physiological processes in vivo, and receptor proteins (hereinafter simply referred to as “receptors” or “receptors”) on the surface of target cells. It is specifically bound to ”) and performs signal transduction.
  • Typical growth factors include epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), transforming growth factor (TGF), nerve growth factor (Nerve) growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), vascular endothelial growth factor (VEGF), granulocyte-colony factor (G-CSF) ), Granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF), platelet-derived growth factor (PDGF), erythropoietin (EPO), thrombopoietin (TPO), base Fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor: bFGF or FGF2), hepatocyte growth factor (Hepatocyte growth fact) or: HGF).
  • EGF epidermal growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • TGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • G-CSF Granul
  • TGF- ⁇ is one of the growth factors existing in nature. Like many other signal pathways, it plays a vital role in device development, cell differentiation, and embryo development. ⁇ -type mutant growth factor TGF- ⁇ is produced in almost all cells such as kidney, bone marrow, and platelets, and there are five subtypes ( ⁇ 1 to ⁇ 5). TGF- ⁇ 1 to ⁇ 3 are accumulated in an inactive form in the bone matrix, and are activated by acids released by osteoclasts during bone resorption. TGF- ⁇ promotes the proliferation of osteoblasts and the synthesis and proliferation of mesenchymal cells such as collagen, but acts on epithelial cells and osteoclasts in a suppressive manner.
  • the tyrosine residue in the protein is phosphorylated by binding of the growth factor, and cell proliferation / differentiation is induced.
  • growth factors are mesoderm inducers during ontogeny.
  • the above growth factors fall into several families that are related in terms of their structure and evolution. Examples of these families include TGF- ⁇ , bone morphogenic protein (BMP), neurotrophin (neurotrophic factor), fibroblast growth factor (FGF) and the like.
  • the neurotrophic factors include NGF, BDNF, NT3 and the like. Growth factors are now actively used in medicine.
  • TGF- ⁇ is a member of the TGF- ⁇ superfamily, and this superfamily includes bone morphogenetic protein (BMP), which plays an important role in bone formation in organisms. Is included.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the culture supernatant of the present invention includes collagen ⁇ -1 (I) chain, collagen ⁇ -2 (I) chain, vimentin, collagen ⁇ -1 (IV) chain, IGF binding protein 7 (IGFBP7), fibronectin, decorin, Plasminogen activator inhibitor 1, actin (cytoplasmic 2), sulfhydryl oxidase 1, SPARC, metalloproteinase inhibitor 1, collagen ⁇ -2 (IV) chain, SCP2, 72kDa type IV collagenase, ⁇ -2-microglobulin, Rho It is preferable that various proteins such as GTPase activating protein 18 are included.
  • collagen is a molecule having a triple helix structure composed of three ⁇ chains, and it is known that there are many types such as type I, type II, type III, type IV, and type V. Each type of molecule consists of the same or different types of polypeptide chains. It is known that there are 30 or more types of polypeptide chains ( ⁇ chains), and they are called ⁇ 1 (I), ⁇ 2 (IV) and the like.
  • the collagen protein family is classified as follows. 1) Specific group of molecules that form fibers with a periodic striated structure of 67 nm (type I, type III, type V (mainly tissues other than cartilage)), type II, type XI (cartilage tissue)
  • Molecule groups (XII type, XIV type (non-cartilage tissue), IX type (cartilage tissue)) bound to the surface of these fibers 3) A group of molecules that form a network-like aggregate (type IV collagen that mainly forms the basement membrane skeleton), type VI that forms extracellular fine fibers, and a basement plate from epidermal basal cells such as skin.
  • Type VII that forms anchoring fibrils that penetrate through 4)
  • Type X that forms hexagonal lattice (present temporarily when cartilage moves to bone), forms desme hexagonal structure of the nucleus membrane of the eye XIII type, XV type, XVII type, XVIII type having domains that penetrate the cell membrane.
  • Vimentin is a medium-diameter filament protein that is characteristically expressed in mesenchymal cells such as fibroblasts and white blood cells. Vimentin filament assembly is controlled by phosphorylation by various protein kinases. It is known to be expressed transiently during development. Insulin-like growth factor-binding protein 7 (IGFBP7) binds to IGF-1 receptor and blocks activation of IGF-1 receptor by insulin-like growth factor. For this reason, the abundance of IGFBP7 is a protein that shows an inverse correlation with tumor progression.
  • IGFBP7 Insulin-like growth factor-binding protein 7
  • Fibronectin is a glycoprotein that forms an extracellular matrix, and a polypeptide having a molecular weight of about 250 kDa forms a dimer. It mainly promotes adhesion of fibroblasts, hepatocytes, and nerve cells. Integrin, a specific receptor on the cell membrane surface, is involved in cell adhesion, cell migration, phagocytosis, etc., as well as in tissue damage.
  • Decorin is a small dermatan sulfate proteoglycan, bone proteoglycan II, PG-40, PG-II, PG-2, DS-PGII, a proteoglycan with a single chondroitin sulfate hybrid chain in the core protein of 38kDa (molecular weight 38,000) Yes, it is bound to collagen fibers. It is widely distributed in connective tissues of animals such as cartilage, bone, tendon, skin, sclera and aorta.
  • Plasminogen activator inhibitor binds to and inhibits tissue plasminogen activator, which plays an important role in fibrin lysis. Most important is PAI-1, which is produced in the vascular endothelium and is also present in platelets. In addition, there is PAI-2 produced in the placenta and PAI-3 that blocks activated protein C (APC). An increase in blood concentration of PAI-1 causes a tendency to thrombosis, but it is a kind of acute phase protein, which is higher in the afternoon than in the morning and has a positive correlation with acylglycerol taken in the blood.
  • Actin cytoplasmic 2 is a muscle contractile protein. Actin is considered to function mainly as actin filaments in cells. In muscle cells, actin filaments associate with type II myosin to form actomyosin bundles and contribute to muscle contraction. In non-muscle cells, including neurons, actin filaments are prominent filopodia, filamentous lamella lipodia (Lamellipodia), activated type II myosin It forms a variety of actin structures such as stress fibers consisting of actomyosin bundles associated with the.
  • actin structural rearrangements are spatiotemporally controlled by intracellular signal transduction via Rho family low molecular weight G proteins, and are important in dynamic control of cell morphology such as cell movement and cell division. Take on. At the same time, it contributes to vesicle transport along actin filaments through binding to atypical myosin. In addition to this dynamic role, actin filaments accumulate directly under the cell membrane and form the lining structure of the cell cortex, as well as cadherin, which is a cell adhesion factor via ⁇ -catenin and vinculin. Combine to support cell-cell adhesion.
  • Sulfhydryl oxidase 1 is a thiol oxidase using R′C (R) SH as a substrate.
  • SPARC is a 30 kDa non-collagenous protein present in bone and dentin, and plays a central role in the function of dermis formation. Secreted from fibroblasts, enhances the synthesis of collagen and hyaluronic acid.
  • Metalloproteinase inhibitors are endogenous inhibitors that control the activity of matrix metalloproteinases (MMPs).
  • MMP matrix metalloproteinases
  • TIMP-1 and 2 both bind to the active site of many MMPs and irreversibly inhibit their activity. In addition, these two TIMPs act directly on various cells and exhibit growth promoting activity.
  • SCP2 refers to microbial cells or protein extracts from cells produced in large quantities using petroleum, natural gas, alcohol, molasses, agricultural products, etc. as fermentation raw materials.
  • single cell protein it may be a product obtained by sterilizing and drying unicellular organisms rich in proteins such as yeast, bacteria, filamentous fungi and algae.
  • the 72 kDa type IV collagenase is also called gelatinase, and among the gelatinases, the A enzyme is called 72 kDa type IV collagenase (MMP-2).
  • MMP-9 The 95 kDa B enzyme is called MMP-9.
  • MMP-2 has three repeats of type II fibronectin domain inserted in the catalytic domain, and belongs to the gelatinase group of MMPs together with MMP-9.
  • MMP-2 is collagen I, IV, V, VII, X, XIV, gelatin (gelatin), elastin, laminin-1, laminin-5, myelin basic protein, MMP-1, MMP-9, Direct or indirect substrate specificity for MMP-13.
  • Rho GTPase activating proteins are a group of G proteins that do not have a subunit structure with a molecular weight of 20,000 to 30,000 and constitute a superfamily. This superfamily is divided into five groups: Ras, Rho, Rab, Arf, and Ran.
  • Rho GTPase activating protein is a protein belonging to Rho. Rho proteins regulate smooth muscle contraction, cytokinesis, cell motility, and cell morphology through reorganization of actin filaments.
  • Bone marrow stromal cells are cells that exist in the bone marrow, can be easily collected by bone marrow puncture, and support hematopoiesis.
  • the bone marrow includes cells roughly classified into two, blood cells and stromal cells that support blood cells, but bone marrow stromal cells are included in the latter.
  • Blood cells proliferate in suspension when cultured, but bone marrow stromal cells grow by adhering to the walls.
  • the shape is the same as mesenchymal cells, but takes a reticulated structure in the bone marrow. It can be cultured in the same way as normal fibroblasts. Originally, mesenchymal stromal cells differentiate into various cells.
  • Bone marrow stromal cells are induced to differentiate into bone cells, chondrocytes, adipocytes, and skeletal muscle cells.
  • a dental pulp cell is a kind of stem cell contained in a tooth nerve. The dental pulp cells are protected by a hard material called teeth, and since the teeth do not transmit ultraviolet rays or radiation, it is said that genes are not easily damaged.
  • the immortalized deciduous dental stem cell is a cell obtained by immortalizing the dental pulp stem cell obtained from the deciduous tooth. Teeth are made of a hard material, physically protect the pulp, and are impervious to ultraviolet rays and radiation.
  • Immortalized stem cells are prepared as follows. First, the deciduous deciduous teeth are disinfected with, for example, chlorohexidine, isodine solution or other disinfectant. Next, when using the animal's femur as the sole, for example, a syringe filled with PBS or the like is used to select a syringe needle with a thickness that fits tightly into the spinal cord of the animal's femur and extrude bone marrow cells. And take it out. In the case of porcine teeth or human fallen deciduous teeth, each crown is divided and the pulp tissue is collected with a dental reamer.
  • porcine teeth or human fallen deciduous teeth each crown is divided and the pulp tissue is collected with a dental reamer.
  • the harvested bone marrow mesenchymal cells or dental pulp tissue is converted into a basic medium such as Dulbecco's method containing 5-15% bovine serum (hereinafter sometimes referred to as “CS”) and 50-150 units / mL antibiotics. Suspend in Eagle medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, hereinafter referred to as “DMEM”). Subsequently, the cells are treated with 1-5 mg / mL collagenase and 1-5 mg / mL dispase at 37 ° C. for 0.5-2 hours.
  • CS bovine serum
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • fetal bovine serum is added to the above-mentioned medium, for example, DMEM, and after enzyme treatment, centrifugation is performed for 3 to 10 minutes (3,000 to 7,000 rpm) to collect dental pulp cells. If necessary, cell sorting is performed using a cell strainer. The sorted cells are resuspended in, for example, 3 to 6 mL of the above basic medium, and seeded in an adherent cell culture dish having a diameter of 4 to 8 cm.
  • the cells are cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C., for example, for about 2 weeks while changing the medium every 2 to 3 days. . During this period, 2-4 passages are performed. After confirming that the cells have become subconfluent, the culture medium is removed, and the cells are washed 1 to several times with PBS or the like. Instead of removing the culture medium and washing the cells, the adhesive dental pulp stem cells that formed colonies can also be recovered. Adherent dental pulp stem cells are detached from the dish by treatment with, for example, 0.025-0.1% trypsin and 0.3-1 mM EDTA for several minutes at 37 ° C., and the cells are then collected.
  • a culture solution such as DMEM containing 10% FCS
  • centrifugation is performed for 3 to 10 minutes (3,000 to 7,000 revolutions / minute) after enzyme treatment, and pulp cells are collected.
  • cell sorting is performed using a cell strainer.
  • the sorted cells are resuspended in, for example, 3 to 6 mL of the above basic medium, and seeded in an adherent cell culture dish having a diameter of 4 to 8 cm.
  • a culture solution for example, DMEM containing 10% FCS is added, and the cells are cultured for a desired period in the same manner as described above, and the cells are washed 1 to several times with PBS or the like to obtain adherent cells.
  • bone fluid (approximately 30-100 ⁇ L / femur) obtained from the medullary cavity of the rat's femur is replaced with approximately 5-15% fetal bovine serum (FBS), penicillin and streptomycin. It is preferable to select cells having desired characteristics by placing them in DMEM containing (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and performing pre-culture for 2 to 4 generations at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. For example, bone fluid (about 50 ⁇ L / femur) is placed in DMEM containing 10% FBS, the above-mentioned concentrations of penicillin and streptomycin, and precultured for 3 generations at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. In the sorting step described later, cells having characteristics such as spindle shape and adhesiveness are selected.
  • FBS fetal bovine serum
  • the selected adherent cells are obtained.
  • stem cells are seeded in an adherent cell culture dish and cultured under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C.
  • BMSCs obtained from the femur are used, only cells having characteristics such as spindle shape and adhesiveness are selected and used.
  • the subculture is detached and collected from the culture vessel using trypsin and EDTA as described above.
  • the sub-conflict refers to a state in which cells adhere to about 70% of the cell attachment surface in the culture vessel.
  • the subculture is performed 1 to 8 times, and the selected cells are grown to the required number of cells, for example, about 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the cells are collected and stored in liquid nitrogen. Cells collected from various donors may be stored in the form of dental pulp stem cell banks.
  • the stem cells obtained as described above are initially cultured to obtain initialized cultured cells.
  • HTERT, bmi-1, E6, and E7 are introduced into the initial cultured cells as follows.
  • a plasmid for incorporating the above gene is prepared, and this is incorporated into a shuttle vector such as pSuttle2, and the above gene is cloned.
  • E. coli is transformed with this shuttle vector, and kanamycin somatic transformants are selected.
  • the plasmid DNA of the selected kanamycin somatic transformant is purified and the restriction enzyme site is analyzed to identify the recombinant.
  • the expression cassette is then excised from the shuttle vector using restriction enzymes such as PI-Sce I and I-Cue I and ligated to an adenoviral vector such as Adeno-X viral DNA.
  • the resulting ligation product is cleaved with SwaI and used to transform E. coli.
  • hTERT is a gene of telomere repair enzyme
  • bmi-1 is a gene of Bmi-1, which is one of the proteins constituting the polycomb complex.
  • Bmi-1 is necessary for maintenance of hematopoietic stem cells, and has an effect that hematopoietic stem cells can be increased by enhancing the activity.
  • E6 and E7 are the early genes of HPV-16 or HPV-18 DNA.
  • Oct3 / 4 is a gene that activates transcription of the target gene in cooperation with Sox2.
  • Klf4 Keruppel-type transcription factor 4 regulates genes involved in cell division and embryogenesis, and has been implicated as a tumor suppressor for digestive cancer.
  • Sox2 belongs to the SRY-related HMG box gene family, and is a gene known to be involved in maintaining undifferentiated (pluripotent) functions.
  • c-Myc is an oncogene and promotes both cell survival and death in tumors induced with c-Myc.
  • p16INK4a is a gene that plays an important role in controlling the cell cycle of cancer cells.
  • the recombinant adenovirus is then digested with Pac I and transfected into HEK293 cells. Recombinant adenovirus is propagated and collected to determine virus titer.
  • the virus is purified according to a conventional method and infected with the target cell, SHED.
  • the cell group after virus infection is stained with FITC according to a conventional method, and STRO-1-positive cells are detected using a flow cytometer.
  • STRO-1 is considered as one of the markers of pluripotent mesenchymal stem cells in the bone marrow and serves as an indicator of cell immortalization.
  • Bone marrow stromal cells, dental pulp cells, and immortalized deciduous dental stem cells derived from dental pulp can be obtained.
  • Bone marrow stromal cells, dental pulp cells and immortalized deciduous dental pulp cells obtained as described above should be derived from rat, porcine or human deciduous teeth, and it is easy to obtain a source for obtaining these cells.
  • these cells are preferably cultured at 37 ° C.
  • the cell sorting step it is preferable to sort cells having spindle-shaped and spindle-type adhesive properties. Further, it is preferable to collect the culture supernatant from 44 to 52 hours after the start of the culture because the content of cells having a spindle shape and a spindle shape and adhesiveness is large. Moreover, it is more preferable to collect the culture supernatant 48 hours after the start of the culture because cells having higher adhesion can be obtained.
  • the culture supernatant contains at least type I collagen (Col-I), fibronectin, decorin, vascular endothelial growth factor (VEGF), and bone sialoprotein (BSP) produced by the sorted cells.
  • Col-I type I collagen
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • BSP bone sialoprotein
  • IGF insulin-like growth factor binding protein 7
  • follistatin related protein metalloproteinase inhibitor I
  • tissue plasminogen activator inhibitor actin
  • actin actin
  • sulfhydryl oxidase I It further includes at least one protein selected from the army consisting of insulin-like growth factor (IGF) -1, stem cell growth factor (HGF), and TGF- ⁇ , further integrating the metal implant material with the bone Preferred because it is promoted.
  • the culture supernatant obtained as described above is centrifuged and then subjected to ethanol precipitation to prepare a precipitate.
  • unnecessary cells are removed by centrifugation at 1,000 to 2,000 rpm for 3 to 10 minutes, 2,500 to 3,500 rpm for 1 to 5 minutes, and 0 to 10 ° C.
  • add approximately 8-12 volumes of ethanol to the supernatant incubate at -5-15 ° C for 30-90 minutes, and centrifuge at 2-6 ° C at 10,000-20,000 rpm for 10-20 minutes. Except for clearing, a precipitate is obtained. Thereafter, the precipitate obtained in the precipitate preparation step is freeze-dried.
  • the product of the cell can be obtained.
  • the obtained cell product is preferably stored at ⁇ 20 to ⁇ 40 ° C. from the viewpoint of maintaining activity.
  • a highly functional implant is produced as follows. Specifically, (f) a cleaning step of cleaning the surface of the implant material with an organic solvent to obtain a cleaning implant material; and (g) the cleaning implant material in a calcification solution having a predetermined composition at a predetermined temperature. And (h) a treatment step in which the immersion implant material is treated with a solution containing a cell product at a predetermined concentration.
