JPWO2017078176A1 - 不死化幹細胞、及びその作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
すなわち、従来技術1で開示された細胞は老化する細胞であり、細胞の老化、すなわち時間の経過に伴って、産生される生体因子の組成も変化するという問題がある。このことは、一定した組成の培養上清を入手することができないことを意味し、安定した品質の治療剤を提供できないという問題につながる。このため、無限増殖が可能な株化細胞を樹立することに対して、強い社会的要請があった。
すなわち、本発明の第1の態様は、Bmi、ヒトパピローマウイルスE6及びヒトパピローマウイルスE7からなる群から選ばれる少なくとも1以上の遺伝子と、テロメラーゼ逆転写酵素とを含む、DNA断片を作製する工程と;前記遺伝子を含むDNA断片を組み込んだウイルスベクターを作製する工程と;前記ウイルスベクターを哺乳類の幹細胞にトランスフェクトさせて前記遺伝子のセットを前記幹細胞に導入する工程と;前記遺伝子のセットが導入された前記幹細胞を培養し、薬剤によって不死化幹細胞を選択する工程と;を備える不死化幹細胞の作製方法である。
また、導入する遺伝子数が2以上であればよいため、多数の遺伝子を導入する場合に比べて簡便な操作によって不死化幹細胞を得ることができる。
以下に、本発明の方法及びその方法を用いて産生された不死化幹細胞をさらに詳細に説明する。
1.1 ウイルス組込み用DNA断片の作製
まず、ウイルスにDNA断片を組み込むために使用するベクターの配列情報を入手する。本発明の方法で、遺伝子導入用ベクターとして使用するウイルスは、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスからなる群から選ばれるいずれかのものであることが、導入した遺伝子が一過性ではなく発現されることから好ましい。レンチウイルスを使用することが、導入遺伝子の安定発現株の産生効率が高いことから好ましい。
上記の作業と並行して、組換えレンチウイルスベクター産生細胞を準備する。こうした細胞株としては、例えば、Lenti-X 293T(クロンテック社製、コード番号:632180)その他の市販の細胞株を使用することができる。Lenti-X 293Tの培養には、ウシ胎児血清及び抗生物質を含む培地を使用することができる。こうした培地としては、例えば、最小培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)等を挙げることができる。例えば、5〜15%のウシ胎児血清(FBS、ハイクローン社製)、0.5〜2%の抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン、ギブコ社製)を含有するDMEM(SIGMA社製, St. Louis, MO)等を使用することが、細胞の増殖効率の点から好ましい。
以下に、レンチウイルスベクターの場合を例に挙げて説明する。
以上説明したように培養している細胞の入った複数のディッシュに、上記のようにして作製したレンチウイルスベクタープラスミドをそれぞれ加えてコトランスフェクションを行なう。こうしたコトランスフェクションには、市販のパッケージングシステム、例えば、Lenti-X HTXパッケージングシステム(クロンテック社製)等を使用することができる。具体的な手順は、こうしたシステムに付属しているマニュアルに従いえばよい。
市販のキット、例えば、MN NucleoBond Xtra Mid Kit(クロンテック社製)を用いて水で溶出させたプラスミドの量を測定する。これとともに、所望のゲル、例えば、約1%のアガロースゲルで分析を行ない、組み込まれたDNAがそれぞれ異なるものであることを確認する。ゲル電気泳動分析のマーカーとしては、例えば、スーパーコイルのDNAラダー、λ−Hind III消化DNA等を使用することができる。以上のようにして、ウイルスベクターを作製することができる。
2.1 ブタ歯髄幹細胞の調製
生後5〜6ヶ月のブタの顎骨(下顎歯のついた下顎骨)及び腸間膜を入手する。以下の手順に従って、上記のブタの歯と下顎骨とからブタの歯髄幹細胞(以下、「SHED」ということがある。)を得る。
ブタの腸間膜から、例えば、解剖用はさみ及び穿刀にて脂肪組織を切り出して集め、余分な組織を除去し、生理食塩水中で血液を洗い流す。得られた脂肪細胞を、所望の培地、例えば、5〜15%のウシ血清及び所望の濃度の抗生物質を含むDMEM中に移し、上記と同様の条件下に予備培養し、ついで、上記DMEM中で、37℃、5%CO2の条件下でサブコンフレントになるまで培養する。上記の添加量は、すべて終濃度表示である。こうした培地としては、例えば、約10%ウシ血清、約100U/mLのペニシリン及び約100μg/mLのストレプトマイシンを含有するDMEMを使用することができる。
ブタSHEDと同様に、剥離剤を使用して剥離し、遠心分離し、得られた細胞を継代培養して脂肪幹細胞を得ることができる。
健常児から得られた脱落乳歯又は抜歯した乳歯を入手する。こうした乳歯を、適当な消毒剤、例えば、イソジン溶液で消毒した後、ブタの歯髄を得たのと同様にして歯髄組織を回収する。得られた歯髄組織を、所望の濃度のコラゲナーゼ及びディスパーゼ、例えば、約3mg/mLのI型コラゲナーゼ及び約4mg/mLのディスパーゼの溶液中、所望の温度で所望の時間、例えば、約37℃にて約1時間、消化する。ついで、この溶液を、例えば、70mmの細胞ストレーナ(Falcon社製)を用いて濾過し、細胞を濾別する。
3.1 レンチウイルスベクターによる遺伝子導入
以上のようにして得られたブタ歯髄幹細胞、ブタ脂肪幹細胞、及びヒト歯髄幹細胞を上記と同様に培養し、約70〜90%コンフルエントになったところで、市販のキットを用いてマイコプラズマチェックを行なう。こうしたキッとしては、例えば、MycoAlert Mycoplasma Detection Kit(Lonza社製、LT07-318)等を使用することができる。