  • the implant material is formed of any material selected from the group consisting of titanium, zirconia, hydroxyapatite, and ⁇ -TCP. It is preferable from the viewpoint of easiness. Among these, it is more preferable to use titanium (Ti) because it is easy to process with the stem cell culture supernatant and has high efficiency.
  • acetone and 60 to 80% (v / v) ethanol as the organic solvent because the cleaning effect on the surface of the implant material is high.
  • the reason why the ethanol concentration is 60 to 80% (v / v) is that if it is less than 60%, the cleaning power is weak, and if it exceeds 80%, no further cleaning effect can be obtained.
  • the implant material cleaned as described above is immersed in a calcification solution having a predetermined composition for 3 to 6 hours.
  • the composition of the first calcification solution is 100-150 mM NaCl, 2.5-3.5 mM CaCl 2 ⁇ H 2 O, 1.5-2.5 mM K 2 HPO 4 , 25-75 mM Tris-HCl (pH 7.2-7.6) Is preferable from the aspect of the efficiency of calcification, and 136.8 mM NaCl, 3.10 mM CaCl 2 ⁇ H 2 O, 1.86 mM K 2 HPO 4 , 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) has high calcification efficiency. Is preferred.
  • the immersion time is set to 3 to 6 hours because there is a problem that calcification is not sufficient if it is less than 3 hours, and no further effect is obtained even if it exceeds 6 hours.
  • An immersion time of 4 hours is preferable because sufficient calcification is performed.
  • the immersion is preferably performed at 36 to 38 ° C. in order to prepare in advance for immersion in a second calcification solution described later, and more preferably performed at 37 ° C.
  • the implant material that has been soaked as described above is incubated with a second calcification solution containing a culture at a predetermined concentration for a predetermined time to attach Col-I, BSP, VEGF, and other growth factors.
  • the second calcification solution may have a composition of 130 to 160 mM KNO 3 , 1 to 2 mM Ca (NO 3 ) 2 ⁇ 4H 2 O, 0.5 to 1.5 mM K 2 HPO 4 (pH 7.0 to 7.8). It is preferable because of its high protein attachment efficiency.
  • the concentration of the aqueous solution is less than 5 mg / mL, there is a problem that the amount of the growth factor adhering is insufficient and the adhesion to the alveolar bone is weak. It is because it cannot be obtained. It is more preferable to treat with an aqueous solution having a concentration of 10 mg / mL since sufficient adhesion to the alveolar bone can be secured.
  • a highly functional implant having at least Col-I, bone sialoprotein (BSP), and VEGF on its surface can be obtained.
  • BSP bone sialoprotein
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Rat BMSCs were obtained from the medullary cavity of rat femur. Bone marrow fluid (50 ⁇ L / femur) is collected and Dulbecco's modified MEM (DEMEM, containing 10% fetal bovine serum (FBS, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), penicillin and streptomycin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Sigma-Aldrich) and pre-cultured at 37 ° C. for 3 passages in a 5% CO 2 incubator. The medium was changed every 2 days. Only cells with characteristics such as spindle shape and adhesion were used.
  • DEMEM Dulbecco's modified MEM
  • CM preparation Cultured BMSCs were grown to 70-80% confluent, washed 3 times with warm phosphate buffered saline (PBS), and serum-free DMEM containing penicillin and streptomycin was added .
  • PBS warm phosphate buffered saline
  • DMEM serum-free DMEM containing penicillin and streptomycin was added .
  • the culture supernatant after 48 hours (hereinafter sometimes referred to as “CM”) was collected, centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes, and then centrifuged at 3,000 rpm for 3 minutes to remove other cells.
  • 5 mL of CM was mixed with 45 mL of 100% ethanol and incubated at ⁇ 20 ° C. for 1 hour. This mixture was centrifuged at 4 ° C. and 15,000 rpm for 15 minutes, and the supernatant was removed.
  • CM precipitate was resuspended in cold 90% ethanol ( ⁇ 20 ° C.) and centrifuged at 4 ° C. and 15,000 rpm for 15 minutes. The final precipitate was frozen at ⁇ 80 ° C., lyophilized and stored at ⁇ 30 ° C. until use. Serum-free DMEM not contacted with cells was used as a control.
  • CM-fixed Ti implant screw Ti implant screws (total length 5 mm, thread diameter 2 mm, and 1 mm pitch) were provided by Nishijima Medical Co., Ltd. These Ti implants were manufactured under the conditions obtained in previous studies.
  • the surface of the Ti implant was treated with PBS alone, DMEM alone or CM, and each was treated with PBS treatment group (negative control group), DMEM treatment group (positive control group) and CM / DMEM treatment group (test group).
  • PBS treatment group negative control group
  • DMEM treatment group positive control group
  • CM / DMEM treatment group test group
  • the Ti implant was washed with acetone and 70% ethanol, and the first mineralized solution [50 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 136.8 mM NaCl, 3.10 mM CaCl 2 ⁇ H 2 O, 1.86 mM K 2 HPO 4 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) was immersed at 37 ° C. for 4 hours.
  • the first mineralized solution [50 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 136.8 mM NaCl, 3.10 mM CaCl 2 ⁇ H 2 O, 1.86 mM K 2 HPO 4 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • FIGS. 1 (A) to (F) show micrographs obtained by observing the surface of each Ti implant material in the second calcification solution immediately after the start of incubation and after the end with a scanning electron microscope (manufactured by JEOL Ltd.) are shown in FIGS. 1 (A) to (F). Shown in Figures 1 (A) to (C) were taken at 3,000 times, and (D) to (F) were taken at 15,000 times. (A) and (D) show typical topography when the surface of the Ti implant is mechanically polished. (C) and (E) show a snow scene-like microstructure. In (F), a snow scene-like microstructure and microspheres (microspheres) on the surface of the Ti implant were observed. Microspheres are indicated by arrows. The line segments shown in the figure are 10 ⁇ m for (A) to (C) and 2 ⁇ m for (D) to (F).
  • the adherent rat BMSCs were incubated with 0.05% trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich) for 10 minutes and detached from the Ti disk. This Ti disk was observed by SEM, and it was confirmed that BMCs of all rats were detached. The detached cells were calculated using a hemocytometer (Sunlead Glass (made)). The experiment was repeated three times, and statistical significance was analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) using the Scheff test at a significance level of 5% (p ⁇ 0.05). The results are shown in FIG. Significant differences were observed between the PBS treatment group and the DMEM treatment group, and between the PBS treatment group and the CM treatment group (*: p ⁇ 0.05, ANOVA test).
  • the gel cut as described above was first washed and washed twice in 25 mM NH 4 HCO 3 containing 100 ⁇ L of 30% (v / v) acetonitrile for 20 minutes, and then CVE-3100 (Tokyo Rika) And dried with a machine).
  • In-gel digestion of protein is 50 mM iodoacetamide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) / 100 mM NH 4 HCO 3 (pH 7.8) containing 20 ⁇ g / mL sequence grade trypsin (Promega).
  • Peptides were extracted in 60% acetonitrile containing 0.1% TFA for 20 minutes at room temperature and peptide samples were dried in CVE-3100.
  • PMF Peptide mass fingerprinting
  • AMR Paradigm MS4-LCQ Advantage
  • CM culture supernatant
  • ALP alkaline phosphatase
  • OCN osteocalcin
  • OPN osteopontin
  • BSP bone sialoprotein
  • Col-I type I collagen
  • VEGF A vascular epidermal growth factor A
  • RNA analysis of rat BMSCs Rat BMSCs were cultured on Ti disks treated with PBS, DMEM or CM. The immobilization and culture methods are the same as those used for the cell adhesion analysis. BMSCs were cultured for 1 day, 7 days, 14 days. Total RNA from rat BMSCs cultured on each disk was performed using TRIZOL reagent (Invitrogen Life Technology) according to the manufacturer's protocol.
  • cDNA from 1 ⁇ g total RNA, 10 ⁇ reaction buffer, 5 mM dNTP mix, 1 U / ⁇ L RNase inhibitor, 0.25 U / ⁇ L reverser enzyme (M-MLV reverse transcriptase, Invitrogen), and 0.125 ⁇ M random primer Synthesized in a 20 ⁇ L reaction solution containing (Takara Bio Inc.).
  • CM labeling using QDs was performed according to the manufacturer's instructions. Briefly, Ti specimens treated with calcification solution were treated with 25 ⁇ L of 8 ⁇ M QDs, 1 mg / mL CM, 1 mL of 10 mM borate buffer (pH 7.4), and 5.7 ⁇ L of 10 mg / mL N-ethyl-N.
  • A, B, and C respectively show images of the Ti implant before the start of the test.
  • A1 shows an image 1 day after the start of the test
  • A7 shows an image after 7 days
  • A14 shows an image after 14 days
  • A28 shows an image after 28 days.
  • B and C For Ti implants treated with PBS, no fluorescence was detected around it throughout the observation period. In contrast, a trend was detected around the Ti implant treated with DMEM or CM. From the above, it was found that localization of biomolecules occurred in Ti implants treated with DMEM or CM.
  • E. coli competent cells Supercharge EZ10 Electrocompetent Cells, product code 636756), Swa I (product code 1111A, Smi I is equivalent), Xho I (product code 1094A), T4 DNA Ligase (product) Code 2011A), NucleoBond Xtra Midi (product code 740410.10 / .50 / .100), and NucleoSpin Plasmid (product code 740588 10/50/250) were all purchased from Takara Bio Inc. Pac I was purchased from New England Biolabs.
  • Buffer 1 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 10 mM EDTA and 50 mM glucose (stored at 4 ° C. after autoclaving)
  • Buffer 2 0.2M NaOH containing 1% SDS (prepared immediately before use, sealed, and stored at room temperature)
  • Buffer 3 5M KOAc (stored at 4 ° C after autoclaving)
  • Buffer 4 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 1 mM EDTA, 20 ⁇ g / mL RNase (add RNase immediately before use and store at ⁇ 20 ° C.)
  • HEK293 cells (ATCC # CRL1573) transformed with human type 5 adenovirus were used.
  • HEK293 cells were cultured in complete medium.
  • the composition of the complete medium was DMEM (basic medium) supplemented with 100 unit / mL penicillin G sodium, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 4 mM L-glutamine and 10% FBS.
  • Penicillin G sodium solution was prepared at 10,000 units / mL
  • streptomycin sulfate solution was prepared at 10,000 ⁇ g / mL and stored as a stock solution.
  • 60 mm plate, 100 mm plate, 6-well plate, T75 and T175 flasks were used.
  • Trypsin-EDTA (product code CC-5012) was purchased from Takara Bio Inc. Phosphate buffered saline (without PBS, Ca2 + and Mg2 + ) and Dulbecco's phosphate buffered saline (containing DPBS, Ca2 + and Mg2 + ) were prepared. Further, a 0.33% neutral red staining solution and a 0.4% trypan blue staining solution were used.
  • X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside [25 mg / mL]) dimethylformamide (DMF) solution was stored at ⁇ 20 ° C. in the dark. Luminescent ⁇ -gal Detection Kit II (product code 631712) was used.
  • trypsin reaction was stopped by adding 10 mL complete medium and gently suspended. Viable count was performed, and 10 5 cells were transferred to a 100 mm plate containing 10 mL of the culture solution and spread uniformly.
  • a recombinant adenovirus containing lacZ was constructed according to the attached protocol.
  • the target cell, SHED was infected and assayed for ⁇ -galactosidase expression to confirm that the vector was constructed.
  • rpShuttle2 Vector Before construction of recombinant pShuttle2 Vector (hereinafter referred to as “rpShuttle2 Vector”), DH5 ⁇ E. coli was transformed with pShuttle2 Vector and pShuttle2-lacZ Vector included in the kit. . A transformant was selected on an LB agar plate (hereinafter referred to as “LB / Kan”) containing 50 ⁇ g / mL kanamycin, and the cells taken from a single colony were streaked to a new LB / Kan. Incubate overnight at ° C.
  • LB / Kan LB agar plate
  • hTERT, bmi-1, E6, and E7 were cloned into pShuttle2 by the following procedure.
  • the pShuttle2 Vector was cleaved with restriction enzymes suitable for these genes.
  • pShuttle2 Vector Information Packet (PT3416-5) attached to the above kit, a multicloning site matching the DNA to be inserted was determined.
  • the above plasmid treated with the restriction enzyme was purified by treatment with alkaline phosphatase.
  • a target DNA fragment was prepared and purified according to a conventional method.
  • the vector digested with the restriction enzyme and the gene fragment were ligated, and DH5 ⁇ cells (competent cells) were transformed with the ligation product.
  • a part of the above competent cells was taken and transformed with the control vector pShuttle2-lacZ Vector included in the kit to serve as a positive control.
  • the mixed solution containing transformed E. coli was inoculated on an LB / Kan agar plate, and kanamycin resistant (Kanr) transformants (colony) were selected. Five to ten Kan resistant clones were selected and inoculated into a small amount of liquid medium for amplification. After confirming that these clones had rpShuttle2 Vector, they were incubated overnight. Thereafter, the constructed plasmid DNA was purified by a conventional method using a commercially available silica adsorption column.
  • rpShuttle2 plasmid DNA Recombinant pShuttle2 plasmid DNA
  • rpShuttle2 plasmid DNA was directly transfected into target cells, and Western blotting was performed to preliminarily check the expression of the target protein.
  • Phenol chloroform: isoamyl alcohol extraction
  • a centrifuge tube add 70 ⁇ L of 1 ⁇ TE Buffer (pH 8.0) and 100 ⁇ L of PCI mixture to the remainder of the double digestion solution (25 ⁇ L), Vortex thoroughly. Subsequently, it was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. using a microcentrifuge, and the aqueous layer was transferred to a clean 1.5 mL microcentrifuge tube. To this, 400 ⁇ L of 95% ethanol, 25 ⁇ L of 10M ammonium acetate, and 1 ⁇ L of glycogen (20 mg / mL) were added, and vortexed well.
  • the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed by aspiration to obtain a pellet.
  • 300 ⁇ L of 70% ethanol was added and centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes at room temperature. The supernatant was carefully aspirated off and the pellet was air dried at room temperature for approximately 15 minutes. After the pellet was dried, it was dissolved in 10 ⁇ L of sterile 1 ⁇ TE buffer (pH 8.0) and stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • Adeno-X plasmid DNA was purified according to the mini-scale method described later.
  • the cell suspension was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the clear supernatant was transferred to a clean 1.5 mL centrifuge tube.
  • 450 ⁇ L of a PCI mixed solution was added, mixed by inversion and stirred. Thereafter, the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the aqueous layer was transferred to a clean 1.5 mL microcentrifuge tube.
  • Each culture plate was transfected with 10 ⁇ L of Pac I-digested Adeno-X plasmid DNA, and Adeno-X DNA was introduced into HEK293 cells according to a standard transfection method (CalPhos Mammalian Transfection Kit product code 631312). From the day after transfection, it was confirmed whether CPE (cytopathic effect) occurred. One week later, the cells adhering to the bottom and sides of the culture plate were gently agitated to release them. The resulting cell suspension was transferred to a 15 mL sterilized conical centrifuge tube and centrifuged at 1,500 ⁇ g for 5 minutes at room temperature.
  • the resulting precipitate was suspended in 500 ⁇ L of sterile PBS.
  • the freeze-thaw operation of freezing in dry ice / ethanol and thawing in a constant temperature bath at 37 ° C. was repeated three times to obtain a lysate in which cells were sufficiently thawed.
  • the suspension was lightly centrifuged to remove the suspended matter, and the supernatant was transferred to another sterilized tube and used immediately.
  • the portion not used immediately was stored at -20 ° C.
  • 250 ⁇ L of the lysate was added to cultured cells on a 60 mm plate, and the culture was continued.
  • the titer of adenovirus was measured using the anti-Hexon antibody contained in Adeno-X Rapid Titer Kit (product code 631028) according to the instruction manual (PT3651-1) of this kit.
  • CPE was confirmed by culturing at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 3 to 4 days.
  • a free cell suspension was prepared in the same manner as above and transferred to a 15 mL sterilized conical centrifuge tube. Freezing and thawing operations similar to the above were performed to thaw the cells.
  • a titer of 10 7 PFU / mL was obtained using the Adeno-X Rapid Titer Kit (product code 631028). Western blotting was performed to confirm that the packaged adenovirus genome has a functional copy of the transcription unit specific for the gene of interest.
  • Adenovirus infection to target cells (7-1) Infection to target cells 6-well plates were inoculated with 1 ⁇ 10 6 SHEDs 24 hours before infection. The day after inoculation, the medium was removed and 1.0 mL of medium containing virus was added to the center of each plate. This solution was spread evenly over the monolayer formed by SHED. The cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 4 hours to infect the virus with SHED. Then, a fresh medium was added and further cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . Transgene expression was analyzed over time from 24 to 48 hours after infection.
  • Example 3 Preparation of immortalized deciduous dental stem cells
  • deciduous deciduous dental pulp cells Decided deciduous teeth obtained from a 10-year-old healthy boy were used. After this deciduous deciduous tooth was sterilized with an isodine solution, the dental crown was cut horizontally using a dental diamond point, and the pulp tissue was collected using a dental reamer. The obtained dental pulp tissue was digested in a solution of 3 mg / mL type I collagenase and 4 mg / mL dispase at 37 ° C. for 1 hour. The solution was then filtered using a 70 mm cell strainer (Falcon).
  • the cells separated by filtration were resuspended in 4 mL of the above medium and seeded in an adherent cell culture dish having a diameter of 6 cm.
  • DMEM containing 10% FCS was added to the dish and cultured for about 2 weeks in an incubator adjusted to 5% CO 2 and 37 ° C.
  • the adherent cells (dental pulp stem cells) that formed colonies were treated with 0.05% trypsin / EDTA for 5 minutes at 37 ° C., and the cells detached from the dish were collected.
  • adherent cells selected as described above are seeded in an adherent cell culture dish (collagen-coated dish), and then primary cultured in an incubator adjusted to 5% CO 2 and 37 ° C. It was.
  • the cells become sub-confluent (about 70% of the surface of the culture container) or confluent by macroscopic observation, the cells are detached from the culture container by treatment with 0.05% trypsin / EDTA for 5 minutes at 37 ° C. And recovered.
  • the cells thus obtained were seeded again in a dish containing the above medium, and subculture was performed several times to grow to about 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the resulting cells were stored in liquid nitrogen. Thereafter, primary cultured cells were subcultured at a concentration of about 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 using the above medium. Cells passaged 1-3 times were used for experiments.