以上のように培養した幹細胞(ブタ歯髄幹細胞、ブタ脂肪幹細胞及びヒト歯髄幹細胞)の培養プレートの各ウェルから培養上清を除去し、所望の濃度の選択薬剤、例えば、約0.4mg/mL又は約0.8mg/mLのGENETICIN(G418、GIBCO社製)を含む選択培地を、所望の量、例えば、約2mL/well各ウェルに加え、選択培地に交換する。以後、培地交換を行いながら所望の期間、例えば、約3〜約5日間培養し、遺伝子導入細胞の選択を行う。
遺伝子発現の確認用に、例えば、NucleoSpin RNA II (MACHEREY- NAGEL社製のキット)を用いて総RNAを調製する。以下で使用する種々のバッファー、リングフィルター等は上記のキットに付属するものを使用し、キットに付属するマニュアルに従って、操作を行なうことが、高純度の総mRNAを得られることから好ましい。
上記のようにして得られた総RNAサンプルから逆転写を行ない、引き続きリアルタイムPCRを行なってPCR産物を得る。逆転写には、例えば、PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real time、TaKaRa Bio社製)等の市販品を使用し、こうしたキットに付属しているマニュアルに従って逆転写を行なえばよい。
(1)ウイルス調製用細胞の調製
(1−1)試薬等及び細胞の起床
組換えレンチウイルスベクター産生細胞株として、Lenti-X 293T(クロンテック社製、コード番号:632180)を使用した。Lenti-X 293Tの培養には、10%ウシ胎児血清(FBS、ハイクローン社製、ロット番号:GRD0051)及び抗生物質(1%ペニシリン/ストレプトマイシン、ギブコ社製、コード番号15140-122)を含有するDMEM(シグマ社製、コード番号:D5796-500ML)を使用した。以下、この培地を、本明細書中では、「293T基本培地」という。細胞凍結保存(セルバンカー、コード番号:BLC-1)は日本全薬工業社より購入した。
DMEM、抗生物質、FBSは、上記(1−1)と同じものを使用した。また、リン酸緩衝生理食塩水(PBS(-)、コード番号:10010-049、以下、単に「PBS」ということがある。)はギブコ社より購入した。T.C.処理したディッシュ(直径10cm)は、イワキ(株)より購入した。剥離剤として、0.25%トリプシン−EDTA(1x)は、ギブコ社より購入した。
1〜5x106cells/10mL/10cmディッシュで細胞を播種し、5%CO2インキュベーター中にて約24時間培養した。その後、使用するまで、細胞の状態に合わせて継代した。
(2−1)試薬等
DMEM、抗生物質、FBS、剥離剤、PBSは、上記(1−1)と同じものを使用した。コラーゲンコートしたディッシュ(6cm)はイワキ(株)より、また、トランスフェクション試薬(TransIT-293、コード番号:MIR2700)はMirus社より、それぞれ購入した。組換えレンチウイルスベクター産生用試薬(Lenti-XTM HTX Packaging System、コード番号:631247、クロンテック社製)及びLenti-X HTX Packaging Mix(VSV-G)は、クロンテック社より購入した。
以下の4種類のレンチウイルスベクターを構築した。pLVSINベクターの配列情報を、タカラバイオウェブカタログからダウンロードし、以下の手順により構築した。
(v1)レンチベクターE7T(EcoRI/KoZal/E7/T2A4/hTERT/BamHI)
配列情報に従って、EcoRI/KoZal/E7/T2A4/hTERT/BamHIの二本鎖DNA(配列表の配列番号1)を合成し、レンチプラスミドベクター(pLVSIN-CMV Neo、図1参照)のマルチクローニングサイトに標準的な手順でクローニングし、SYN4122-1-7(配列表の配列番号1)を得た。
配列情報に従って、Bmi-1の二本鎖DNAを合成し、上記(v1)で作製したレンチウイルスベクターE7TのE7と入れ換えた(配列表の配列番号2)。
配列情報に従って、T2A3E6の二本鎖DNAを合成し、上記(v2)で作製したレンチウイルスベクターのBmi-1とT2A4との間に挿入した(配列表の配列番号3)。
(v4)レンチベクターE6E7T(EcoRI/KoZal/E6/T2A3/E7/T2A4/hTERT/BamHI)
配列情報に従って、E6T2A3の二本鎖DNAを合成し、上記(v1)で作製したレンチウイルスベクターE7TのKozak配列とE7との間に挿入した(配列表の配列番号4)。
上記(1)(1−2)で継代してきたLenti-X 293T細胞の培養上清を除去し、PBSで洗浄し、剥離剤をディッシュに加えて細胞を剥離させて回収した。
4倍希釈した細胞懸濁液を50μL取り、等量のトリパンブルーを加えて、血球計算板を用いて細胞を計数したところ、2.38x106cells/mLであった。この懸濁液に上記基本培地を加えて5x105cells/mLに調製し、直径6cmのコラーゲンコートディッシュに、2x106cells/4mL/ディッシュで播種した。その後、5%CO2インキュベーター中、37℃にて約24時間培養し、培地を交換してさらに培養を続けた。
Lenti-X HTXパッケージングシステム(以下、単に「パッケージングシステム」ということがある。)を用いてコトランスフェクションを行った。Xfect Polymerを十分にボルテックスし、トランスフェクション用の各サンプルについて2本のマイクロチューブ(チューブ1及び2)を用意した。チューブ1には、179〜182μLのXfect Reactionバッファーを入れ、ここに15μLのLenti-X 293 T Packaging Mixを加え、最後に3〜6μLの表1に示すベクタープラスミドを加えた(プラスミド溶液、合計200μL)。また、チューブ2には、197μLのXfect Reactionバッファーを入れ、ここに3μLのXfect Polymerを加えた(ポリマー溶液、200μL)。