  • Human BMMSCs (Bone Marrow Mesenchymal stem cells) were purchased from Lonza and cultured according to the manufacturer's instructions.
  • SHED human fallen deciduous dental pulp stem cells
  • SHED was fixed with 3% paraformaldehyde, then rinsed twice with PBS and treated with 100 mM glycine for 20 minutes. These cells were then permeabilized with 0.2% Triton-X (Sigma-Aldrich) for 30 minutes and then incubated in a mixture of 5% donkey serum and 0.5% bovine serum albumin for 20 minutes. Next, the cells were incubated with the primary antibody mouse anti-human STRO-1 antibody (1: 100, manufactured by R & D) for 1 hour, and the secondary antibody goat anti-mouse immunoglobulin M-FITC antibody (1: 500, Incubated with Southern Biotech) for 30 minutes and mounted using Vector Shield DAPI (Vector Laboratories Inc). Thereafter, ⁇ -MEM supplemented with 15% FBS was placed in a 6-well plate, and the sorted cells were seeded for clone preparation. Approximately 300 colonies from the expanded cells were pooled for testing.
  • SHED-T 1 ⁇ 10 6 pieces of SHED were seeded on a collagen-coated dish of 100 mm ⁇ , and DMEM supplemented with 10% FBS was added and cultured until sub-confluent.
  • infected cells were selected by culturing for 10 days in the above medium supplemented with puromycin (1 pg / mL), and 500-600 resistant clones were pooled. Every 3-4 days, about 0.5 ⁇ 10 5 SHEDs were seeded in a 100 mm ⁇ culture dish and subcultured.
  • SHED-T 1 ⁇ 10 6 pieces of SHED was introduced was referred to as SHED-T, and the SHED into which the gene was not introduced was referred to as SHED-C.
  • FIG. 5 shows the doubling state of the number of individuals of SHED-T (SHED into which gene was introduced).
  • the vertical axis represents the number of individual doublings (number of cell divisions), and the horizontal axis represents time (culture days).
  • the state in which SHED in culture does not divide for one month was used as a criterion for cell aging.
  • SHED-C stopped growing after about 30 times, and entered the aging or growth stopping stage.
  • SHED-T exceeded 250 PD and proliferated after 800 days.
  • SHED-C the proportion of STRO-1 positive cells was 27% in PD20 and decreased to 15% in PD30 (FIGS. 6 (A) and (B)).
  • SHED-T the proportion of STRO-1 positive cells was 46% for PD20 and 41% for PD40, respectively (FIGS. 6C and 6D).
  • FIG. 8 shows changes in the amount of new bone between SHED-T and SHED-C at each individual doubling number (doubling time).
  • ** represents p ⁇ 0.05
  • *** represents p ⁇ 0.01.
  • the amount of new bone was calculated
  • SHED-C the amount of new bone decreased as the number of individuals increased, and with PD20, it decreased to about 1/5 of PD0.
  • SHED-T the amount of new bone hardly changed until PD20, and it was shown that in PD20, SHED-T formed more than five times the bone of SHED-C.
  • Example 4 Implants and surgical procedures Ti implants (titanium fixtures) were inserted into the femur as previously described (reference number 40). Rats were anesthetized with a combination of inhalation of diethyl ether vapor (3 mL / chamber) and intraperitoneal administration of pentobarbital (20 mg / kg). A 10 mm incision was made beyond the distal femur and the bone was exposed.
  • a unicortical implant floor was formed 7 mm from the distal end of the femur at a rotational speed of 1500 rpm or less using a dental round bar (diameter 1.5 mm). Implants treated with CM, DMEM or PBS were inserted and embedded in cortical bone. Thereafter, the soft tissues were returned to their normal positions and sutured with 3-0 bicyclyl (registered trademark) SH-1 (Ethicon).
  • FIG. 10 (A) for cancellous bone
  • FIG. 10 (B) for cortical bone.
  • the bone graft contact rate was significantly different in cancellous bone between the negative control group and the other two groups at 7 and 14 days after transplantation.
  • cortical bone a significant difference was observed between the test group and the negative control group 1 day after transplantation (ANOVA test, *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01).
  • a high BIC value in the test group indicated that integration with the bone was promoted.
  • Example 5 Production of high-performance human implant (1) Material and method The implant used was a titanium implant (length 13 mm, diameter 3.75 mm, or length 11 mm, diameter 3.75 mm) manufactured by Astra. (2) Preparation of growth factor-containing culture supernatant Using the stem cell culture supernatant obtained in Example 1, a growth factor-containing solution was prepared and treated as follows.
  • the culture supernatant was put into a culture flask, a titanium implant material was added thereto, the lid was tightened tightly and shaken sufficiently. Sonicated with a sonicator for 1 minute. Next, the mixture was allowed to stand for 5 minutes, and again sonicated for 1 minute under the same conditions. After standing for 5 minutes, it was washed twice with pure water. As described above, a titanium implant coated with a growth factor contained in the culture supernatant was obtained. In place of the culture supernatant, the same treatment was carried out using only DMEM to prepare an untreated titanium implant material.
  • Example 6 Example of transplantation of high-functional implant (1) Patients, etc.
  • the implant prepared in Example 5 was transplanted to the maxillary edentulous jaw of 8 men aged 41 to 68 years. None of these patients had diabetes, hypertension or other underlying diseases affecting bone metabolism. Also, there was no heavy drinking and no smoking habits.
  • the site where the distance from the maxillary sinus floor was 15 mm or more in the maxillary molar region was designated as the implantation site. Eight implants treated with growth factor (treated group) were placed in the maxillary molar region on one side of the patient, and eight implants not treated with growth factor (untreated group) were placed on the opposite maxillary molar of the same patient Embedded in the department.
  • Example 7 Analysis of protein attached to culture supernatant and high-functional implant surface (1) Material and method Using the protein in the culture supernatant of stem cell obtained in Example 1, LC / MS / MS ( Identification was performed using MS4 HPLC System (Michrom BioResources) and LCQ Advantage mass spectrometry system (Thermo Scientific). The measurement conditions were as follows.
  • LC MS4 HPLC System (Michrom BioResources) Column: Magic C18AQ (Michrom BioResources, 0.1mm (id) x 50cm) Eluent: Gradient solution A (2% acetonitrile-98% water (containing 0.1% formic acid)) and solution B (90% acetonitrile-10% water (containing 0.1% formic acid) (0 min, 95% A: 5 % B ⁇ 45 min, 0% A: 100% B). Flow rate: 1 ⁇ L / min MS1: LCQ Advantage mass spectrometry system (Thermo Scientific) MS2: LCQ Advantage mass spectrometry system (Thermo Scientific)
  • the protein adhering to the implant is extracted by liquid chromatography in the order of 10% EDTA, 4M guanidine and 80% acetonitrile, and each buffer is collected at a flow rate of 2 mL / min. Prepared to 2 ⁇ g / mL. The amount of protein was measured by the biuret method. The culture supernatant was ethanol-precipitated using 100% ethanol and 90% ethanol and then lyophilized to prepare a protein amount of 2 ⁇ g / mL. The amount of protein was measured by the Bradford method. The analysis results are shown in Table 9.
  • the stem cell culture supernatant obtained in Example 1 contained a lot of proteins related to the formation of the cell structure. Further, from the large proportion of adherent cells after culturing the mesenchymal stem cells obtained as described above, collagen ⁇ -1 (I) chain, collagen ⁇ -2 (I) chain, fibronectin, and decorin However, it is thought that it plays an important role in the adhesion between the implant and the alveolar bone.
  • Example 8 Effect of culture supernatant on cell adhesion and effect of cryopreservation
  • Material The culture supernatant of stem cells obtained in Example 1 was used as a sample, and PBS was used as a negative control.
  • (2) Effect on cell adhesion 10 mL of bone marrow fluid was collected from the canine bone marrow stromal cells (age 18-25 months, body weight 15-25 kg) from the iliac bone of a beagle dog on a 15 mm diameter pure titanium plate, 10% FBS and 1.5-3 ⁇ 10 5 cells / well pre-cultured at 37 ° C.
  • the culture was performed at 37 ° C. using DMEM containing 10% FBS, penicillin (50 to 150 U / mL) and streptomycin (50 to 150 ⁇ g / mL).
  • DMEM fetal bovine serum
  • penicillin 50 to 150 U / mL
  • streptomycin 50 to 150 ⁇ g / mL
  • a pure titanium plate with a diameter of 15 mm was irradiated with atmospheric pressure plasma (MPS-01K01C, manufactured by Kagurita Manufacturing Co., Ltd.) at a distance of 10 mm from the tip of the plasma flame. And soaked at 37 ° C. for 24 hours.
  • the number of adherent cells at 1 hour and 24 hours after the start of the culture was determined by detaching adherent cells with trypsin-EDTA and counting floating cells on a hemocytometer.
  • the results are shown in FIG. In FIG. 12, N-PBS is cultured in PBS without plasma treatment, P-PBS is plasma treated and cultured in
  • N-PBS did not show a large increase in the number of adherent cells even after 24 hours, but P-PBS showed a large increase.
  • the number of adherent cells increased after 24 hours.
  • There was a significant difference in the number of adherent cells after 24 hours between the N-PBS group and the P-CM group (p ⁇ 0.01).
  • a significant difference was also observed between the P-PBS group and the P-CM group (p ⁇ 0.05).