培地を交換した翌日に、上記のシャーレの培養上清を10mLのディスポーザブルシリンジ(テルモ(株)製)で吸い取って回収した。このシリンジに0.45μmのフィルター(MILEX-HV、ミリポア社製)を装着し、シリンジ内の培養上清をろ過しながら、15mLチューブに、ウイルスベクター溶液を回収した。チューブ内に回収されたろ過済の培養上清を混和し、1mL/バイアルに分注し、−80℃にて保存した。約200μLを力価測定用ウイルスベクター溶液として別途保存した。
Lenti-X GoStixに、上記のようにして得られた力価測定用ウイルスベクター溶液を20μL加え、Chase Buffer 1を4滴添加した。次いで、室温にて10分間反応させ、バンドの有無を確認した。図2(A)〜(E)に示すように、測定したSYN4122-1-7、SYN4122-2-2、SYN4122-3-3及びSYN4122-4-4の全てにおいて、2本のバンドが認められ、組換えレンチウイルスベクターの存在が確認された。図中、左側は対照を示すバンド、右側が組換えレンチウイルスベクターを示す。
上記のようにして得られた4つのプラスミド(SYN4122-1-7、SYN4122-2-2、SYN4122-3-3及びSYN4122-4-4)を含むLenti-X 293 T細胞を、寒天培地上にストリークしてコロニーを形成させた。形成されたコロニーを取って抗生物質を含む2mLのLB培地に播種し、37℃で約8時間、激しく撹拌しながら(200rpm)培養した。
MN NucleoBond Xtra Mid Kit(クロンテック社製)を使用し、水でプラスミドを溶出させ、溶出量を測定した。これとともに、アガロースゲル(1%)で分析を行なった。マーカーは、M1がスーパーコイルのDNAラダー、M2がλ−Hind III消化DNAとした。結果を表1及び図3に示す。アガロースゲル電気泳動分析の結果から、組み込まれたDNAがそれぞれ異なることが示された。
(1)レトロウイルス調製用細胞の調製
(1−1)試薬等及び細胞の起床
レトロウイルス調製細胞株として、G3T-hi細胞を使用した。G3T-hi細胞の培養には、グルコース(4.5 g/L)、L-グルタミン(584 mg/L)、10%ウシ胎児血清(FBS、ハイクローン社製、ロット番号:GRD0051)及び抗生物質(1%ペニシリン/ストレプトマイシン、ギブコ社製、コード番号15140-122)を含有するDMEM(シグマ社製、コード番号:D5796-500ML)を使用した。
DMEM、抗生物質、FBS、グルコース及びL-グルタミンは、上記(1−1)と同じものを使用した。また、PBS、T.C.処理したディッシュ(直径10cm)及び0.25%トリプシン−EDTA(1x)は、上記実施例1と同じものを使用した。
1〜5x106cells/10mL/10cmディッシュで細胞を播種し、5%CO2インキュベーター中にて約24時間培養した。その後、使用するまで、細胞の状態に合わせて継代した。
(2−1)試薬等
DMEM、抗生物質、FBS、剥離剤、PBS等は、上記(1−1)と同じものを使用した。コラーゲンコートしたディッシュ(6cm)、トランスフェクション試薬(TransIT-293、コード番号:MIR2700)は、上記実施例1と同じものを使用した。また、Retrovirus Packaging Kit Ampho、Retrovirus Titer Set (for Real Time PCR)、及びOne Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(いずれもタカラバイオ(株)製)を使用した。
以下の5種類のレトロウイルスベクターを構築した。pDON-5 NEO ベクターの配列情報を用いて、以下の手順により構築した。
開始コドンの上流にKozak配列(gccacc)を付加した5種類の不死化遺伝子(hTERT(配列表の配列番号5)、ヒトパピローマウイルスのE6(配列表の配列番号6)及びE7(配列表の配列番号7)、pigTERT(配列表の配列番号8)、及びhBmi-1(配列表の配列番号9))を常法に従って調製し、pDON-5 NEO DNA(TaKaRa Code 3657:図7参照)のPmaC I-Hpa Iサイトにクローニングし、5種類のレトロウイルスベクター(pDON-5 Neo hTERTベクター、pDON-5 Neo HPV16E6ベクター、pDON-5 Neo HPV16E7ベクター、pDON-5 Neo pHTERTベクター及びpDON-5 Neo hBmi1ベクター)を調製した。
5枚のTissue Culture Dish (100 mm)に、6x106個/dishでG3T-hi細胞を播種し、5%CO2インキュベータ中にて37℃で約24時間培養し、0.4mLのトランスフェクション試薬(TransIT-293)を加えて、上記の5種類プラスミドベクターのうちから3種類を選択し、pGP及びpE-Ampho(いずれもRetrovirus Packaging Kit Amphoに付属するベクター))を共導入し、さらに同じ条件の下で40〜56時間培養を行なって、これらの遺伝子を導入し、さらに同じ条件の下で48時間培養を行なった。培養終了後にレトロウイルスベクターが含まれる培養上清を回収し、0.45μmのフィルター(ミリポア社製)で濾過滅菌し、1mLずつチューブに分注した。
組換えレトロウイルスベクターの力価を、Retrovirus Titer Set (for Real Time PCR)及びOne Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time)(いずれもタカラバイオ(株)製)を用いて、それぞれの使用説明書に従って定量を行なった。各キットに付属しているRNAコントロールテンプレートのコピー数をX軸に、また、二次微分曲線(2nd Derivative)から求めたCt値をY軸にプロットして検量線を作成した。この検量線に基づいて被検試料の力価を求めた。