  • the activity when stored for 1 month tended to decrease compared with the case stored for 1 week, but no significant difference was observed.
  • a significant difference was observed between the case where it was stored at ⁇ 80 ° C. for 2 weeks and the case where it was stored at ⁇ 15 ° C. for 1 month (p ⁇ 0.05).
  • a significant difference was observed between the case of storage at ⁇ 80 ° C. for 2 weeks and the case of storage at 4 ° C. for 1 month (p ⁇ 0.05).
  • the present invention is useful in the dental and medical fields.
  • Sequence number 1 Forward primer for ALP Sequence number 2: Reverse primer for ALP Sequence number 3: Forward primer for OCN Sequence number 4: Reverse primer for OCN Sequence number 5: Forward primer for OPN Sequence number 6: Reverse for OPN Primer SEQ ID NO: 7: Forward primer for BSP SEQ ID NO: 8: Reverse primer for BSP SEQ ID NO: 9: Forward primer for Collagen 1 SEQ ID NO: 10: Reverse primer for Collagen 1 SEQ ID NO: 11: Forward primer for GAPDH SEQ ID NO: 12: GAPDH reverse primer SEQ ID NO: 13: Collagen ⁇ -1 (I) chain precursor SEQ ID NO: 14: Collagen ⁇ -1 (II) chain precursor SEQ ID NO: 15: Collagen ⁇ -1 (XXVII) Chain precursor SEQ ID NO: 16: Collagen ⁇ - 2 (I) Strand precursor SEQ ID NO: 17: Fibronectin SEQ ID NO 18: fibronectin SEQ ID NO: 19: decorin SEQ ID NO: 20: decorin SEQ

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Abstract

　本発明は、簡便な手法で材料の表面特性を向上させ、そして、骨と金属インプラント材とを、一定の期間のうちに、十分に一体化できるインプラントの製造用細胞産生物の調製方法、前記方法で産生された産生物、前記産生物を用いた高機能インプラントを提供することを目的とする。　骨髄間質細胞又は不死化乳歯幹細胞からこれらの細胞の産生する、Col-I、OCN、OPN、BSP、フィブロネクチン及びVEGFその他の成長因子を含む細胞産生物を調製し、得られた細胞産生物と石灰化溶液とを用いて、これらの成長因子を表面に固定化した高機能インプラントを提供する。

Description

高機能インプラント材料
　本発明は、骨髄間質細胞（BMCs）又は不死化乳歯幹細胞の産生物を用いた高機能インプラント材料に関する。より詳細には、上記BMCs骨髄間質細胞又は不死化乳歯幹細胞の産生物を表面にコーティングした高機能インプラント材料に関する。
　歯科治療の目的の１つは、人工的な材料を用いて、欠損した歯の機能及び形状を回復させることにある。このため、欠損した歯等を補うために、最も一般的な治療としてインプラントが使用される。
　本来、欠損した歯等に十分な機能を発揮させるためにインプラントを安定化させることが必要であるから、インプラントは歯槽骨と一体化することが望ましい。このため、こうしたインプラント材料として、バイオガラスやリン酸カルシウムセラミックス（すなわち、ヒドロキシアパタイト及びβ-リン酸三カルシウム）その他の生物活性材料及び金属材料が使用されてきた。
　骨との一体化という観点からみると、上記のような生物活性材料は、生体適合性が高いという点で優れている。一方で、歯には大きな力がかかるため、強度や耐久性といった機械的特性という観点からみると、金属材料の方が優れている。そして、こうした金属材料の中でも、生体適合性及びコスト等の面から、チタン（以下、「Ti」ということがある。）がインプラント材料として汎用されている。
　インプラント材料の表面特性を向上させる技術としては、ヒト間葉幹細胞および骨芽細胞からなる一群から選択される細胞、又は、ウシ血漿アルブミン、フラクションＶ、およびウシ血清フィブロネクチンからなる一群から選択されるタンパク質を表面に引き寄せることができる、正の電荷を帯びた金属酸化物を表面に有するインプラント（以下、「従来技術１」という。）が提案されている。
　また金属インプラントの骨への一体化は、骨の再生能に依存することが知られている。そして、この骨への一体化能を向上させるために、骨形成試薬や成長因子のインプラント材料表面への適用が行われてきた。これまでの報告（以下、「従来技術２」という。）では、ポリペプチドや細胞を、ムコ多糖でコーティングしたインプラント上に固定すると、移植後のオッセオインテグレーション及び骨修復を改善することが報告されている。
特許公表２０１２－５０９７５０ 特許公表２００４－５３１４６１
　上述した従来技術は、金属インプラント材料表面を処理しない場合と比較すると、骨への一体化が進んでいるという点では優れたものである。しかし、生体適合性の高い生物活性材料を使用した場合に比べると、骨への一体化は不十分であるという問題点があった。
　また、金属インプラント材料表面の処理は、まず、金属インプラント表面を活性化する前処理を行い、その後に骨形成試薬で処理する、又は成長因子を適用するという手順で行われるため、操作が煩雑であった。さらに、金属インプラント材表面に成長因子を適用する場合には、その表面に固定した成長因子の保持される期間が問題となる。金属インプラント材の表面に保持される期間が、骨と金属インプラント材料とが一体化するのに必要な時間と比べて短ければ、十分な一体化が望めないからである。
　このため、簡便な手法で材料の表面特性を向上させ、そして、骨と金属インプラント材とを、一定の期間のうちに、十分に一体化できるようにすることについては、強い社会的要請があった。
　本発明は、上記のような状況の下で完成されたものである。
　すなわち、本発明の第１の態様は、5～15％の血清、50～150U/mLのペニシリン及び50～150μｇ/mLのストレプトマイシンを含有する培養液中に、5×103～5×104個/mLの骨髄間質細胞又は不死化乳歯幹細胞を加えて、34～37.5℃、5％CO2存在下に、予備培養を行う予備培養工程と；所定の形状と接着性とを有する前記細胞を選別する細胞選別工程と；前記選別工程で選別された細胞を予備培養と同じ条件で培養し、培養開始後40～56時間の培養上清を集める培養上清収集工程と；を備える、細胞産生物の調製方法である。
　ここで、前記骨髄間質細胞は、ラットの大腿骨から得られることが好ましく、不死化乳歯歯髄幹細胞は、ブタ歯髄及びヒト乳歯からなる群から選ばれるいずれかの細胞に由来するものであることが好ましい。前記細胞は、37℃で培養することが好ましい。
　また、前記細胞選別工程における所定の形状は、スピンドル形状かつ紡錘型であることが好ましい。前記培養上清は、培養開始後44～52時間で集めることが好ましく、培養開始後48時間で集めることがさらに好ましい。
　ここで、前記培養液は、ダルベッコ培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、ハムF12培地、及びRPMI1640培地からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の培地であることが好ましい。また、前記血清は、ウシ胎児血清、ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清、及びヒツジ血清からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の血清であることが好ましい。さらに、前記培養液は、10％ウシ胎児血清と、100Ｕ/mLのペニシリンと100μg/mLのストレプトマイシンとを含むことが好ましい。
　また、上記調製方法は、遠心及びエタノール沈殿処理を行って沈殿物を調製する沈殿物調整工程と、前記沈殿物調製工程で得られた沈殿物を凍結乾燥させる凍結乾燥工程とをさらに備えることが好ましい。
　本発明の第２の態様は、上述した調製方法で調製された細胞産生物である。上記細胞産生物には、少なくとも、Ｉ型コラーゲン（Col-I）、フィブロネクチン、デコリン及び血管内皮増殖因子（VEGF）が含まれることが好ましく、これらに加えてインスリン様成長因子結合タンパク質7、フォリスタチン関連タンパク質、メタロプロテイナーゼインヒビターI、組織プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、アクチン、及びスルフヒドリルオキシダーゼI、SPARC、コラーゲンα2(IV)鎖、β-2-ミクログロブリン、Rho GTPase活性化タンパク質18がさらに含まれることが、より一層好ましい。
　本発明はまた、インプラント材の表面を有機溶媒で洗浄し、洗浄インプラント材とする洗浄工程と；前記洗浄インプラント材を、所定の組成を有する第1石灰化溶液中に所定の温度で3～6時間浸漬し、浸漬インプラント材とする浸漬工程と；前記浸漬インプラント材を所定の濃度の細胞産生物を含有する第2石灰化溶液で2～5日間インキュベート処理する処理工程と；を備えることを特徴とする高機能インプラントの作成方法である。
　ここで、前記インプラント材は、チタン、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、及びβ‐TCPからなる群から選ばれるいずれかの材料で形成されていることが好ましい。また、前記有機溶媒は、アセトンと60～80％エタノールであることが好ましい。さらに、上記第１石灰化溶液は、100～150mM NaCl, 2.5～3.5mM CaCl2・H2O, 1.5～2.5mM K2HPO4, 25～75mM Tris-HCl（pH 7.2～7.6）であることが好ましく、136.8mM NaCl, 3.10mM CaCl2・H2O, 1.86mM K2HPO4, 50mM Tris-HCl（pH 7.4）であることがさらに好ましい。
　さらに、前記所定の温度が36～38℃であり、浸漬時間が4時間であることが好ましい。前記所定の細胞産生物は、上記の細胞産生物の5～20mg/mLの水溶液であることが好ましく、約10mg/mLであることがさらに好ましい。
　本発明の第３の態様は、上述したいずれかの方法で作成された高機能インプラントである。ここで、上記インプラント材は、チタン、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、及びβ‐TCPからなる群から選ばれるいずれかの材料で形成されていることが好ましい。
上記インプラントは、少なくとも、少なくとも、Ｉ型コラーゲン（Col-I）、フィブロネクチン、及びデコリンを表面に保有することが好ましく、インスリン様成長因子結合タンパク質7（IGF-binding protein 7）、フォリスタチン関連タンパク質、メタロプロテイナーゼインヒビターI、組織プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、アクチン、及びスルフヒドリルオキシダーゼIからなる群から選ばれる少なくとも１以上のタンパク質をさらに表面に有することがさらに好ましい。
　本発明の調製方法によれば、骨髄間質細胞又は不死化乳歯歯髄幹細胞によって産生され、Col-I、デコリン、ビメンチン、IGF-結合タンパク質7、フィブロネクチン、SPARC（secreted protein acidic and rich cycteine）等を含む細胞産生物を調製することができる。また、この細胞産生物を用いて、簡便に、高機能インプラントを作製することができる。
　さらにまた、短期間で骨との一体化ができる、高機能インプラント材を得ることができる。
図１は走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて撮影したTiインプラント表面の電子顕微鏡写真である。図１中、(A)及び(D)は、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で処理した場合の表面、(B)及び(E)はDMEM（ダルベッコのα‐MEM）で処理した場合の表面、(C)及び(F)はCM（細胞培養の培養上清）で処理した場合の表面を示す。 図２は、上記のように処理したTiインプラント（以下、「Tiプレート」ということがある。）表面に、1.0×106個の細胞を播種し、24時間後に接着していた細胞数を示す図である(ANOVA検定。図中、*はp＜0.05を示す)。
図３は、固定化されたDMEM又はCMを有するTiプレート表面上で培養されたラットBMSCsのゲル電気泳動像(A)～(C)、及びそれを定量化したグラフ(D)～(F)である。 図４は、in vivoにおけるTiインプラント上でのQDラベルされた生体分子の検出画像である。図中、PBS、DMEM及びCMは上記の通りである。
図５は、上述した歯髄細胞から選択された不死化幹細胞と、不死化幹細胞ではない細胞の個体倍化数と培養期間との関係を表すグラフである。図１中、SHED-Tは不死化幹細胞を表し、SHED-Cは不死化幹細胞ではない細胞を表す。 図６は、SHED-C及びSHED-TでのSTRO-1発現の結果を示すグラフである（図２(A)～(D)）。図中、PD20は個体数倍化回数＝20回、PD30は個体数倍化回数＝30回、及びPD40は個体数倍化回数＝40回を表す。
図７は、図８に示す各個体倍加時間のときのSHED-CとSHED-Tとの組織染色像を示す図である。 図８は、個体倍加時間（回数）と新生骨量との関係を示すグラフであり、図中、**はｐ＜0.05、***はｐ＜0.01を表わす。新生骨量は、以下の算出式で求めた。　新生骨量＝新生骨面積／視野面積×100
図９は、ラットの大腿骨Tiインプラントのトルク除去の値を示すグラフである（Ｎ＝３）。PBS、DMEM又はCMで28日間観察した（ANOVA検定。*はp＜0.05を、**はp＜0.01を示す）。 図10は、大腿骨の海綿骨又は皮質骨における骨対インプラント接触（Bone-to-implant contact、以下「BIC」と略す。）の変化を示すグラフである（Ｎ＝３）。（Ａ）は海綿骨、（Ｂ）は皮質骨を示す。図中、ANOVA検定の結果、*はp＜0.05を、また、**はp＜0.01を示す。 図11は、本発明の細胞産生物で処理した場合としない場合とのインプラントの安定性の経時変化を示すグラフである（Ｎ＝３）。図中、ANOVA検定の結果、*はp＜0.05を示す。
図12は、PBSで処理した場合、及び本発明の細胞産生物で処理した場合の細胞数の相違を示したグラフである（Ｎ＝３）。図中、Pは大気圧の下でプラズマ処理をし場合、Nはプラズマ処理をしていない場合である。また、ANOVA検定の結果、*はp＜0.05を、また、**はp＜0.01を示す。 図13は、図12の場合の細胞の増殖を、DAPI（4',6-ジアミノ-2-フェニルインドール）とファロイジンで染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果である（Ｎ＝３）。図中、スケールバーは100μｍを示す。 図14は、本発明の細胞産生物を、４℃、－15℃及び－80℃で、1週間（1Ｗ）、２週間（2Ｗ）及び１ヶ月（1M）保存し、これらを同量で培地に添加したときの細胞の増殖率の変化を示す（Ｎ＝３）。
　以下に、本発明の骨髄間質細胞の産生物の調製方法について、詳細に説明する。
　本発明の調製方法は、（ａ）５～１５％の血清、50～150Ｕ/mLのペニシリン及び50～150μｇ/mLのストレプトマイシンを含有する培養液中に、5×103～5×104個／mLの骨髄間質細胞又は不死化乳歯幹細胞を加えて、34～37.5℃、5％CO2存在下に、予備培養を行う予備培養工程と；（ｂ）所定の形状と接着性とを有する前記細胞を選別する細胞選別工程と；（ｃ）前記選別工程で得られた細胞を予備培養と同じ条件で培養し、培養開始40～56時間後の培養上清を集める培養上清収集工程と；を備えている。
　ここで、前記培養液は、ダルベッコ培地（以下、「DMEM」ということがある。）、イスコフ改変ダルベッコ培地（以下、「IMDM」ということがある。）、ハムF12培地（以下、「Ham12」ということがある。）、及びRPMI1640培地からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の培地であることが、入手及び取り扱いが容易であることから好ましい。上記の培地は、基本培地といわれる培地であり、GIBCO社、SIGMA社等から購入することができる。これらの培地のうち、二種以上を併用して混合培地として使用することもできる。混合培地の一例としては、IMDMとHamF12を等量混合した培地（例えば商品名：IMDM/HamF12（GIBCO社）として市販される）を挙げることができる。
　また、前記血清は、ウシ胎児血清、ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清、及びヒツジ血清からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の血清であることが、細胞の増殖が良く、問題となるようなタンパク質を培養上清中に産生しないことから好ましい。
　培地に添加可能な成分としては、上記の血清のほか、血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）、ウシ血清アルブミン（BSA）、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンその他の抗生物質、ビタミンＫ、葉酸その他の各種ビタミン類、カルシウム、マグネシウムその他の各種ミネラル、アルギニン、トリプトファンその他のアミノ酸等を挙げることができる。
　本発明の調製方法では、10％ウシ胎児血清と、100Ｕ/mLのペニシリンと100μg/mLのストレプトマイシンとを含む培養液を使用することが、十分な量の細胞増殖因子群を含む培養上清を得る上で好ましい。
　また、本発明は、（ｄ）遠心及びエタノール沈殿処理を行って沈殿物を調製する沈殿物調整工程と；（ｅ）前記沈殿物調製工程で得られた沈殿物を凍結乾燥させる凍結乾燥工程と；をさらに備える方法とすることができる。
　前記骨髄間質細胞は、ラットの大腿骨、ブタ下顎及び歯、及びヒト乳歯からなる群から選ばれるいずれかの細胞に由来するものであることが、一定の種類の細胞成長因子を安定して産生できる細胞を確実に入手できることから好ましい。
　ここで、細胞成長因子とは、特定の細胞の増殖、分化等に関与するポリペプチド性因子の総称であり、免疫系を調節するリンホカインやサイトカイン等も含まれる。増殖因子、細胞増殖因子と呼ばれることもある。以下、細胞成長因子を、単に「成長因子」ということがある。
　成長因子は、生体内における種々の細胞学的プロセス、生理学的プロセスの調節に関与していることが知られており、標的細胞表面にある受容体タンパク質（以下、単に「受容体」又は「レセプター」ということがある。）に特異的に結合し、シグナル伝達を行う。
　代表的な成長因子としては、上皮成長因子（Epidermal growth factor：EGF）、インスリン様成長因子（Insulin-like growth factor：IGF）、トランスフォーミング成長因子（Transforming growth factor：TGF）、神経成長因子（Nerve growth factor：NGF）、脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor：BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（Vesicular endothelial growth factor：VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor：G-CSF）、顆粒球マクロファージ刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor：GM-CSF）、血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor：PDGF）、エリスロポエチン（Erythropoietin：EPO）、トロンボポエチン（Thrombopoietin：TPO）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor：bFGFまたはFGF2）、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor：HGF）等を挙げることができる。
　TGF-βは、自然界に存在する増殖因子の１つである。他の多数のシグナル経路と同様に素子の発生、細胞の分化、胚の発育において極めて重要な役割を果たす。
　β型変異増殖因子TGF-βは腎臓、骨髄、血小板などほぼすべての細胞で産生され、5種類のサブタイプ（β1～β5）が存在する。TGF-β1～β3は、骨基質中に不活性型として蓄積されており、骨吸収の際に破骨細胞が放出する酸によって活性化される。TGF-βは、骨芽細胞の増殖及びコラーゲン等の間葉細胞の合成・増殖を促進するが、上皮細胞の増殖や破骨細胞に対しては抑制的に作用する。
　チロシンキナーゼ活性を有する上記受容体では、成長因子の結合により、タンパク質中のチロシン残基がリン酸化され、細胞の増殖・分化が惹起される。また、個体発生の際に、成長因子が中胚葉誘導物質となっている例もある。
　上記の成長因子は、それらの構造及び進化の面から関連するいくつかのファミリーに分類される。これらのファミリーとしては、TGF-β、骨形成タンパク質（bone morphogenic protein：BMP）、ニューロトロフィン（神経栄養因子）、線維芽細胞増殖因子（FGF）等を挙げることができる。上記神経栄養因子には、NGF、BDNF、NT3等が含まれる。成長因子は現在、医療でも盛んに用いられている。
　また、TGF-βは、TGF-βスーパーファミリーを構成する１つのメンバーであるが、このスーパーファミリーには、生物の骨形成に重要な役割を果たしている骨形成タンパク質（bone morphogenic protein：BMP）等が含まれる。
　本発明の培養上清には、コラーゲンα-1(I)鎖、コラーゲンα-2(I)鎖、ビメンチン、コラーゲンα-1(IV)鎖、IGF結合タンパク質7（IGFBP7）、フィブロネクチン、デコリン、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1、アクチン（細胞質性2）、スルフヒドリルオキシダーゼ1、SPARC、メタロプロテイナーゼインヒビター1、コラーゲンα-2(IV)鎖、SCP2、72kDa IV型コラゲナーゼ、β-2-ミクログロブリン、Rho GTPase活性化タンパク質18等の種々のタンパク質が含まれていることが好ましい。
　ここで、コラーゲンは3本のα鎖で構成される三重らせん構造の分子であり、I型、II型、III型、IV型、V型等、多くの型があることが知られている。各型の分子は同じ種類又は異なる種類のポリペプチド鎖からなる。このポリペプチド鎖（α鎖）の種類には30種類以上があることが知られており、α1(I)，α2(IV)等と呼ばれる。
　コラーゲンタンパク質ファミリーは、以下のように分類される。
　1)特異的な、67nmの周期構造横紋構造を有する線維を形成する分子群（I型、III型、V型（主として軟骨以外の組織））、II型、XI型（軟骨組織）
　2)これらの繊維表面に結合している分子群（XII型、XIV型（軟骨以外の組織）、IX型（軟骨組織））
　3)網目状の会合体を形成している分子群（主として基底膜の骨格を形成するIV型コラーゲン）、細胞外の微細繊維を形成するVI型、皮膚等の表皮基底細胞からの基底板を突き抜けて存在するアンカリングフィブリルを形成するVII型
　4）ヘキサゴナル格子を形成するX型（軟骨が骨へと移行する時期に暫定的に存在する）、目の核膜のデスメの六角構造を形成し、血管その他の組織にも存在する）、さらに細胞膜を貫通するドメインを有するXIII型、XV型、XVII型、XVIII型
　ビメンチンは、繊維芽細胞、白血球細胞等の間葉系細胞に特徴的に発現している中関径フィラメントタンパク質である。各種プロテインキナーゼによるリン酸化によって、ビメンチンフィラメント構築の制御を受ける。発生の過程で一過性に発現することが知られている。
　インスリン様増殖因子結合タンパク質7（insulin-like growth factor-binding protein 7：IGFBP7）はIGF-1受容体に結合し、インスリン様増殖因子によるIGF-1受容体の活性化を遮断する。このため、IGFBP7の存在量は腫瘍進行と逆相関を示すタンパク質である。
　フィブロネクチンは、細胞外マトリクスを形成する糖タンパク質で、分子量約250kDaのポリペプチドが二量体を形成している。主に繊維芽細胞、肝細胞、神経細胞などの接着を促進する。細胞膜表面の特異的レセプターであるインテグリンを介して、細胞接着のほか、細胞移動、食作用の促進などに関わり、さらに組織損傷の場においても働く。
　デコリンは、小型デルマタン硫酸プロテオグリカン、骨プロテオグリカンII，PG-40，PG-II，PG-2，DS-PGII，38kDa（分子量3.8万）のコアタンパク質に1本のコンドロイチン硫酸の混成鎖を持つプロテオグリカンであり、コラーゲン線維に結合して存在する。軟骨、骨、腱、皮膚、強膜、大動脈等の動物の結合組織に広く分布する。
　プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（PAI）は、フィブリンの溶解に重要な役割を演じる組織プラスミノーゲンアクチベーターと結合してその作用を阻止する。最も重要なのは、血管内皮で産生されるPAI-1であり、血小板中にも存在する。このほか、胎盤で産生されるPAI-2や、活性化プロテインC（APC）を阻止するPAI-3がある。PAI-1の血中濃度の増加は血栓傾向の原因となるが、一種の急性期タンパク質であり、午前よりも午後が高く、また、血中の取りアシルグリセロールと正の相関がある。
　アクチン（細胞質性2）は、筋肉の収縮性タンパク質である。細胞内においてアクチンは、主にアクチンフィラメントとして機能すると考えられている。筋細胞においては、アクチンフィラメントはII型ミオシンと会合してアクトミオシン束を形成し、筋収縮力に寄与する。神経細胞を含む非筋細胞においては、アクチンフィラメントは、突起状のフィロポディア（Filopodia、糸状仮足）、細胞辺縁の波打ち構造であるラメリポディア（Lamellipodia、葉状仮足）、活性化されたII型ミオシンと会合したアクトミオシン束からなるストレスファイバー（Stress fiber）等の多様なアクチン構造を形成する。
　これらのアクチン構造の再編成は、Rhoファミリー低分子量Gタンパク質を介した細胞内情報伝達により時空間特異的に制御されており、細胞運動や細胞分裂等の細胞形態の動的制御において重要な働きを担う。同時に、非定型ミオシンとの結合を介してアクチンフィラメントに沿った小胞輸送に寄与する。このような動的な役割以外にも、アクチンフィラメントは細胞膜の直下に集積し、細胞皮質（cell cortex）の裏打ち構造を形成する他、α-カテニンやビンキュリンを介して細胞接着因子であるカドヘリンと結合して細胞間接着を支える。
　スルフヒドリルオキシダーゼ1は、R’C(R)SHを基質とする、チオールオキシダーゼである。
　SPARCは、骨と象牙質に存在する30kDaの非コラーゲン性タンパク質であり、真皮の形成を機能に中心的な役割を果たす。線維芽細胞から分泌され、コラーゲンとヒアルロン酸の合成を高める。
　メタロプロテイナーゼインヒビターは（TIMP、Tissue Inhibitors of Metallo-Proteinases）、マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinase：MMP）の活性をコントロールする、内在性の阻害物質である。MMPは、Zincメタロプロテアーゼファミリーで、細胞から分泌される細胞外マトリックスの代謝を司る。現在、異なる阻害形式を有する４種のTIMP、TINP-1～4が知られており、組織によって、MMPの流入に応じて異なったレベルで発現する。TIMP-1と2とは、いずれも、多くのMMPの活性部位に結合し、それらの活性を不可逆的に阻害する。また、これら2つのTIMPは、種々の細胞に直接的に作用し、増殖促進活性を示す。
　SCP2は、石油、天然ガス、アルコール、廃糖蜜、農産物などを発酵原料として大量生産される微生物菌体または菌体からのタンパク抽出物をいう。「単細胞タンパク質」ともいい、酵母、細菌、糸状菌、藻類などのタンパク質に富んだ単細胞生物を殺菌し、乾燥した物をいうこともある。
　72kDa IV型コラゲナーゼはゼラチナーゼともいい、ゼラチナーゼのうち、Ａ酵素を72kDa IV型コラゲナーゼ（MMP-2）と呼ぶ。95kDaのＢ酵素は、MMP-9と呼ばれる。MMP-2は、触媒ドメインに挿入されたII型ファイブロネクチンドメインの３つのリピートを有しており、MMP-9と共にMMPsのゼラチナーゼグループに属する。MMP-2はコラーゲンI, IV, V, VII, X, XIV, ゲラチン(gelatin), エラスチン、ラミニン-1、ラミニン-5、ミエリン塩基性タンパク質(myelin basic protein)、MMP-1, MMP-9, MMP-13に対して、直接あるいは間接的な基質特異性を示す。
　β-2-ミクログロブリンは、組織適合抗原（クラスI）を構成する二本鎖のうちの軽鎖である。組織適合抗原の特異性を示す抗原性を持たない。
　Rho GTPase活性化タンパク質は、分子量2～3万のサブユニット構造を有していない一群のGタンパク質で、スーパーファミリーを構成している。このスーパーファミリーは、Ras, Rho, Rab, Arf, Ranの5つのグループに分類される。Rho GTPase活性化タンパク質は、このうちのRhoに属するタンパク質である。Rhoタンパク質は、アクチンフィラメントの再編成を介して、平滑筋の収縮や細胞質分裂、細胞運動、細胞形態を制御している。
　骨髄間質細胞とは、骨髄中に存在し、骨髄穿刺によって容易に採取することができ、かつ造血を支える細胞をいう。ここで、骨髄には、血液細胞及び血液細胞を支持する間質細胞という２つに大別される細胞が含まれているが、骨髄間質細胞は後者に含まれる。血液細胞は培養すると浮遊状態で増殖するが、骨髄間質細胞は壁に付着して増殖する。形状は間葉系細胞と同じであるが、骨髄中で細網構造をとる。通常の線維芽細胞と同様に培養ができる。もともと間葉系由来の間質細胞は、さまざまな細胞に分化する。骨髄間質細胞は、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞に分化誘導される。
　歯髄細胞とは、歯の神経に含まれる幹細胞の一種である。歯髄細胞は、歯という硬質の素材に保護されており、歯は紫外線や放射線を通さないために、遺伝子も傷つきにくいといわれている。
　不死化乳歯幹細胞とは、乳歯から得られた歯髄幹細胞を不死化した細胞であり、歯髄幹細胞は、歯の神経に含まれる幹細胞の１種である。歯は、硬質の素材からなり、歯髄を物理的に保護し、紫外線や放射線を通さないため、遺伝子も傷つきにくいといわれている。
　不死化幹細胞は、以下のように作製する。まず、脱落乳歯を、例えば、クロロヘキシジン、イソジン溶液その他の消毒薬で消毒する。次いで、動物の大腿骨をソールとする場合には、例えば、PBS等を満たしたシリンジに、その動物の大腿骨の髄空にきっちりと嵌る太さの注射針を選択して骨髄細胞押し出すようにして、取り出す。また、ブタの歯又はヒト脱落乳歯場合には、それぞれの歯冠部を分割し、歯科用リーマーにて歯髄組織を回収する。
　採取した骨髄間葉細胞又は歯髄組織を、基本培地、例えば、5～15％ウシ血清（以下、「CS」ということがある。）及び50～150ユニット/mLの抗生物質を含有するダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 以下、「DMEM」という。）に懸濁する。ついで、１～５mg/mLのコラゲナーゼ及び１～５mg/mLのディスパーゼを用いて、37℃で、0.5～２時間処理する。
　上記基本培地としては、上述した培地、例えば、DMEMにウシ胎仔血清を添加し、酵素処理の後、3～10分間の遠心操作（3,000～7,000回転／分）を行い、歯髄細胞を回収する。必要に応じて、セルストレーナーを用いて細胞の選別を行う。選別された細胞を、例えば、3～6mLの上記基本培地で再懸濁し、直径4～8cmの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。
　次いで、培養液、例えば、10％FCSを含有するDMEMを添加した後、5％CO2インキュベータにて、37℃で、例えば、２～３日ごとに培地を交換しながら、2週間程度培養する。この間に2～4回の継代を行う。サブコンフレントになったことを確認した後に、上記培養液を除去し、PBS等で細胞を1～数回洗浄する。培養液の除去及び細胞の洗浄に代えて、コロニーを形成した接着性の歯髄幹細胞を回収することもできる。接着性の歯髄幹細胞は、例えば、0.025～0.1％のトリプシンと0.3～1mMのEDTAにて、数分間、37℃で処理してディッシュから剥離させ、次いで細胞を回収する。
　歯髄幹細胞の場合には、酵素処理の後、３～10分間の遠心操作（3,000～7,000回転／分）を行い、歯髄細胞を回収する。必要に応じて、セルストレーナーを用いて細胞の選別を行う。選別された細胞を、例えば、3～6mLの上記基本培地で再懸濁し、直径4～8cmの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。
　次いで、培養液、例えば、10％FCSを含有するDMEMを添加して、上記と同様に所望の期間培養し、PBS等で細胞を1～数回洗浄して接着性細胞を得る。
　ラットの骨髄細胞を使用する場合には、ラットの大腿骨の髄腔から得た骨液(約30～100μL/大腿骨)を、約5～15％のウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン及びストレプトマイシン（和光純薬工業（株））を含むDMEMに入れ、5％CO2インキュベータ中にて、37℃で、２～４代予備培養を行い、所望の特徴を有する細胞を選択することが好ましい。
　例えば、骨液(約50μL/大腿骨)を、10％FBS、上述した濃度のペニシリン及びストレプトマイシンを含むDMEMに入れ、5％CO2インキュベータ中にて、37℃で、3代予備培養を行い、後述する選別工程において、スピンドル形状及び接着性等の特徴を有する細胞を選択する。
　以上のようにして、選別された接着性細胞（幹細胞）を得る。次いで、例えば、幹細胞を付着性細胞培養用ディッシュに播種し、5％CO2、37℃の条件で培養する。
　大腿骨から得たBMSCsを使用した場合には、スピンドル形状及び接着性等の特徴を有する細胞のみを選択して使用する。
　継代培養は、例えば、肉眼で観察してサブコンフレント又はコンフレントに達したときに、上述のように、トリプシンとEDTAとを用いて細胞を培養容器から剥離させて回収し、再度、培養液を入れた培養容器に播種する。
　ここで、サブコンフレントとは、培養容器中の細胞付着面の約70％に細胞が付着した状態をいう。例えば、継代培養を１～８回行い、選別された細胞を、必要な細胞数、例えば約1×107個/mLまで増殖させる。以上のように培養した後に、細胞を回収して液体窒素中にて保存する。様々なドナーから回収した細胞を歯髄幹細胞バンクの形態で保存することにしてもよい。
　不死化幹細胞を作製する場合には、上記のようにして得た幹細胞を初期培養して初期化培養細胞を得る。この初期培養細胞に、以下のようにして、hTERT、bmi-1、E6、E7を導入する。上記の遺伝子を組み込むためのプラスミドを調製し、これをシャトルベクター、例えば、pSuttle2に組み込んで、上記の遺伝子をクローニングする。このシャトルベクターで大腸菌を形質転換し、カナマイシン体性形質転換体を選択する。選択したカナマイシン体性形質転換体のプラスミドDNAを精製し、制限酵素部位を解析して組換え体を同定する。
　次に、制限酵素、例えば、PI-Sce I及びI-Cue Iを使用して発現カセットを上記のシャトルベクターから切り出し、これをアデノウイルスベクター、例えば、Adeno-X viral DNAにライゲーションする。得られたライゲーション産物をSwa Iで切断し、これを用いて大腸菌をトランスフォーメーションする。
　ここで、hTERTはテロメア修復酵素の遺伝子であり、bmi-1はポリコーム複合体を構成するたんぱく質の１つであるBmi-1の遺伝子である。ここで、Bmi-1は造血幹細胞の維持に必要であり、活性増強により造血幹細胞を増やすことができるという作用を有する。
　E6及びE7はHPV-16又はHPV-18のDNAの初期遺伝子である。また、Oct3/4はSox2と協調して標的遺伝子の転写を活性化する遺伝子である。Klf4（Kruppel型転写因子4）は細胞分裂と胚発生にかかわる遺伝子を調節し、消化器系の癌の癌抑制因子としてかかわっている。
　Sox2はSRY-related HMG box遺伝子ファミリーに属しており、機能の未分化性(多能性)維持に関与することが知られる遺伝子である。c-Mycは発癌遺伝子であり、c-Mycで誘導された腫瘍内で細胞の生存と死の両方を促進する遺伝子である。p16INK4aはがん細胞のcell cycleをcontrolするのに重要な役割を果たす遺伝子である。
　得られた形質転換体の中からアンピシリン体性形質転換体を選択する。上記の遺伝子が組み込まれた組換えアデノウイルスDNAを精製し、制限酵素部位を解析して組換え体を同定する。
　次いで、Pac Iで組換えアデノウイルスを消化し、これをHEK293細胞にトランスフェクトする。組換えアデノウイルスを増殖させ、これを集めてウイルスの力価を測定する。常法に従ってウイルスを精製し、標的細胞であるSHEDに感染させる。
　ウイルス感染後の細胞群を、常法に従ってFITCで染色し、フローサイトメーターを用いて、STRO-1陽性細胞を検出する。ここで、STRO-1は、骨髄における多分化能を有する間葉系幹細胞のマーカーの１つとして考えられており、細胞の不死化の指標となる。
　以上の手順によって、骨髄間質細胞、歯髄細胞、及び歯髄由来の不死化乳歯幹細胞を得ることができる。
　以上のようにして得られる骨髄間質細胞、歯髄細胞及び不死化乳歯歯髄細胞は、ラット、ブタ又はヒト乳歯由来のものを使用することが、これらの細胞を得るためのソースを入手しやすいこと、及び安定して上述した成長因子を産生する細胞を得られることから好ましい。そして、（ａ）の予備培養工程では、これらの細胞を、37℃培養することが好ましい。
　また、前記細胞選別工程で、スピンドル形状かつ紡錘型の接着性を有する細胞を選別することが好ましい。さらに、前記培養上清を、培養開始後44～52時間の前記培養上清を集めることが、スピンドル形状かつ紡錘型で、接着性を有する細胞の含有量がおおいことから好ましい。また、培養開始後４８時間後の培養上清を集めることが、より高い接着性を有する細胞が得られることからさらに好ましい。
　前記培養上清は、少なくとも、上記選別された細胞が産生した、Ｉ型コラーゲン（Col-I）、フィブロネクチン、デコリン、血管内皮増殖因子（VEGF）、及び骨シアロタンパク質（BSP）を含むことが、金属インプラント材と骨との一体化が促進されることから好ましく、インスリン様成長因子結合タンパク質7、フォリスタチン関連タンパク質、メタロプロテイナーゼインヒビターI、組織プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、アクチン、及びスルフヒドリルオキシダーゼI、インスリン様成長因子（IGF）-1、幹細胞増殖因子（HGF）、及びTGF-βからなる軍から選ばれる少なくとも１種以上のタンパク質をさらに含むことが、金属インプラント材と骨との一体化がさらに促進されるために好ましい。
　次に、沈殿物調整工程において、以上のようにして得られた培養上清を遠心し、次いでエタノール沈殿処理を行って沈殿物を調製する。例えば、1,000～2,000rpmで３～10分間、2,500～3,500rpmで１～５分間、0～10℃にて遠心し、不要な細胞を除去する。次いで、遠心上清の約8～12倍容のエタノールを加えて、－5～15℃で30～90分間インキュベートし、2～6℃にて、10,000～20,000rpmで10～20分間遠心して上清を除き、沈殿物を得る。この後、前記沈殿物調製工程で得られた沈殿物を凍結乾燥させる。例えば、80～95％の冷エタノールに再懸濁し、2～6℃にて、10,000～20,000rpmで10～20分間遠心して上清を除き、沈殿物を－60～90℃にて凍結させて凍結乾燥する。
　以上の方法によって、上記の細胞の産生物を得ることができる。得られた上記細胞産生物は、－20～－40℃で保存することが活性保持の観点から好ましい。
　次いで、上記のようにして得られた凍結乾燥品を使用して、以下のようにして高機能インプラントを製造する。具体的には、（ｆ）インプラント材の表面を有機溶媒で洗浄し、洗浄インプラント材とする洗浄工程と；（ｇ）前記洗浄インプラント材を、所定の組成を有する石灰化溶液中に所定の温度で3～6時間浸漬し、浸漬インプラント材とする浸漬工程と；（ｈ）前記浸漬インプラント材を所定の濃度の細胞産生物を含有する溶液で処理する処理工程と；を備える方法によって作成する。
　ここで、前記インプラント材は、チタン、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、及びβ‐TCPからなる群から選ばれるいずれかの材料で形成されていることが、生体組織への適合性及び加工性に優れ、入手の容易さの面から好ましい。これらのなかでも、チタン（Ti）を使用することが、幹細胞培養上清による加工が容易であり、効率も高いためにさらに好ましい。
　また、上記の有機溶媒として、アセトンと60～80％（v/v）エタノールを使用することが、インプラント材表面の洗浄効果が高いために好ましい。また、エタノール濃度を60～80％（v/v）としたのは、60％未満では洗浄力が弱く、80％を越えてもそれ以上の洗浄効果が得られないからである。好ましくは、約70％のエタノールを使用する。
　ついで、上記のように洗浄したインプラント材を、所定の組成を有する石灰化溶液中に３～６時間浸漬する。上記第１石灰化溶液の組成は、100～150mM NaCl, 2.5～3.5mM CaCl2・H2O, 1.5～2.5mM K2HPO4, 25～75mM Tris-HCl（pH 7.2～7.6）とすることが石灰化の効率の面から好ましく、136.8mM NaCl, 3.10mM CaCl2・H2O, 1.86mM K2HPO4, 50mM Tris-HCl（pH 7.4）とすることが、石灰化の効率が高いために好ましい。