上記実施例1で得られたレンチウイルスベクターを、以下のように作製したブタ乳歯幹細胞、ブタ脂肪幹細胞、ヒト歯髄幹細胞それぞれに感染させ、目的遺伝子の安定発現株を作製した。
(1−1)ブタ歯髄幹細胞
食肉公社(日本国愛知県名古屋市港区)より、生後5〜6ヶ月のブタの顎骨(下顎歯のついた下顎骨)及び腸間膜を入手した。屠殺直後の食肉用ブタの下顎歯、顎骨及び腸間膜は、保冷剤入りのアイスボックス(-30℃)にて搬送した。以下の手順に従って、上記のブタの歯と下顎骨とからブタの歯髄幹細胞(SHED)を得て、ラボへ搬送した。
ブタの腸間膜から、解剖用はさみ及び穿刀にて脂肪組織を切り出して集め、余分な組織を除去し、生理食塩水中で血液を洗い流した。得られた脂肪細胞を、10%ウシ血清、100U/mLのペニシリン及び100μg/mLのストレプトマイシンを含有するDMEM中に移して、上記と同様の条件下に予備培養し、ついで、上記DMEM中で、37℃、5%CO2の条件下でサブコンフレントになるまで培養した。上記の添加量は、すべて終濃度で表示した。ブタSHEDと同様に、上記の0.05%トリプシン溶液を使用して剥離し、1,500rpmで3分間遠心分離し、継代培養して脂肪幹細胞を得た。
10歳の健常男児から得られた脱落乳歯を使用した。この脱落乳歯をイソジン溶液で消毒した後、歯科用ダイヤモンドポイントを用いて、歯冠を水平方向に切断し、歯科用リーマーを用いて歯髄組織を回収した。得られた歯髄組織を、3mg/mLのI型コラゲナーゼ及び4mg/mLのディスパーゼの溶液中で37℃にて1時間消化した。ついで、この溶液を70mmの細胞ストレーナ(Falcon社製)を用いて濾過した。
その後、一次培養細胞を上記の培地を用いて約1×104細胞/cm2濃度で継代培養した。1〜3回継代した細胞を実験に用いた。以上のようにして、ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞(SHED)を得た。上記のようにして得られたブタ乳歯歯髄幹細胞、ブタ脂肪幹細胞及びヒト乳歯歯髄幹細胞をそれぞれバイアルに入れ、マイナス80度で凍結保存した。
(1)細胞のセットアップ
(1−1)ブタ歯髄幹細胞及びブタ脂肪幹細胞の培養
ブタ歯髄幹細胞及びブタ脂肪幹細胞の培養には、培養培地(10%FBSを含むDMEM(GIBCO社製))を使用した。15mLの遠心チューブに、10mLの上記培養培地を加えた。ブタ歯髄幹細胞の保存用バイアルを37℃のウォーターバスで温めて急速融解し、上記の遠心チューブに加えた。200xgで3分間、室温にて遠心した。上清を除去して、10mLの培養培地を加えて懸濁液とし、その一部を取ってトリパンブルー染色を行ない、血球計算盤を用いて細胞数を計測した。結果は、5x105cells/vialであった。
ヒト歯髄幹細胞の培養には、10%FBSを含むDMEM(SIGMA社製)を使用した以外は、上記(1−1)と同様の操作を行なった。なお、細胞数の計測結果は、1.0x105cells/vialであった。
(1)レンチウイルスベクター遺伝子導入細胞の作製
上記のようにセットアップした細胞のうちの生細胞数を、トリパンブルー染色と血球計算盤とを使用して計数し、培養培地が入った直径10cmのディッシュに1×106cells/10mLとなるように播種し、37℃のCO2インキュベーター内で約24時間培養した。細胞密度が7〜9割のコンフルエントに達したところで、1×104cells/mLの濃度に希釈して継代を行った。また、以下のようにマイコプラズマ感染の有無を確認した。
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit(Lonza社製、LT07-318)を使用して、マイコプラズマ感染の有無を確認した。
96ウェルプレート(コーニング社製、平底)にMycoplasma Alert試薬を100μL/ウェルで加えた。ここに、ブタ歯髄幹細胞又はブタ脂肪幹細胞の培養上清を、100μL/ウェルで加えた(各6ウェル)。各ウェルについて5回ずつ、ピペッティングを行なった。室温で5分間静置し、ドライヤーを用いて気泡を除去した。Kinetic Cycles 5でルミノメーター(Tecan(infinite 200、マルチ検出モードマイクロプレートリーダー))を用いて測定Aを行なった。
R=測定値Bの平均/測定値Aの平均
ポリブレン試薬を用いて、上記実施例1で作製したレンチウイルスベクターを、上記実施例3で得た各幹細胞に感染させ、GENETICIN添加培地により、目的遺伝子の安定発現株を選択した。
その後、上清を除去し、ブタ乳歯歯髄幹細胞及びブタ脂肪幹細胞の場合、8μg/mLのポリブレン及び10%FBSを含むDMEM培地を750μL/wellずつ添加し、次いで、各ウェルに実施例1で得られた上記のレンチウイルスベクター溶液を250μL/wellずつ添加した。
以上のように培養した6ウェルプレートの各ウェルから培養上清を除去し、0.4 mg/mL又は0.8 mg/mLのGENETICIN(G418、GIBCO社製)を含む選択用培地に交換した(2 mL/well)。以後、培地交換を行いながら3〜5日間培養し、遺伝子導入細胞の選択を行った。薬剤選択は、ブタ歯髄幹細胞、ブタ脂肪幹細胞及びヒト歯髄幹細胞のいずれについても、同様に行った。
総RNA(トータルRNA)の調製には、NucleoSpin RNA II (MACHEREY-NAGEL社製のキット)を用いた。先ず、発現確認用のRNA抽出用に、5×105個の細胞ペレットを作製した。ここに、350μLのRA1バッファー(上記のキットに付属している)及び0.22μmのフィルターで滅菌した7μLの1M DTT(ジチオトレイトール)を加えて良く混合し、細胞を溶解させて溶解液を得た。コレクションチューブにセットした紫色のリングフィルター(上記のキットに付属している)にこの溶解液を入れ、11,000×gで1分間遠心した。遠心後、フィルターを捨て、コレクションチューブに350μLの70%エタノールを加えて、5回ピペッティングを行い、RNAの結合条件を調整した。