　ここで、浸漬時間を3～6時間とするのは、3時間未満では石灰化が十分でないという問題があり、6時間を越えてもそれ以上の効果が得られないからである。浸漬時間を4時間とすることが、十分な石灰化が行われるために好ましい。
　また、浸漬は、36～38℃で行うことが、後述する第２石灰化溶液に浸漬する事前準備とするために好ましく、37℃で行うことがさらに好ましい。
　上記のように浸漬処理を行ったインプラント材を、所定の濃度の培養物を含有する第２石灰化溶液で所定の時間インキュベーション処理することにより、Col-I、BSP、VEGFその他の成長因子を付着させる。上記第2石灰化溶液は、130～160 mMKNO3, 1～2mM Ca(NO3)2・4H2O, 0.5～1.5mM K2HPO4（pH 7.0～7.8）の組成とすることが、これらのタンパク質の付着効率が高いことから好ましい。
　具体的には、上記のようにして得られた細胞培養物（細胞産生物）の凍結乾燥品を、5～20mg/mLで含有する142.8mM KNO3, 1.5mM Ca(NO3)2・4H2O, 0.9mM K2HPO4（pH 7.4）に、室温で、約2～5日間インキュベーション処理することが、インプラント表面に十分量の上述した成長因子を付着させることができるために好ましい。インキュベーション時間は、3日間とすることが、高機能インプラントの作成効率の点からさらに好ましい。
　ここで、水溶液の濃度が5mg/mL未満では付着する成長因子の量が不十分で歯槽骨との接着性が弱いという問題があり、一方、20mg/mLを越えてもそれ以上高い接着性が得られないからである。10mg/mLの濃度の水溶液で処理することが、歯槽骨との十分な接着が確保できることから、さらに好ましい。
　以上のようにして、その表面に、少なくとも、Col-I、骨シアロタンパク質（BSP）、及びVEGFを保有している高機能インプラントを得ることができる。上記インプラントの表面に、IGF-1、HGF、及びTGF-βをさらに保有する高機能インプラントの場合には、インプラントと骨との一体化が短時間に進み、安定化効果が一層高い。
　以下に実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に何ら制限されるものではない。
（実施例１）
（１）材料と方法
（１－１）動物
　６週齢の雌のSDラット（n = 15、体重200－230g）を、日本SLC（株）より購入した。全ての実験は、名古屋大学医学部の実験ガイドラインに従って行った。これらの動物は、12時間の明暗サイクル下に、室温にて飼育した。飼料及び水は自由に摂取させた。
（１－２）細胞培養
　ラットのBMSCsを、ラットの大腿骨の髄腔から得た。骨髄液（50μL/大腿骨）を集めて、10％ウシ胎児血清（FBS、和光純薬工業（株））、ペニシリン及びストレプトマイシン（和光純薬工業（株））を含むダルベッコ変法MEM（DEMEM、シグマ－アルドリッチ社製）中にて、5％CO2インキュベータ中にて、37℃で3代予備培養した。2日ごとに培地を交換した。スピンドル形状及び接着性等の特徴を有する細胞のみを使用した。
（１－３）CM調製
　培養したBMSCを70～80％コンフレントになるまで増殖させ、暖めたリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄し、ペニシリン及びストレプトマイシンを含む無血清DMEMを加えた。48時間後の培養上清（以下、「CM」ということがある。）を集めて1,500 rpmで5分間遠心し、その後、3,000rpmで３分間遠心して他の細胞を除去した。5mLのCMを45mLの100％エタノールと混合し、－20℃にて１時間インキュベートした。この混合物を、４℃、15,000rpmにて15分間遠心し、上清を除いた。CMの沈殿物を冷90％エタノール（－20℃）に再度懸濁し、4℃、15,000rpmにて15分間遠心した。最終沈殿物を－80℃にて凍結させて凍結乾燥させ、－30℃で使用まで保存した。細胞と接触させていない無血清DMEMを対照として使用した。
（１－４）CM固定Tiインプラントスクリューの調製
　Ti インプラントスクリュー(全長5mm、スレッド径2mm、及び1mm ピッチ)は、西島メディカル（株））より提供を受けた。これらのTiインプラントは、先の研究で得られた条件で製造された。
　Tiインプラントの表面は、PBSのみ、DMEMのみ又はCMで処理し、それぞれ、PBS処理群（陰性対照群）、DMEM処理群（陽性対照群）及びCM/DMEM処理群（試験群）とした。
　各処理群は、以下のようにして調製した。
　まず、Tiインプラントをアセトンと70％エタノールで洗浄し、第１石灰化溶液[136.8mM NaCl, 3.10mM CaCl2・H2O, 1.86mM K2HPO4を含有する50mM Tris-HCl（pH 7.4）（和光純薬工業（株）製)）中で、37℃にて、4時間浸漬した。
　この浸漬処理と並行して、CM/DMEM（1mg/mL)、DMEM（3mL)、又はPBS（3mL）をそれぞれ含有する3種類の第2石灰化溶液[142.8mM KNO3, 1.5mM Ca(NO3)2・4H2O, 0.9mM K2HPO4(和光純薬工業（株）製)]を調製した。
　上記3種類の石灰化溶液3mL中に、洗浄済の各Tiインプラント材5本を浸漬し、37℃にて3日間、インキュベートした。インキュベーション終了後、各Tiインプラント材を取り出した。
　次いで、第2石灰化溶液中でインキュベート開始直後及び終了後の各Tiインプラント材表面を、走査型電子顕微鏡（日本電子（株）製）で観察したマイクログラフを図1(A)～(F)に示す。図1(A)～(C)は3,000倍、(D)～(F)は15,000倍で、各々撮影した。
　(A)及び(D)は、Tiインプラントの表面を機械研磨したときの典型的なトポグラフィーを示した。(C)及び(E)は雪景色様の微細構造を示した。(F)では、Tiインプラント表面の雪景色様の微細構造及び微小球（ミクロスフェア）が観察された。微小球を矢印で示した。図中に示した線分は、(A)～(C)が10μm、(D)～(F)が2μmである。
（２）細胞接着分析
　Tiディスク（10×10mm；（株）オーファ製）を、Tiインプラント上への固定と同様の手法によって、PBS、DMEM、又はCMのいずれかで処理した。ラットのBMSCs（1.0×106個）を上記のように処理したTiディスク上に播種し（Ｎ＝３）、10％FBS及び１％ペニシリン‐ストレプトマイシン含有DMEMを用いて、37℃にて、5％CO2存在下に24時間培養した。
　接着したラットのBMSCsを、0.05％トリプシン‐EDTA（シグマ-アルドリッチ社製）と10分間インキュベートし、Tiディスクから剥離させた。このTiディスクをSEMで観察し、すべてのラットのBMCsが剥離されたことを確認した。剥離された細胞を、血球計算盤（サンリードガラス（有）製）を用いて計算した。3回実験を繰り返し、有意水準5％（p＜0.05）にて、Scheff検定を用いて、一元配置分散分析（ANOVA）により、統計的な有意差を分析した。結果を図２に示す。
　PBS処理群及びDMEM処理群の間、及びPBS処理群及びCM処理群との間には、それぞれ有意差が見られた(*：p＜0.05, ANOVA検定)。
（３）走査型電子顕微鏡（SEM）によるTiインプラント表面の変化の観察
　以上より、PBSで表面を処理したTiインプラントは、図１(A)及び(D)に示すような機械研磨の典型的なトポグラフィーを示した。DMEMを固定化したTiインプラントは、雪景色様の微細構造を広く、不規則にディスプレイしていた（図1(B)及び(E)）。CMでコートしたTiインプラントの表面は、雪景色様の微細構造上にミクロスフェアをディスプレイしていた（図1(C)及び(F)の矢印参照）。これらの結果は、CM又はDMEMの固定化成分により、インプラント表面のトポグラフィーが変化することを示唆した。
（４）LC/MS/MSによるTiインプラント表面上のタンパクの同定
　上記で得たCM/DMEM処理群のTiインプラント材の表面から、80％アセトニトリルを用いてタンパク質を剥離させた。剥離させたタンパク質は、凍結乾燥を行って粉末化した。粉末化したタンパク質1mgを100μLの泳動用サンプルバッファーで希釈し、希釈したバッファー10μLを、12％アクリルアミドゲルのゲルを使用したゲル電気泳動に供した。泳動後、CBB（コマジーブリリアントブルー）溶液、又はSilver Stain Kit(Therimo社製)を用いてそれぞれ染色を行なった。染色後、メスを用いてゲルを切り出した。
　上記のようにして切り出したゲルを、最初に100μLの30％(v/v)アセトニトリルを含む25mM NH4HCO3中で20分間２回洗浄して脱染色し、その後、CVE-3100（東京理化機械（株）製）で乾燥させた。タンパク質のインゲル消化（in-gel digestion）は、20μg/mLのシーケンスグレードトリプシン（プロメガ社製）を含む50mMのヨードアセトアミド（和光純薬工業（株）製）/100mM NH4HCO3(pH 7.8)を100μL用いて、37℃にて1時間戻し、100μLの25mM NH4HCO3を加えて、37℃にて終夜インキュベートした。ペプチドを0.1％のTFAを含有する60％アセトニトリル中で、室温にて20分間抽出し、ペプチドサンプルをCVE-3100中で乾燥させた。
　ペプチドマスフィンガープリンティング(PMF)を、Paradigm MS4-LCQ Advantage (AMR社製)を用いて行った。得られたペプチドマススペクトルを、the Mascot search engine (www.matrixscience.com)を使用するSwiss-Prot protein knowledgebase （哺乳類のタンパク質に限定されている）へのクエリー（検索要求）に使用するペプチドマスリストの生成に使用した。
　検索パラメータは、1 missed trypsin cleavageのトレランス、質量トレランス6100 ppm及びメチオニン残基の酸化を許容するように設定した。クエリーが、含有される4以上のペプチドとマッチし、Mascot search engineによって生成された統計的に有意なMowse（分子量サーチ；molecular weight search）スコアと一致する質量を有するときに、同定されたタンパク質を承認した。
　次に、Tiインプラント上に固定化されたタンパク質と培養上清（CM）中のこれらを、LC/MS/MSで検出した。約2,000種のタンパク質が培養上清中で検出されたが、この数は、Tiインプラントの表面上とほぼ同じであった。Tiインプラントの表面上で検出された全てのタンパク質は、いずれもCM中で検出された。細胞外マトリックスは、タンパク質、シグナル伝達、タンパク合成及びプロセッシング、並びに成長因子タンパク質を含むため、下記に示すフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてタンパク質の検出を行った。
（ALP遺伝子増幅用）
　フォワードプライマー　GCTGTGAAGGGCTTCTTGTC・・・配列番号１
　リバースプライマー　CGCCTATCAGCTAATGCACA・・・配列番号２
（OCN遺伝子増幅用）
　フォワードプライマー　TGAGGACCCTCTCTCTGCTC・・・配列番号３
　リバースプライマー　GAGCTCACACACCTCCCTGT・・・配列番号４
（OPN遺伝子増幅用）
　フォワードプライマー　AGGTCCTCATCTGTGGCATC・・・配列番号５
　リバースプライマー　AGACTGGCAGTGGTTTGCTT・・・配列番号６
（BSP遺伝子増幅用）
　フォワードプライマー　TTCTCGAGAAAAATTTCCA・・・配列番号７
　リバースプライマー　TCACTGGTGGTAGTAATAAT・・・配列番号８
（Col-I遺伝子増幅用）
　フォワードプライマー　CGATGCCATTTTCTCCCTTA・・・配列番号９
　リバースプライマー　CTCTGGTACCGCTGGAGAAG・・・配列番号10
（GAPDH遺伝子増幅用）
　フォワードプライマー　ATGACTCTACCCACGGCAAG・・・配列番号11
　リバースプライマー　TTCAGCTCTGGGATGACCTT・・・配列番号12
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
   ALP：アルカリフォスファターゼ; OCN：オステオカルシン; 
  OPN：オステオポンチン;BSP：骨シアロタンパク質;Col-I：I型コラーゲン
　骨関連タンパク質であるI型コラーゲン、骨シアロタンパク質２、デコリン、オステオポンチン、オステオカルシン、フィブロネクチン、及び血管上皮成長因子A（VEGF A）が検出された。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（５）インビトロにおけるラットBMSCsのRNA分析
　ラットBMSCsを、PBS、DMEM又はCMで処理したTiディスク上で培養した。固定化及び培養方法は、細胞接着分析を行ったのと同じ方法である。BMSCsを、１日、７日、14日間培養した。各ディスク上で培養したラットBMSCsからの総RNAを、TRIZOL試薬（インビトロジェン　ライフテクノロジー社製）を用いて、製造元のプロトコルにしたがって行った。cDNAを、１μgの総RNAから、10ｘ反応バッファー、5mM dNTP混合物、1U/μLのRNaseインヒビター、0.25U/μLの逆転者酵素(M-MLV逆転写酵素、インビトロジェン社)、及び0.125μMのランダムプライマー(タカラバイオ（株）)を含む20μLの反応液中で合成した。
　sq-PCRのために、PCR Thermal Cycler SP (タカラバイオ（株）製)中で、95℃で30秒、45～60℃で30秒、及び72℃で30秒の反応条件で25～35サイクル行った。
　ラットのグリセルアルデヒド-3-ホスフェート・デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プライマーを、内部標準として使用した。in vitro遺伝子発現分析において、移植された培養細胞中のGAPDHに対するmRNAの発現レベル（％）を、Scion Image picture-imaging software (Scion社製)を使用して測定した。合成されたcDNAを、表1に示す特異的プライマーを用いた次のPCR増幅用の鋳型として使用した。すべての実験は3回繰り返し、データを有意差レベル5％で、Scheffe検定を用いて、一元配置分散分析（ANOVA）により解析した。
　結果をOCN,OPN及びCol Iの遺伝子の発現パターン（図3(A)～(C)参照）及びそれを定量化したグラフ（図3(D)～(F)参照）として図3に示した。
（６）Qdot（登録商標）655 ITK carboxyl quantum dots (QDs)によるCMのラベリング
　QDs (インビトロジェン・モレキュラー・プローブス社製)を用いたCMのラベリングは、製造元の指示書に従って行った。簡単に言えば、石灰化溶液で処理したTi検体 を、25μLの8μM QDs、1mg/mLのCM、1mLの10mMのホウ酸バッファー（pH 7.4）、及び5.7μLの10mg/mL N-エチル-N’-ジメチルアミノプロピル-カルボジイミド（架橋試薬；シグマ‐アルドリッチ社製)の混合物に添加し、室温でそっと1時間攪拌した。血清不添加のDMEM又はPBSのQDラベリングを、対照として使用した。結果を図4に示す。
　図中、Ａ、Ｂ、及びＣはそれぞれ試験開始前のTiインプラントの画像を示す。A1は試験開始１日後、A7は７日後、A14は14日後、A28は28日後の画像を示す。Ｂ及びＣについても同様である。
　PBSで処理したTiインプラントでは、観察期間中を通して、その周囲に蛍光は検出されなかった。これに対し、DMEM又はCMで処理したTiインプラントでは、その周囲に傾向が検出された。
　以上から、DMEM又はCMで処理したTiインプラントでは生体分子の局在化が起きていることが判明した。
（実施例２）不死化乳歯幹細胞作出用ウイルスの作製
（１）プラスミド抽出用試薬
（１－１）試薬等
　カナマイシン（Kan）、アンピシリン（Amp）、LB液体培地及びLB寒天培地、グリコーゲン、アガロース、滅菌水、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム及びRNase Aを使用した。50mg/mLのカナマイシン（Kan）及びアンピシリン（Amp）を調製し、ストック溶液として－20℃で保存した。グリコーゲンは20mg/mLに調製した。10mg/mLのRNase Aを調製し－20℃で保存した。10M（飽和）酢酸アンモニウム（NH4OAc）、3Mの酢酸ナトリウム（NaOAc；pH5.2）を調製した。
（１－２）制限酵素等
　大腸菌コンピテントセル（Supercharge EZ10 Electrocompetent Cells、製品コード 636756）、Swa I（製品コード 1111A、Smi Iが同等品）、Xho I（製品コード 1094A）、T4 DNA Ligase（製品コード 2011A）、NucleoBond Xtra Midi（製品コード 740410.10/.50/.100）、NucleoSpin Plasmid（製品コード 740588 10/50/250）は、いずれもタカラバイオ（株）より購入した。Pac IはNew England Biolabs社より購入した。
（１－３）バッファー等
　1×TE Buffer（1mMのEDTAを含む10mM Tris-HCl[pH8.0]）、100mM Tris-HCl（pH8.0）で飽和したフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1、以下、「PCI混液」という。）を調製した。エタノールは、100％及び70％で使用した。ミニスケールでの組換えで使用するpAdeno-X プラスミドDNAの精製用に、以下のバッファー1～4を調製した。
　バッファー1：10mMのEDTA及び50mMのグルコースを含む25mMのTris-HCl（pH8.0）（オートクレーブ後、4℃で保存）
　バッファー2：1％SDSを含む0.2M NaOH（使用直前に用時調製、密封し、室温保存）
　バッファー3：5M KOAc（オートクレーブ後、4℃で保存）
　バッファー4：1mMのEDTA、20μg/mLのRNaseを含む10mMのTris-HCl（pH8.0）（使用直前にRNaseを添加し、－20℃で保存）
（２）アデノウイルス精製及びβ-galアッセイ用試薬
　ヒト５型アデノウイルスで形質転換したヒトHEK293細胞（ATCC #CRL1573）を使用した。HEK293細胞は完全培地で培養した。完全培地の組成は、100 unit/mLのペニシリンGナトリウムと100μg/mLのストレプトマイシン、4mMのL-グルタミン及び10％FBSを添加したDMEM（基本培地）とした。ペニシリンGナトリウム溶液は10,000 units/mL、硫酸ストレプトマイシン溶液は10,000μg/mLで調製し、ストック溶液として保存した。
　培養には、60mmプレート、100mmプレート、6－ウェルプレート、T75及びT175フラスコを使用した。
　トリプシン-EDTA（製品コード CC-5012）はタカラバイオ（株）より購入した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS、Ca2＋とMg2＋不含）及びダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS、Ca2＋とMg2＋含有）を調製した。また、0.33％のニュートラルレッド染色液、0.4％トリパンブルー染色液を使用した。
　β-galアッセイには、X-Gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside [25mg/mL]）ジメチルホルムアミド（DMF）溶液は－20℃で遮光保存した。Luminescent β-gal Detection Kit II（製品コード 631712）を使用した。
（３）予備試験
（３－１）lacZ を含む組換えアデノウイルス（pAdeno-X-lacZ）の構築
　10mLの上述した完全培地に、解凍後、DMSOを除去したHEK293細胞を再懸濁し、全量を100mmの培養プレートに移した。HEK293細胞が付着した後に培養液を除去し、細胞を滅菌PBSで1度洗浄し、1mLのトリプシン-EDTA溶液を加えて約2分間処理した。
　次に、10mLの完全培地を加えてトリプシンの反応を止め、穏やかに懸濁した。バイアブルカウントを行って、培養液10mLを入れた100mmのプレートに105個の細胞を移し、均一に拡げた。
　pShuttle2-lacZ（Adeno-X Expression System 1に含まれている陽性対照ベクター）とキットに含まれているAdeno-X Viral DNA（PI-Sce I及びI-Ceu I digested）とを使用し、キットに添付されているプロトコルに従って、lacZを含む組換えアデノウイルスを構築した。標的細胞であるSHEDに感染させ、β-ガラクトシダーゼの発現をアッセイし、ベクターが構築されていることを確認した。
（３－２）組換えpShuttle2プラスミドの構築
　組換えpShuttle2 Vector（以下、「rpShuttle2 Vector」という。）の構築前に、キットに含まれているpShuttle2 Vector及びpShuttle2-lacZ VectorでDH5α大腸菌を形質転換した。50μg/mLのカナマイシンを含有するLB寒天プレート（以下、「LB/Kan」という。）上で形質転換体を選択し、単一コロニーからとった菌体を新しいLB/Kanに画線し、37℃で一晩インキュベートした。
　次いで、hTERT、bmi-1、E6、E7を、pShuttle2へ以下の手順でクローニングした。これらの遺伝子に適した制限酵素でpShuttle2 Vectorを切断した。
　次いで、上記のキットに添付されているpShuttle2 Vector Information Packet（PT3416-5）を参照し、挿入するDNAに合致するマルチクローニングサイトを決定した。制限酵素処理済みの上記プラスミドをアルカリホスファターゼで処理して精製した。
　常法に従って、標的DNA断片を調製し精製した。上記の制限酵素で消化したベクターと上記の遺伝子断片とをライゲーションし、DH5α細胞（コンピテント細胞）を、ライゲーション産物で形質転換した。上記コンピテント細胞の一部をとり、キットに含まれている対照ベクターpShuttle2-lacZ Vectorで形質転換して陽性対照とした。
　形質転換した大腸菌を含む混合液を、LB/Kan寒天プレートに接種し、カナマイシン耐性（Kanr）の形質転換体（コロニー）を選択した。5～10個のKan耐性クローンを選択し、少量の液体培地に接種して増幅した。これらのクローンがrpShuttle2 Vectorを有していることを確認した後に、一晩インキュベートした。その後、市販のシリカ吸着カラムを用いて、常法に従い、構築されたプラスミドDNAを精製した。
　このプラスミドDNAを制限酵素で処理して、１％アガロースゲル電気泳動を行い、目的の組換えプラスミドを同定した。シーケンシングによって、挿入した断片の方向と挿入部位を確認し、ポジティブクローンを同定した。
　組換えpShuttle2プラスミドDNA（以下、「rpShuttle2プラスミドDNA」という。）をターゲット細胞に直接にトランスフェクトし、ウエスタンブロットを行って目的タンパク質の発現を予備的にチェックした。
（３－３）rpShuttle2プラスミドDNAのPI-Sce I/I-Ceu I二重消化
　上記のようにして作製したrpShuttle2プラスミドDNAから、導入した遺伝子の発現カセットをPI-Sce I及びI-Ceu Iで切り出した。キットに添付されたプロトコルに記載されたin vitroライゲーション法に従って、切り出した発現カセットをAdeno-X Viral DNAに組み込んだ。rpShuttle2プラスミドDNAのPI-Sce I/I-Ceu I二重消化液を30μL調製し、下記の表1に記載した試薬を1.5mLの滅菌済みマイクロ遠心チューブに入れて混合した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　次いで、十分に混和した後にマイクロ遠心チューブに入れて軽く遠心し、その後、37℃にて3時間インキュベートし、1kbラダー（DNA サイズマーカー）と共に上記二重消化後の反応液（5μL）を1％アガロース/EtBrゲルで泳動した。
（３－４）フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出
　遠心チューブに、上述した二重消化液の残り（25μL）に、70μLの1×TE Buffer（pH8.0）と100μLのPCI混液とを添加し、ボルテックスで十分に撹拌した。次いで、微量遠心機を用いて、4℃にて14,000rpmで5分間遠心し、水層を清浄な1.5mLのマイクロ遠心チューブに移した。ここに、400μLの95％エタノール、25μLの10Mの酢酸アンモニウム、及び1μLのグリコーゲン（20mg/mL）を添加し、ボルテックスで十分に撹拌した。
　次いで、4℃にて14,000rpmで5分間遠心し、上清を吸引除去し、ペレットを得た。このペレットに300μLの70％エタノールを加え、室温にて14,000 rpmで2分間遠心した。上清を注意深く吸引して除去し、ペレットを室温にておよそ15分間風乾した。ペレットが乾燥した後に、これを10μLの滅菌した1×TE Buffer（pH8.0）に溶解し、使用するまで－20℃にて保存した。
（４）組換えAdeno-X プラスミドDNAの構築
（４－１）Adeno-X ウイルスゲノムへの発現カセットのサブクローニング
　下記の表４に示す試薬を、順番通りに1.5mLの滅菌済マイクロ遠心チューブに入れ、穏やかに混和し、軽く遠心した後に、16℃にて一晩インキュベートした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　各サンプルに、90μLの1×TEバッファー（pH8.0）と100μLのPCI混液とを加えて、ボルテックスで穏やかに撹拌した。4℃にて14,000rpmで5分間遠心し、水層を清浄な1.5mLのマイクロ遠心チューブに移し、ここに400μLの95％エタノール、25μLの10M 酢酸アンモニウム、及び1μLのグリコーゲン（20mg/mL）を加えてボルテックスで穏やかに撹拌した。
　4℃にて５分間、14,000rpmで遠心し、上清を吸引により除去してペレットを得た。以下のエタノール沈殿操作は、上記（３－４）と同様に行った。
　ペレットが乾燥した後に、これを15μLの滅菌脱イオン水に溶解した。
（４－２）組換えAdeno-X プラスミドDNAのSwa I消化
　下記表５に示す消化液を調製し、遠心チューブに入れた各サンプルに加えて、2時間、25℃にて、インキュベートした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　各サンプルに、80μLの1×TE Buffer（pH8.0）と100μLのPCI混液とを加え、ボルテックスで穏やかに撹拌した。マイクロ遠心チューブ、4℃にて5分間、14,000rpmで遠心した。以下のエタノール沈殿の操作は、上記（３－４）と同様に行い、ペレットの溶解液は使用まで－20℃にて保存した。
（４－３）組換えAdeno-X プラスミドDNAによる大腸菌の形質転換の確認
　電気的にコンピテントにした大腸菌を、Supercharge EZ10 Electrocompetent Cell（製品コード 636756）を使用して、上記（４－２）で得たSwa I消化産物で形質転換した。
　形質転換混合液を、LB培地にアンピシリン（終濃度100μg/mL）を加えた寒天プレート（以下、「LB/Amp寒天プレート」という。）に接種し、37℃で一晩インキュベートして、アンピシリン耐性（Ampr）形質転換体を選択した。約106個のコロニーを得た。得られたコロニーを、製品に付属のAdeno-X System PCR Screening Primer Setでチェックした。
　5mLの新鮮なLB/Amp液体培地に単一のコロニーからの菌体を接種し、一晩培養した。翌日、後述するミニスケール法に従って、Adeno-X プラスミドDNAを精製した。
（４－４）組換えAdeno-X プラスミドDNAのミニスケール調製
　対数増殖にある培養液5mLを、14,000rpmで30秒間遠心し、上清を除去した。ペレットを再度10,000rpmで1分間遠心し、マイクロピペットを用いて、上清を除去した。
　ここに、150μLの上記バッファー1を加えて穏やかにピペッティングし、再懸濁した。この細胞懸濁液に、150μLのバッファー2を添加し、穏やかに転倒混和し、氷上に5分間放置した。冷却した細胞懸濁液に、150μLのバッファー3を加えて、再度転倒混和し、氷上に5分間放置した。
　この細胞懸濁液を、4℃にて14,000rpmで5分間遠心し、透明な上清を清浄な1.5mLの遠心チューブに移した。この上清に、450μLのPCI混液を添加し、転倒混和して撹拌した。その後、4℃にて14,000rpmで5分間遠心し、水層を清浄な1.5mLのマイクロ遠心チューブに移した。
　以下のエタノール沈殿の操作は、上記（４－１）と同様に操作を行い、ペレットの溶解液は、使用まで－20℃にて保存した。目的のrDNAは、後述する制限酵素による解析及びPCRにより同定した。
（５）得られたrAdeno-X プラスミドDNAの制限酵素部位解析
　PI-Sce I及びI-Ceu Iを用いて解析を行った。下記の表６に示す試薬を、1.5mLの滅菌済みマイクロ遠心チューブに入れ、30μLのPI-Sce I/I-Ceu I二重消化反応液を加えて、十分に撹拌し、軽く回転させて内容物を集めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　37℃にて３時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。この処理後の反応液を1％アガロース/EtBrゲルで泳動し、培養液を得た。
（６）組換えアデノウイルスの産生
（６－１）HEK293細胞トランスフェクト用rAdeno-X プラスミドDNAの調製
　下記表７に示す試薬等を、1.5mLの滅菌済み遠心チューブに入れて混合し、微量遠心機で軽く遠心した。その後、37℃にて２時間、インキュベートし、rAdeno-X プラスミドDNAのPac I制限酵素処理を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　60μLの1×TE Buffer（pH8.0）と、100μLのPCI混液とを添加し、ボルテックスで穏やかに撹拌し、微量遠心機で、4℃にて5分間、14,000rpmで遠心した。水層を、清浄な1.5mLの滅菌済み遠心チューブに注意深く移した。
　以下のエタノール沈殿の操作は、上記（３－４）と同様に操作を行い、ペレットの溶解液は、使用まで－20℃にて保存した。
（６－２）Pac I消化Adeno-X プラスミドDNAのHEK293細胞へのトランスフェクション
　上記プラスミドDNAのトランスフェクションの24時間前に、60mmの培養プレートあたりの細胞数が1～2×106（およそ100 cells/mm2）になるよう、HEK293細胞を接種し、37℃、5％CO2存在下でインキュベートした。
　各培養プレートに、Pac I消化した10μLのAdeno-X プラスミドDNAをトランスフェクトし、標準的なトランスフェクション法（CalPhos Mammalian Transfection Kit 製品コード 631312）に従って、HEK293細胞にAdeno-X DNAを導入した。トランスフェクションの翌日から、CPE（細胞変性効果）が起きているかどうかを確認した。
　1週間後に、培養プレートの底面や側面に付着している細胞を穏やかに撹拌して遊離させた。得られた細胞懸濁液を15mLの滅菌済みの円錐遠心チューブに移し、室温にて5分間、1,500×gで遠心した。
　得られた沈殿を、500μLの滅菌PBSに懸濁した。ドライアイス/エタノール中で凍結させ、37℃の恒温槽で融解させるという凍結融解操作を３回繰り返して、細胞を十分に融解させたライセートを得た。次いで、軽く遠心して浮遊物を除き、上清を滅菌した別のチューブに移して、直ちに使用した。直ちに使用しない分は、－20℃で保存した。
　60mmプレートの培養細胞に250μLの上記ライセートを加えて、培養を続けた。なお、Adeno-X Rapid Titer Kit（製品コード 631028）に含まれる抗Hexon 抗体を用いて、このキットの取扱説明書（PT3651-1）に従い、アデノウイルスの力価を測定した。
（６－３）高力価ウイルス調製のためのウイルスの増幅
　この力価測定を始める約24時間前に、HEK293細胞をT75フラスコに接種し、37℃、5％CO2存在下で一夜培養し、50～70％コンフルエントになっていることを確認した。
　翌日、ウイルスを含む新しい培地と交換し、MOI＝10で感染させた。37℃、5％CO2存在下で90分間培養した後にフラスコを取り出し、10mLの培地を加えた。
　37℃、5％CO2存在下で3～4日間培養し、CPEを確認した。50％の細胞が剥がれたところで、上記と同様にして遊離細胞懸濁液とし、15mLの滅菌済円錐遠心チューブに移した。上記と同様の凍結融解操作を行い、細胞を融解させた。Adeno-X Rapid Titer Kit（製品コード 631028）を使用し、107PFU/mLの力価を得た。
　ウェスタンブロッティングを行い、パッケージングされたアデノウイルスゲノムが、目的遺伝子に特異的な転写単位のコピーを、機能する形で持っているかを確認した。
（７）標的細胞へのアデノウイルス感染
（７－１）標的細胞への感染
　感染の24時間前に6－ウェルプレートに１×106個のSHEDを接種した。接種の翌日に培地を取り除き、ウイルスを含む1.0mLの培地を各プレートの中心に添加した。この溶液をSHEDが形成した単層全体に均一に広げた。
　37℃、5％CO2存在下で４時間培養し、ウイルスをSHEDに感染させた。次いで、新鮮な培地を添加し、さらに、37℃、5％CO2存在下で培養した。感染24時間後～48時間後にかけて導入遺伝子の発現を経時的に解析した。
（７－２）感染細胞のβ--ガラクトシダーゼ発現の解析
　Adeno-X-lacZを感染させた接着性細胞におけるβ--ガラクトシダーゼの発現は、Luminescent β-galDetection Kit II（製品コード 631712、クロンテック社）を使用してアッセイした。
（実施例３）不死化乳歯幹細胞の作製
（１）脱落乳歯歯髄細胞の調製
　10歳の健常男児から得られた脱落乳歯を使用した。この脱落乳歯をイソジン溶液で消毒した後、歯科用ダイヤモンドポイントを用いて、歯冠を水平方向に切断し、歯科用リーマーを用いて歯髄組織を回収した。得られた歯髄組織を、3mg/mLのＩ型コラゲナーゼ及び4mg/mLのディスパーゼの溶液中で37℃にて1時間消化した。ついで、この溶液を70mmの細胞ストレーナ（Falcon社製）を用いて濾過した。
　濾別した細胞を、4mLの上記培地に再懸濁し、直径6cmの付着性細胞培養用ディッシュに播種した。10％FCSを含有するDMEMをこのディッシュに添加し、5％CO2、37℃に調整したインキュベータにて２週間程度培養した。コロニーを形成した接着性細胞（歯髄幹細胞）を、0.05％トリプシン・EDTAにて5分間、37℃で処理し、ディッシュから剥離した細胞を回収した。
　次に、上記のようにして選抜した接着性細胞を、付着性細胞培養用ディッシュ（コラーゲンコートディッシュ）に播種し、5％CO2、37℃に調整したインキュベータにて、一次培養し初代培養細胞とした。肉眼観察でサブコンフルエント（培養容器の表面の約70％を細胞が占める状態）又はコンフルエントになったときに、0.05％トリプシン・EDTAにて5分間、37℃で処理して細胞を培養容器から剥離して回収した。
　こうして得られた細胞を、再度、上記の培地を入れたディッシュに播種し、継代培養を数回行って、約1×107個/mLまで増殖させた。得られた細胞を、液体窒素中で保存した。
　その後、一次培養細胞を上記の培地を用いて約１×104細胞/cm2濃度で継代培養した。１～３回継代した細胞を実験に用いた。ヒトBMMSCs（Bone Marrow Mesenchymal stem cells、骨髄間葉系幹細胞）はロンザ社から購入し、メーカーの取扱説明書に従って培養した。
　以上のようにして、ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞（SHED）を得た。得られたSHEDを、FACSTARPLUS (ベクトン・ディキンソン社製)を用いて、各試料について、約１x106個のSTRO-1陽性細胞を以下のようにしてソートした。
　ブロモデオキシウリジンBrdU染色キットのメーカー（Invitrogen社製）の取扱説明書に従いBrdUを12時間取り込ませ、SHEDの増殖速度を評価した（各群についてｎ＝３）。実験は5回繰り返した。１元配置分散分析後に、Tukey-Kramer検定を行い、統計的有意差を評価した。
　STRO-1を免疫蛍光で検出するために、SHEDを３％パラホルムアルデヒドで固定し、さその後PBSで2回リンスし、100mMのグリシンで20分間処理した。次いで、これらの細胞を0.2％のTriton-X（Sigma-Aldrich社）で30分間透過処理し、その後、5％のロバ血清及び0.5％のウシ血清アルブミンの混合物中で20分間インキュベートした。
　次に、細胞を一次抗体のマウス抗ヒトSTRO-1抗体（1:100、R&D社製）と一緒に1時間インキュベートし、二次抗体のヤギ抗マウス免疫グロブリンM-FITC抗体（1:500、Southern Biotech社製）と一緒に30分間インキュベートし、ベクタシールドDAPI（Vector Laboratories Inc）を用いてマウントした。
　その後、15％FBSを添加したα-MEMを6ウェルプレートに入れ、ソートした細胞をクローン作製用に播種した。増殖した細胞の中から約300コロニーを試験用にプールした。
（２）遺伝子の導入
　上述したように、bmi-1, E6, E7及びhTERTの４つの遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込み、これらの遺伝子産物を発現するウイルスベクターを作製した。対照として、これらの遺伝子を組み込んでいない対照ベクターを作製した。
　SHEDを100mmφのコラーゲンコートディッシュに１×106個を播種し、10％FBSを添加したDMEMを加えてサブコンフレントまで培養した。この培地を吸引除去して上記培地で希釈したウイルス溶液500μLを加え（MOI=10）、37℃にて、５％CO2インキュベータ中で１時間培養し、上記ウイルスベクターを感染させた。感染48時間後、感染細胞をピューロマイシン(1pg/mL)を加えた上記の培地中で10日間培養して選択し、500～600個の耐性クローンをプールした。３～４日ごとに約0.5x105個のSHEDを100mmφの培養シャーレに播種し、継代した。遺伝子が導入されたSHEDをSHED-T、遺伝子が導入されないSHEDをSHED-Cとした。
（３）SHED-C及びSHED-Tの成長速度の測定
　SHED-T（遺伝子導入をしたSHED）の個体数の倍加状態を、図5に示した。図中、縦軸は個体数倍化回数（細胞分裂回数）、横軸は時間（培養日数）である。また、培養中のSHEDが１ヶ月間分裂しない状態を、細胞の老化の判断基準とした。
　SHED-Cは30回程で増殖が停止し、老化又は増殖停止段階に入った。これに対し、SHED-Tは250PDを超え、800日経過後も増殖した。
（３－１）フローサイトメトリー分析
　単一細胞の懸濁液を得るため、接着性の単層細胞をトリプシン／EDTAで消化した。２x105個の細胞に抗STRO-1モノクローナル抗体(1:100)を加えて放置し、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson社)を使用して分析した。対応するアイソタイプが同一の対照抗体と比較し、99％以上の割合で蛍光レベルが高い場合に発現が陽性とした。SHED-T及びSHED-Cともに、初期及び後期の継代細胞を固定し、FITC結合STRO-1抗体で染色した。その後、フローサイトメトリーで分析した。試験はそれぞれ二回行なった。SHED-CではSTRO-1陽性細胞の割合がPD20で27％であり、PD30では15％まで減少した（図６(A)及び(B)）。SHED-TではSTRO-1陽性細胞の割合が、それぞれPD20で46％、PD40で41％であった（図6(C)及び(D)）。
（３－２）分化能の検討
　PD０、PD10及びPD20におけるSHED-C及びSHED-Tの分化能を、新生骨量の形成能及び組織染色で調べた。
　まず、2.0 x 106個のSHED-C又はSHED-Tを、40mgのヒドロキシアパタイト／三カルシウムリン酸（HA/TCP）セラミック粉末(オリンパス工業（株）製)に混合し、10週齢の免疫無防備状態マウス(NIH-bgnu-xid, 雌、Harlan Sprague Dawley社製)の背側表面の皮下に移植した。
　移植８週間後に移植物を回収し、４％ホルマリンで固定して脱灰した後、パラフィン包埋するため10％EDTAを含むPBS溶液でバッファリングした。一部は、プラスチック包埋するために70％エタノール溶液中に保存した。
　パラフィン切片を脱パラフィン化し、これを水和した後、ヘマトキシリン及びエオシン（以下、「H&E」という。）で染色した。図７(A)～(C)は、SHED-T（不死化幹細胞）のPD0～PD20を示し、同(D)～(F)はSHED-C（正常細胞）のPD０～PD-20を示す。生体内での新しい骨の形成を定量するため、特定の領域を選び、SHED-T移植後に形成された移植物又はSHED-C移植後に形成された移植物それぞれについて、新生骨面積と視野面積とを算出し、これらの数値から新生骨量を求めた。
　　　新生骨量＝新生骨面積／視野面積×100
　図8に各個体数倍加回数（倍加時間）における、SHED-TとSHED-Cとの新生骨量の変化を示した。図中、**はｐ＜0.05、***はｐ＜0.01を表す。なお、新生骨量は、以下の算出式で求めた。
　図8に示されるように、SHED-Cでは個体数倍加回数が増えるについて新生骨量が減少し、PD20ではPD０の約1/5まで低下した。これに対し、SHED-Tでは、PD20まで新生骨量はほとんど変動がなく、PD20では、SHED-TはSHED-Cの5倍以上の骨を形成したことが示された。
（３－３）癌化活性の評価
　SHED-C及びSHED-T細胞を、免疫無防備状態マウスの皮下組織に、1×106個移植した。移植後、30日以上観察を行ったが、この期間中、上記の細胞を移植したいずれのマウスにおいても、腫瘍は形成されなかった。また、SHED-T細胞では、40～200PDの培養細胞のすべてのクローンの形態に変化はなかった。
　以上より、SHED-Tには、癌化活性はないことが示された。
（４）評価
　SEHD-Tは、260PDを超えても分化能力を保ったまま増殖する能力を有していることが示されたが、SHED-Cは、分化能力を有するものの30PD以下で老化した。
　以上から、SHED-Tは不死化細胞となっており、活性の高いSHED培養上清の大量生産に適することが示された。
（５）CM固定Tiインプラントスクリューの調製
　CM固定Tiインプラントスクリューの調製、細胞接着分析、走査型電子顕微鏡（SEM）によるTiインプラント表面の変化の観察、LC/MS/MSによるTiインプラント表面上のタンパクの同定及びインビトロにおけるSHEDのRNA分析は、上述した実施例１と同様に行った。
（実施例４）
（１）インプラント及び外科的手順