上記のようにして得られた総RNA試料から、PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real time、TaKaRa Bio社製)を用いて逆転写を行った。
上記のようにして得た総RNAサンプルを、上記のキットに付属しているEASY Dilutionを用いて、下記表6に示すように、20ng/μLに希釈した。
350μLのSYBR Premix Ex Taq II(x2)、28μLのPrimer mix(10μM)、266μLの二回蒸留水を混合してリアルタイムPCR用Premixを調製した。プライマーは、終濃度を0.4μMで使用した。標準遺伝子として、ブタβ−アクチン、ヒトβ−アクチンを使用した。下記表7に示す塩基配列のプライマーをPCRで使用した(配列表の配列番号10〜15)。また、下記表8に示すように、標準サンプルを調製した。
*3:ヒトパピローマウイルスE7、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)
*4:bmi、hTERT
*5:bmi、ヒトパピローマウイルスE6、hTERT
*6:bmi、ヒトパピローマウイルスE6、ヒトパピローマウイルスE7、hTERT
上記のリアルタイムPCRの二次微分曲線から算出したCt値をX軸に、トータルRNAの相対値をY軸に、それぞれプロットし、各遺伝子の検量線を作成した。この検量線から各遺伝子の発現量を算出し、導入遺伝子の発現量を、それぞれの内部標準遺伝子であるβアクチンの発現量で割ることにより、サンプル間の補正を行った。
以上より、発現効率に種差及び相違はあるものの、上記の遺伝子導入細胞では、導入された遺伝子がすべて発現していることが確認された。
(1)レトロウイルスベクター遺伝子導入細胞の作製
上記のようにセットアップした細胞のうちの生細胞数を、トリパンブルー染色と血球計算盤とを使用して計数し、培養培地が入った直径10 cmのディッシュに6×106 cells/10 mLとなるように播種し、37℃のCO2インキュベーター内で約24時間培養した。細胞密度が7〜9割のコンフルエントに達したところで、6×104cells/mLの濃度に希釈して継代を行った。また、マイコプラズマ感染の有無については、上記実施例5と同様に行った。判定結果はすべて陰性であった。
上記実施例2で作製したレトロウイルスベクターを、上記実施例3で得た各幹細胞に感染させ、GENETICIN添加培地により、目的遺伝子の安定発現株を選択した。このときの不死化遺伝子搭載レトロウイルスベクター中の遺伝子の組合せは、細胞A-1及びA-2が(hTERT, HPV16_E6, HPV16_E7)の3遺伝子、細胞B-1及びB-2が(hTERT, hBmi-1, HPV16_E6, HPV16_E7)の4遺伝子であった。感染に際しては、細胞A-1及びB-1は、レトロウイルスベクター溶液を4倍に希釈して調製し、細胞A-2及びB-2は、レトロウイルスベクターを10倍に希釈して調製した。
総RNAの調製は、NucleoSpin RNA II (MACHEREY-NAGEL社製のキット)を用いて、上記実施例5と同様に行った。各細胞ペレットから得られた総RNAの抽出結果を下記表12に示す。
(4−1)逆転写反応
上記のようにして得られたトータルRNAサンプルから、逆転写反応キット(PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real time、TaKaRa Bio社製))を用いて逆転写反応を行った。
12.5μLのSYBR Premix Ex Taq II(x2、終濃度は1倍)、0.5μLのPCR Primer mix(10μM、終濃度は各0.2μM)、2.0μLの逆転写反応液、及び10.0μLの滅菌蒸留水を混合してリアルタイムPCR用Premix(25.0μL)を調製した。プライマーは、終濃度を0.4μMで使用した。標準遺伝子としてヒトβ−アクチンを使用した。上記表7に示す塩基配列のプライマーをPCRで使用し(配列表の配列番号10〜15)、上記表8に示すように、標準サンプルを調製した。
上記のリアルタイムPCRの二次微分曲線から算出したCt値をX軸に、総RNAの相対値をY軸に、それぞれプロットし、各遺伝子の検量線を作成した。この検量線から各遺伝子の発現量を算出し、導入遺伝子の発現量を、それぞれの内部標準遺伝子であるβアクチンの発現量で割ることにより、試料間の補正を行った。
(1)材料と方法
シングルセルクローニング用の細胞として、実施例5で調製した遺伝子導入細胞を使用した。また、使用する培養培地や選択薬剤、逆転写反応やリアルタイムPCRに使用するキットや試薬等は、実施例1〜6に記載したものと同様であり、培養方法その他の実験方法、及び各種条件も同様とした。
上記導入遺伝子安定発現細胞集団を、60mmディッシュに1×103個/ディッシュの細胞濃度となるように播種し、CO2インキュベーター中にて、37℃にて24時間培養した。その後、上記選択薬剤(G418)を含む生育培地(10%FBSを含むDMEM)に交換し、培養を継続してコロニーを形成させた。上記実施例4及び5と同様に、形成されたコロニーを、クローニングリング及び剥離剤を用いてクローンごとに剥離させ、それぞれ24ウェルプレートに播種した。24ウェルプレートで増殖させた後に、60mmディッシュに播種して増殖させ、引き続き100mmディッシュ、次にT-225フラスコの順に播種して増殖させ、拡大培養を行った。遺伝子導入に使用したウイルスベクターは上記と同様とした。
ブタ乳歯歯髄幹細胞由来の導入遺伝子安定発現細胞株については、2回のシングルセルクローニングを行ない、下記表14に示す5クローンを取得した。ブタ脂肪幹細胞由来の導入遺伝子安定発現細胞株についても2回のシングルセルクローニングを行なったが、培養の過程で全ての細胞が死滅し、クローンは取得できなかった。