　Tiインプラント（チタンフィクスチャー）を、既に記載したように（文献番号40）、大腿骨中に挿入した。ラットを、ジエチルエーテル蒸気(3mL/チャンバー)の吸入と、ペントバルビタール(20 mg/kg)の腹腔内投与の組み合わせとにより麻酔した。10mmの切開口を遠位大腿骨を超えて形成し、この骨をむき出しにした。
　ユニコーチカルインプラントフロア（unicortical implant floor）を、歯科用ラウンドバー（dental round bar、直径1.5mm)を用いて、1500rpm以下の回転速度で、大腿骨の遠位から７mmで形成した。CM、DMEM又はPBSで処理したインプラントを、皮質骨中に挿入して埋め込んだ。その後、軟組織を、それらの正常の位置に戻し、3-0バイクリル（登録商標）SH-1（エチコン社製）で縫合した。
（２）In vivoイメージング分析
　固定化したQD-修飾CMを有するTiインプラントをトラックし、イメージングシステム（IVIS spectrum, Xenogen社製）を用いて可視化した。ラットを、移植後１日目、７日目、14日目、及び28日目にそれぞれ屠殺し、埋め込んだTiインプラントを有する大腿骨を取り出した。取り出したラットの大腿骨中のTiインプラントと会合した（associated with）QD-ラベルを、イメージングによって検出した。
　各ラット及び取り出した大腿骨を、以下の条件でイメージングした：
　　検体の高さ: 1.50cm 
　　視野: 13×13cm 
　　暴露時間: １秒
　　f-ストップ: 1 
　　バインディング: 8
　　励起フィルター: 605nm
　　放射フィルター: 655nm又は検体の高さ: 0.01cm
　　視野: 6.5×6.5cm, 
　　暴露時間: 2秒
　　f-ストップ: 1 
　　バインディング: 8, 
　　励起フィルター: 605nm, 
　　放射フィルター: 655nm,
（３）除去トルク(Ｎcm)測定
　大腿骨インプラントの除去トルク（Ｎcm）を、インプラント設置後1日、7日、14日及び28日の時点で、実験群ごとに深麻酔下に測定した（各時点においてＮ＝５）。除去トルクを、トルクゲージATG 3 CN（登録商標、測定レンジ：0.1‐3 Ncm；Tohnichi, Tokyo, Japan）及びBTG 15 CN-S（登録商標、測定レンジ：2－15 Ncm；（株）東日製作所製）を用いて測定した。データを有意差レベル５％で、Scheffe検定を用いて、一元配置分析により解析した。
　結果を図９に示す。陰性対照群（PBS処理群）と陽性対照群（DMEM処理群）との間では、１日後、及び７日後で有意差が見られたが、14日後には有意差は見られなかった。試験群（CM処理群）では、全ての測定時点で対照群よりも高い値を示し、14日後まで有意差が見られた（*はp＜0.05を示す。）。
（４）組織学的処理及び骨移植接触（bone-implant contact (BIC)）率(％)の測定
　除去トルク測定後、ラット（各群ともＮ＝５）を深麻酔下に屠殺し、大腿骨インプラントを取り出した。得られた試料を、Technovit 7100（応研商事（株）)中に埋め込んだ。各ブロックをインプラントの長軸方向に沿って移動させ、50μm厚の切片を作成し、トルイジンブルーを用いて、通常の方法で染色した。
　切片の顕微鏡画像をモニター上に表示してコンピュータ入力し、イメージ分析用ソフトウェア（VMS-50 VideoPro、イノテック（株）製）を用いて分析した。骨接触率は、下記の式によって求めた：
　　骨接触率（％）＝直接移植‐骨接触/ペリインプラント長。
　データを有意差レベル5％で、Scheffe検定を用いて、一元配置分析で解析した。結果を図10に示す。
　結果を図10(A)は海綿骨の場合を、また、図10(B)は皮質骨の場合を示す。骨移植接触率は、海綿骨においては移植７日後及び14日後で陰性対照群と他の２群との間で有意差が見られた。一方、皮質骨では、移植１日後から試験群と陰性対照群との間で有意差が見られた（ANOVA検定、*：p＜0.05、**：p＜0.01）。
　試験群でBICの値が高いことから、骨との一体化が促進されていることが示された。
（実施例5）ヒト用高機能インプラントの作製
（１）材料と方法
　インプラントは、アストラ社製のチタンインプラント（長さ13mm、直径3.75mm、又は長さ11mm、直径3.75mm）を使用した。
（２）成長因子含有培養上清の調製
　実施例１で得た幹細胞の培養上清を用いて成長因子含有溶液を調製し、以下のように処理を行った。
　この培養上清を培養フラスコに入れ、チタンインプラント材をここに加えて、ふたをきっちりと締めて十分に振盪した。ソニケーターで１分間、ソニケーションした。次いで、5分間静置し、再び、同じ条件で１分間ソニケーションした。5分間静置後に、純水で2回洗浄した。以上のようにして、上記培養上清中に含まれる成長因子でコーティングしたチタンインプラントを得た。培養上清に代えて、DMEMのみを使用して同様の処理を行い、無処理のチタンインプラント材を調製した。
（実施例6）高機能インプラントの移植例
（１）患者等
　41歳～68歳の男性8名の上顎無歯顎に、実施例5で作製したインプラントを移植した。これらの患者には、糖尿病、高血圧その他の骨代謝に影響を与える基礎疾患はなかった。また、飲酒量が多いということもなく、喫煙習慣もなかった。
　ある患者では、上顎臼歯部で、上顎洞底との距離が15mm以上残存している部位を埋入部位とした。成長因子で処理したインプラント（処理群）8本を患者の一方側の上顎臼歯部に埋入し、成長因子で処理していないインプラント（無処理群）8本を、同一患者の反対側上顎臼歯部に埋入した。
（２）評価方法
　上記16本のインプラントを埋入した直後（埋入時）、6カ月後、及び12ヶ月後の時点で、オステルモニター（Ostell Mentor, Ostell AB, Grothenburug, Sweden)を用いて、ISQ（Implant Stability Quotient）の変動によって評価した。
　ISQ値は、インプラント周囲の骨の高さや質、骨とインプラントの結合力によって変化し、１から100の間の数値で表示される。一般的に、成功したインプラントはISQが65±５の場合に多いといわれている。計測結果を図11に、また、評価を下記表8に示した。図11に示すように、設置時のISQは、対照群及びSHED-CM処理群ともにこの範囲内であった。ISQ値は、いずれの群においても経時的に上昇したが、６月経過時点でSHED-CM処理群が有意に高くなっていた（p＜0.05）。この傾向は、12月経過でも同様であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　上記表8に示すように、不死化乳歯幹細胞由来成長因子を表面にコーティングしたチタンインプラントでは、フィクスチャーの長さにかかわらず、骨との一体化が促進されることが示された。
（実施例7）培養上清中及び高機能インプラント表面に付着したタンパク質の分析
（１）材料と方法
　実施例１で得た幹細胞の培養上清中のタンパク質を使用し、LC/MS/MS（MS4 HPLC System (Michrom BioResources社製)とLCQ Advantage mass spectrometry system (Thermo Scientific社製）で同定した。
　測定条件は、下記の通りとした。
　LC：MS4 HPLC System (Michrom BioResources社製）
　　カラム：Magic C18AQ(Michrom BioResources社製、0.1mm(i.d.)ｘ50cm）
　　溶離液：溶液A（2% アセトニトリル－98% 水（0.1% 蟻酸含有））、溶液B（90% アセトニトリル－10% 水（0.1%蟻酸含有）をグラジエントさせた（0分, 95% A：5% B→45分, 0% A：100% B）。
　　流速：１μL/分
　MS1：LCQ Advantage mass spectrometry system (Thermo Scientific社製)
　MS2：LCQ Advantage mass spectrometry system (Thermo Scientific社製)
　インプラント上に付着したタンパク質は、10％EDTA、４Mグアニジン、80％アセトニトリルの順で液体クロマトグラフィーによる段階抽出を行い、それぞれのバッファーの流量は2mL/分になるようにして採取し、タンパク量が２μg/mLになるように調製した。タンパク量は、ビウレット法にて測定した。
　培養上清は、100％エタノール、90％エタノールを用いてエタノール沈殿をさせた後に凍結乾燥し、タンパク量が２μg/mLになるように調製した。タンパク量は、ブラッドフォード法にて測定した。
　分析結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表9に示したように、実施例１で得られた幹細胞の培養上清中には、細胞構造の形成に関連するタンパク質が多く含まれていることが明らかになった。また、上記のようにして得られた間葉系幹細胞を培養した後の接着細胞の割合の多さから、コラーゲンα-1(I)鎖、コラーゲンα-2(I)鎖、フィブロネクチン、及びデコリンが、インプラントと歯槽骨との接着に重要な役割を果たしているものと考えられた。
（実施例8）培養上清の細胞の接着性に対する影響及び凍結保存の影響
（１）材料
　実施例１で得た幹細胞の培養上清を試料とし、陰性対照としてPBSを使用した。
（２）細胞の接着性に対する影響
　直径15mm純チタン板に、イヌ骨髄間質細胞（年齢18-25ヶ月、体重15-25kgのビーグル犬の腸骨より骨髄液を10mL採取し、10％FBS及び50～150U/mLのペニシリン、50～150μｇ/mLのストレプトマイシンを含むDMEM培地を用いて、5％CO2インキュベータ中にて、37℃で３代予備培養したもの）を1.5～3ｘ10５個/ウェルで播種（ｎ＝３）し、培養上清の有無による細胞の接着性の影響、及びプラズマ処理の影響を調べた。
　培養は、10％FBS及びペニシリン（50～150U/mL）、ストレプトマイシン（50～150μｇ/mL）を含むDMEM使用し、37℃にて、培養した。培養前に、直径15mmの純チタン板に対して30秒間大気圧プラズマ（MPS-01K01C, 栗田製作所社製）をプラズマ炎先端から10mmの距離で照射し、チタン板を、培養上清またはPBS中に、24時間37℃の条件下で浸漬した。培養開始後１時間、及び24時間の時点での接着細胞数を、トリプシン-EDTAで接着細胞を剥離させ、血球計算盤上で浮遊細胞をカウントするようにして計数して求めた。結果を図12に示す。図12中、N-PBSはプラズマ処理なしでPBS中での培養、P-PBSはプラズマ処理しPBS中での培養、N-CMはプラズマ処理なしで培養上清中での培養、P-CMはプラズマ処理し培養上清中での培養を意味する。
　N-PBSでは、24時間後でも接着細胞数の大きな増加は見られなかったが、P-PBSでは大きく増加していた。また、N-CM及びP-CMの両群では24時間後の接着細胞数が増加していた。
　N-PBS群とP-CM群では、24時間後の接着細胞数に有意差が見られた（ｐ＜0.01）。また、P-PBS群とP-CM群との間にも、有意差が見られた（ｐ＜0.05）。
　また、24時間後における細胞の付着状態を、DAPIとファロイジンとを用いて蛍光染色し、250倍で、蛍光顕微鏡（励起波長：358nm(DAPI), 560nm（ファロイジン）、測定波長：465nm(DAPI), 575nm（ファロイジン）、A1＋（Nikon社製）で観察した。
　結果を図13に示す。図13に示すように、細胞の増殖状況は、N-CM群及びP-CM群で、明らかに多くなっていた。
（３）凍結保存した場合の細胞増殖に対する影響
　上記の培養上清を、１mLずつプラスチック製のネジ口チューブ（容量２mL、コーニング社製）に分注し、それぞれ、４℃、-15℃、及び-80℃で１週間、2週間及び1ヶ月保存した。
　この影響を、ブロモウリジンアッセイで確認した。アッセイキットとして、BrdUラベリング＆ディテクションキットII（ロシュ　アプライドサイエンス社製）を使用し、添付された使用説明書に従ってアッセイを行った。
　実施例１と同様にして得た間葉系幹細胞を、１x106個/ウェルで96ウェルプレートに播種した。上記のように保存した培養上清を100μL/ウェルで添加し、５％CO2インキュベータ中にて、37℃で24時間培養し、この幹細胞の増殖を観察し、増殖率を求めた。結果を図14に示す。
　-80℃で保存した場合には、1ヶ月保存した場合の活性は、1週間保存した場合と比較して低下傾向にあったが、有意差は見られなかった。一方、－80℃で2週間保存した場合と、-15℃で1ヶ月保存した場合との間には、有意差が見られた（p＜0.05）。また、－80℃で2週間保存した場合と、４℃で1ヶ月保存した場合との間には、有意差が見られた（p＜0.05）。－80℃で1週間保存した場合と、4℃で2週間保存した場合との間でも有意差が見られた（p＜0.05）。
　以上から、培養上清の保存期間は、－80℃で凍結保存した場合には1ヶ月、－15℃の場合には1ヶ月、4℃の場合には2週間と考えられる。
　以上より、培養上清でインプラントを処理することによって、上記の再生因子を産生する幹細胞の増殖が促進され、インプラントとそれをそれを埋め込んだ骨との接着が強固になることが示された。
　本発明は、歯科及び医科の分野で有用である。
配列番号１：ALP用フォーワードプライマー
配列番号２：ALP用リバースプライマー
配列番号３：OCN用フォーワードプライマー
配列番号４：OCN用リバースプライマー
配列番号５：OPN用フォーワードプライマー
配列番号６：OPN用リバースプライマー
配列番号７：BSP用フォーワードプライマー
配列番号８：BSP用リバースプライマー
配列番号９：Collagen 1用フォーワードプライマー
配列番号１０：Collagen 1用リバースプライマー
配列番号１１：GAPDH用フォーワードプライマー
配列番号１２：GAPDH用リバースプライマー
配列番号１３：コラーゲンα-1 (I) 鎖プリカーサー
配列番号１４：コラーゲンα-1 (II) 鎖プリカーサー
配列番号１５：コラーゲンα-1 (XXVII) 鎖プリカーサー
配列番号１６：コラーゲンα-2 (I) 鎖プリカーサー
配列番号１７：フィブロネクチン
配列番号１８：フィブロネクチン
配列番号１９：デコリン
配列番号２０：デコリン
配列番号２１：オステオカルシン
配列番号２２：オステオポンチン
配列番号２３：骨シアロタンパク質 ２
配列番号２４：血管上皮成長因子 Ａ

Claims (25)

  1. 　５～１５％の血清、５０～１５０U/mLのペニシリン及び５０～１５０μｇ/mLのストレプトマイシンを含有する培養液中に、５×１０３～５×１０４個/mLの骨髄間質細胞又は不死化乳歯幹細胞を加えて、３４～３７．５℃、５％ＣＯ２存在下に、予備培養を行う予備培養工程と；
    　所定の形状と接着性とを有する前記細胞を選別する細胞選別工程と；
    　前記選別工程で選別された細胞を予備培養と同じ条件で培養し、培養開始後４０～５６時間の培養上清を集める培養上清収集工程と；
    　を備える、細胞産生物の調製方法。
  2. 　前記骨髄間質細胞は、ラットの大腿骨、ブタ歯髄、及びヒト乳歯からなる群から選ばれるいずれかの細胞に由来するものであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞産生物の調製方法。
  3. 　前記細胞を、３７℃で培養することを特徴とする、請求項２に記載の細胞産生物の調製方法。
  4. 　前記所定の形状は、スピンドル形状かつ紡錘型であることを特徴とする、請求項３に記載の細胞産生物の調製方法。
  5. 　培養開始後４４～５２時間の前記培養上清を集めることを特徴とする、請求項１に記載の細胞産生物の調製方法。
  6. 　培養開始後４８時間の前記培養上清を集めることを特徴とする、請求項５に記載の細胞産生物の調製方法。
  7. 　前記培養液は、ダルベッコ培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、ハムF12培地、及びRPMI1640培地からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の培地であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞産生物の調製方法。
  8. 　前記血清は、ウシ胎児血清、ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清、及びヒツジ血清からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の血清であることを特徴とする、請求項７に記載の細胞産生物の調製方法。
  9. 　前記培養液は、１０％ウシ胎児血清と、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンと１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンとを含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞産生物の調製方法。
  10. 　遠心及びエタノール沈殿処理を行って沈殿物を調製する沈殿物調整工程と；
    　前記沈殿物調製工程で得られた沈殿物を凍結乾燥させる凍結乾燥工程と；
    をさらに備える、請求項１～９のいずれかに記載の細胞産生物の調製方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれかに記載の方法で調製された細胞産生物。
  12. 　前記培養上清には、少なくとも、Ｉ型コラーゲン（Col-I）、フィブロネクチン、デコリン及び血管内皮増殖因子（VEGF）が含まれることを特徴とする、請求項１１に記載の細胞産生物。
  13. 　前記培養上清には、インスリン様成長因子結合タンパク質7、フォリスタチン関連タンパク質、メタロプロテイナーゼインヒビターI、組織プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、アクチン、及びスルフヒドリルオキシダーゼIがさらに含まれることを特徴とする、請求項１２に記載の細胞産生物。
  14. 　前記培養上清には、SPARC、コラーゲンα2(IV)鎖、β-2-ミクログロブリン、Rho GTPase活性化タンパク質18がさらに含まれることを特徴とする請求項１３に記載の細胞産生物。
  15. 　インプラント材の表面を有機溶媒で洗浄し、洗浄インプラント材とする洗浄工程と；
    　前記洗浄インプラント材を、所定の組成を有する第１石灰化溶液中に所定の温度で３～６時間浸漬し、浸漬インプラント材とする浸漬工程と；
    　前記浸漬インプラント材を所定の濃度の請求項１２～１４のいずれかに記載の細胞産生物を含有する第２石灰化溶液で２～５日間インキュベート処理する処理工程と；
    を備えることを特徴とする、高機能インプラントの作成方法。
  16. 　前記インプラント材は、チタン、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、及びβ‐ＴＣＰからなる群から選ばれるいずれかの材料で形成されていることを特徴とする、請求項１６に記載の高機能インプラントの作成方法。
  17. 　前記有機溶媒は、アセトンと60～80％エタノールであることを特徴とする、請求項１６に記載の高機能インプラントの作成方法。
  18. 　前記第１石灰化溶液は、100～150 mM NaCl, 2.5～3.5 mM CaCl2・H2O, 1.5～2.5 mM K2HPO4, 25～75 mM Tris-HCl（pH 7.2～7.6）であり、第２石灰化溶液は、130～160 mM KNO3, 1～2 mM Ca(NO3)2・4H2O, 0.5～1.5 mM K2HPO4（pH 7.0～7.8）であることを特徴とする、請求項１６に記載の高機能インプラントの作成方法。
  19. 　前記第１石灰化溶液は、136.8 mM NaCl, 3.10 mM CaCl2・H2O, 1.86 mM K2HPO4, 50 mM Tris-HCl（pH 7.4）であり、第２石灰化溶液は、142.8 mM KNO3, 1.5 mM Ca(NO3)2・4H2O, 0.9 mM K2HPO4（pH 7.4）であることを特徴とする、請求項１８に記載の高機能インプラントの作成方法。
  20. 　前記所定の温度が36～38℃であり、浸漬時間が４時間であることを特徴とする、請求項１６に記載の高機能インプラントの作成方法。
  21. 　前記所定の濃度の細胞産生物は、５～20mg/mLの濃度であることを特徴とする、請求項１５に記載の高機能インプラントの作成方法。
  22. 　請求項１５～２１のいずれかに記載の方法で作成された高機能インプラント。
  23. 　少なくとも、Ｉ型コラーゲン（Col-I）、フィブロネクチン、及びデコリンを表面に保有することを特徴とする、請求項２２に記載の高機能インプラント。
  24. 　インスリン様成長因子結合タンパク質7、フォリスタチン関連タンパク質、メタロプロテイナーゼインヒビターI、組織プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、アクチン、及びスルフヒドリルオキシダーゼIからなる群から選ばれる少なくとも１以上のタンパク質をさらに表面に有することを特徴とする、請求項２３に記載の高機能インプラント。
  25. 　前記高機能インプラントは、チタン、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、及びβ‐ＴＣＰからなる群から選ばれるいずれかの材料で形成されていることを特徴とする、請求項２２に記載の高機能インプラント。
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