上記(3)で得られた遺伝子安定発現細胞株のクローン細胞について、導入遺伝子及び内包標準遺伝子の発現を、リアルタイムPCRを用いて測定した。上記実施例3と同様に、上記の表14に示されている各クローン細胞約5×105個から、NucleoSpin RNAを用いてトータルRNAを調製した。得られたトータルRNAを鋳型としてPrimeScript RT reagent Kitを用いて逆転写反応を行い、鋳型cDNAを得た。
上記リアルタイムPCRの二次微分曲線から算出したCt値をX軸に、トータルRNAの相対値をY軸にそれぞれプロットして、各遺伝子の発現量測定用の検量線を作成した。上記実施例6(5)と同様にして、サンプル間の補正を行なった。
下記表15〜17、図6(A)及び(B)に、Virus #1を用いて遺伝子を導入したプール細胞の発現量を1としたときの、ブタ歯髄幹細胞由来の導入遺伝子及びヒト歯髄幹細胞由来の導入遺伝子の発現量の相対値を、それぞれ示した。
また、得られたクローンを培養したときの顕微鏡写真を図10(A)〜(E)に示す。いずれも、細胞の大きさが良く揃って、きれいにコンフレントとなっており、正常に増殖していることが確認された。
配列番号2:細胞に導入する遺伝子を含むDNA断片の塩基配列(2)である。
配列番号3:細胞に導入する遺伝子を含むDNA断片の塩基配列(3)である。
配列番号4:細胞に導入する遺伝子を含むDNA断片の塩基配列(4)である。
配列番号6:細胞に導入する遺伝子を含むDNA断片の塩基配列(6)である。
配列番号7:細胞に導入する遺伝子を含むDNA断片の塩基配列(7)である。
配列番号8:細胞に導入する遺伝子を含むDNA断片の塩基配列(8)である。
配列番号9:細胞に導入する遺伝子を含むDNA断片の塩基配列(9)である。
配列番号11:PCR用プライマー(2)である。
配列番号12:PCR用プライマー(3)である。
配列番号13:PCR用プライマー(4)である。
配列番号14:PCR用プライマー(5)である。
配列番号15:PCR用プライマー(6)である。
配列番号17:PCR用プライマー(8)である。
配列番号18:PCR用プライマー(9)である。
配列番号19:PCR用プライマー(10)である。
幹細胞を培養したときに、その培養上清中に含まれる生体因子の量と組成とが、長期間に渡って安定している必要がある。このため、無限増殖は可能であるが、癌化していない不死化幹細胞の樹立に対する、強い社会的要請があった。
課題を解決するための手段
[0016]
本発明は、以上のような状況の下でなされたものである。
すなわち、本発明の第1の態様は、Bmi遺伝子、ヒトパピローマウイルスE6遺伝子及び/又は同E7遺伝子と、テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子(TERT)からなる群から選ばれる3つの遺伝子を含むDNA断片を作製する工程と;前記遺伝子を含むDNA断片を組み込んだウイルスベクターを作製する工程と;前記ウイルスベクターを哺乳類の歯髄幹細胞にトランスフェクトさせて前記遺伝子を同時に前記幹細胞に導入する工程と;前記遺伝子が導入された前記歯髄幹細胞を培養し、薬剤によって不死化幹細胞を選択する工程と;を備える不死化幹細胞の作製方法である。
[0017]
ここで、前記DNA断片は、(a)bmi−1遺伝子、ヒトパピローマウイルスE6遺伝子及びTERT遺伝子;又は(b)ヒトパピローマウイルスE6遺伝子、同E7遺伝子及びTERT遺伝子;のいずれかの遺伝子のセットを含むものであることが好ましい。また、前記テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子は、ヒト由来のものであることが好ましい。
[0018]
また、前記ウイルスは、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスからなる群から選ばれるいずれかのものであることが好ましく、レンチウイルスであることが好ましい。また、前記哺乳類の歯髄幹細胞は、ヒト歯髄幹細胞又はブタ歯髄幹細胞であることが好ましい。
[0019]
前記薬剤は、抗生物質であることが好ましく、GENETICINであることが好ましい。本発明の方法はまた、前記選択された不死化幹細胞をクローニングす
入を行った細胞とプール細胞における遺伝子発現の相対値を、(B)はウイルスベクター#3及び#4を用いて遺伝子導入を行った細胞とプール細胞における遺伝子発現の相対値をそれぞれ示すグラフである。
[0025]
[図7]図7は、レトロウイルスベクターpDON−5 Neoの構造を示す模式図である。図中、MCSはマルチクローニングサイトを示し、この部位に組み込むための制限酵素がPmaCI(1370)以下に列記されている。
[図8]図8は、ヒト歯髄幹細胞にウイルスベクターを感染させた後の遺伝子の増幅量を求めるための検量線である。
[図9]図9は、ヒト歯髄幹細胞にレトロウイルスベクターを感染させた後の遺伝子(hTERT)の発現量の相対値を示すグラフである。
[図10]図10は、本発明の方法で作製した不死化ブタ歯髄幹細胞、及び不死化ヒト歯髄幹細胞をそれぞれ培養したときの顕微鏡像((A)〜(E))である。
発明を実施するための形態
[0026]
本発明の不死化幹細胞の作製方法は、上述した通り、(1)Bmi−1遺伝子、ヒトパピローマウイルスE6遺伝子及び/又は同E7遺伝子と、テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子(TERT)から成る群から選ばれる3つの遺伝子を含むDNA断片を作製する工程と;(2)前記遺伝子を含むDNA断片を組み込んだウイルスベクターを作製する工程と;(3)前記ウイルスベクターを哺乳類の歯髄幹細胞にトランスフェクトさせて前記遺伝子を前記幹細胞に同時に導入する工程と;(4)前記遺伝子のセットが導入された前記幹細胞を培養し、薬剤によって不死化幹細胞を選択する工程と;を備えている。
[0027]
上記(1)〜(4)の作製方法を用いることにより、不死化のために導入された遺伝子すべてが安定して発現している幹細胞を得ることができる。一方で、このようにして得られた不死化幹細胞は、染色体上の同じ位置に遺伝子が導入されたものではなく、異なる位置に遺伝子が組み込まれた複数の細胞が混在する集団(以下、単に「プール細胞」ということがある。)として得られる。このため、こうしたプール細胞をさらに選別するためのクローニング工程をさらに備えるものとすることができる。
以下に、本発明の方法及びその方法を用いて産生された不死化幹細胞をさらに詳細に説明する。
[0028]
1.DNA断片の作製及びウイルスベクター作製工程
1.1 ウイルス組込み用DNA断片の作製
まず、ウイルスにDNA断片を組み込むために使用するベクターの配列情報を入手する。本発明の方法で、遺伝子導入用ベクターとして使用するウイルスは、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスからなる群から選ばれるいずれかのものであることが、導入した遺伝子が一過性ではなく発現されることから好ましい。レンチウイルスを使用することが、導入遺伝子の安定発現株の産生効率が高いことから好ましい。
[0029]
以下に、レンチプラスミドベクター(pLVSIN)を使用した場合を例に挙げて説明する。pLVSINの配列情報を、例えば、タカラバイオウェブカタログからダウンロードし、マルチクローニングサイトを確認する。
[0030]
次いで、以下のようにしてDNA断片を作製する。本発明では、上記DNA断片に2〜4遺伝子を組み込んで、不死化幹細胞を作製する。使用する細胞は、哺乳類から得られる幹細胞であれば特に限定されないが、入手が容易で、かつ、形質が安定した不死化幹細胞を得ることができることから、ブタ歯髄組織又はヒト歯髄組織を使用することが好ましい。
[0031]
また、ここで導入する遺伝子は、2つのパピローマウイルスの初期遺伝子、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)、及びbmiからなる群から選ばれる少なくとも3以上の遺伝子のセットであることが、安定した形質を有する不死化幹細胞を作製できることから好ましい。また、前記パピローマウイルスの初期遺伝子は、ヒトパピローマウイルスE6、ヒトパピローマウイルスであることが、発現効率の点から好ましい。
[0032]
(a)bmi−1遺伝子、ヒトパピローマウイルスE6遺伝子及びTERT遺伝子;又は(b)ヒトパピローマウイルスE6遺伝子、ヒトパピローマウイルスE7遺伝子及びTERT遺伝子;のいずれかの遺伝子のセットを含むDNA断片を作製し、使用することがさ
Claims (10)
- Bmi、ヒトパピローマウイルスE6及びヒトパピローマウイルスE7からなる群から選ばれる少なくとも1以上の遺伝子と、テロメラーゼ逆転写酵素とを含む、DNA断片を作製する工程と;
前記遺伝子を含むDNA断片を組み込んだウイルスベクターを作製する工程と;
前記ウイルスベクターを哺乳類の幹細胞にトランスフェクトさせて前記遺伝子を前記幹細胞に導入する工程と;
前記遺伝子が導入された前記幹細胞を培養し、薬剤によって不死化幹細胞を選択する工程と;
を備える不死化幹細胞の作製方法。 - 前記DNA断片は、
(a)ヒトパピローマウイルスE7及びテロメラーゼ逆転写酵素(TERT);
(b)bmi-1及びTERT;
(c)bmi-1、ヒトパピローマウイルスE6及びTERT;
(d)ヒトパピローマウイルスE6、ヒトパピローマウイルスE7及びTERT;
(e)bmi-1、ヒトパピローマウイルスE6、ヒトパピローマウイルスE7、及びTERT;
からなる群から選ばれる、いずれかの遺伝子のセットを含むものであることを特徴とする、請求項1に記載の不死化細胞の作製方法。 - 前記テロメラーゼ逆転写酵素は、ヒト又はブタ由来のものであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の不死化幹細胞の作製方法。
- 前記ウイルスは、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスからなる群から選ばれるいずれかのものであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の不死化細胞の作製方法。
- 前記哺乳類の幹細胞は、ヒト歯髄幹細胞、ブタ歯髄幹細胞及びブタ脂肪幹細胞からなる群から選ばれるいずれかのものであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記不死化細胞の作製方法。
- 前記薬剤は、GENETICINであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の不死化細胞の作製方法。
- 前記選択された不死化幹細胞をクローニングする工程をさらに備える、請求項1に記載の不死化細胞の作製方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の不死化細胞の作製方法によって作製された、不死化幹細胞。
- 前記不死化幹細胞は、少なくとも200PD以上の分裂が可能であることを特徴とする、請求項8に記載の不死化幹細胞。
- 前記不死化幹細胞は、200PDの時点におけるSTRO-1の発現量が、不死化前の幹細胞とほぼ同等であることを特徴とする、請求項8又は9に記載の不死化幹細胞。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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KR102572595B1 (ko) * | 2020-12-02 | 2023-08-31 | 충북대학교 산학협력단 | 불멸화 고양이줄기세포 또는 이의 엑소좀풍부배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
KR102456805B1 (ko) * | 2020-12-02 | 2022-10-24 | 충북대학교 산학협력단 | 불멸화 개줄기세포 또는 이의 엑소좀풍부배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
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WO2023167243A1 (ja) * | 2022-03-01 | 2023-09-07 | 学校法人東京医科大学 | 不死化間葉系幹細胞の上清を含む脱髄疾患治療用医薬組成物、及びその組成物を有効成分とする医薬製剤 |
CN114574522A (zh) * | 2022-03-17 | 2022-06-03 | 浙江大学 | 一种电转染永生化猪成纤维细胞的方法 |
WO2023190271A1 (ja) | 2022-03-28 | 2023-10-05 | 株式会社リジェネシスサイエンス | miR-140を含む医薬組成物及びその製造方法 |
CN117327660A (zh) * | 2023-10-17 | 2024-01-02 | 安可来(重庆)生物医药科技有限公司 | 一种同时表达il1-rn和col17a蛋白永生化间充质干细胞系及其制备方法与应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004000497A (ja) * | 2002-04-23 | 2004-01-08 | Olympus Corp | 細胞移植治療材料およびその製造方法 |
JP2010046019A (ja) * | 2008-08-21 | 2010-03-04 | Toyama Univ | ヒト羊膜由来間葉系細胞及びこれを用いた糖尿病治療薬 |
WO2013118877A1 (ja) * | 2012-02-10 | 2013-08-15 | 株式会社ジャパニック | 非ヒト幹細胞の培養上清を原材料とする化粧品又は皮膚再生促進剤、及びタンパク質のイオン導入方法 |
WO2013147082A1 (ja) * | 2012-03-28 | 2013-10-03 | 株式会社クオリーメン | 不死化幹細胞及びその産生物を有効成分とする医薬組成物並びに医薬製剤 |
WO2014104246A1 (ja) * | 2012-12-26 | 2014-07-03 | 株式会社クオリーメン | 高機能インプラント材料 |
WO2016175164A1 (ja) * | 2015-04-27 | 2016-11-03 | 株式会社クオリーメン | シート状小片、その小片を含む発毛促進用シート、並びに、その小片を含む美白及び皺改善剤 |
JP2016210730A (ja) * | 2015-05-08 | 2016-12-15 | 上田 実 | 医薬組成物及びその製造方法並びに医薬品 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US663783A (en) * | 1900-08-14 | 1900-12-11 | American Telephone & Telegraph | Selective-signal system. |
US893260A (en) * | 1908-04-09 | 1908-07-14 | Clifton D Pettis | Brake-shoe. |
WO2010013359A1 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Gifu University | Efficient method for establishing induced pluripotent stem cells |
WO2011118795A1 (ja) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | 国立大学法人名古屋大学 | 損傷部治療用組成物 |
US10639355B2 (en) * | 2014-01-24 | 2020-05-05 | Quarrymen & Co. Inc. | Method of making conditioned medium from immortalized dental pulp stem cells |
JP6474549B2 (ja) * | 2014-03-03 | 2019-02-27 | 国立大学法人徳島大学 | 幹細胞の培養産物の評価指標及びその利用 |
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Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004000497A (ja) * | 2002-04-23 | 2004-01-08 | Olympus Corp | 細胞移植治療材料およびその製造方法 |
JP2010046019A (ja) * | 2008-08-21 | 2010-03-04 | Toyama Univ | ヒト羊膜由来間葉系細胞及びこれを用いた糖尿病治療薬 |
WO2013118877A1 (ja) * | 2012-02-10 | 2013-08-15 | 株式会社ジャパニック | 非ヒト幹細胞の培養上清を原材料とする化粧品又は皮膚再生促進剤、及びタンパク質のイオン導入方法 |
WO2013147082A1 (ja) * | 2012-03-28 | 2013-10-03 | 株式会社クオリーメン | 不死化幹細胞及びその産生物を有効成分とする医薬組成物並びに医薬製剤 |
WO2014104246A1 (ja) * | 2012-12-26 | 2014-07-03 | 株式会社クオリーメン | 高機能インプラント材料 |
WO2016175164A1 (ja) * | 2015-04-27 | 2016-11-03 | 株式会社クオリーメン | シート状小片、その小片を含む発毛促進用シート、並びに、その小片を含む美白及び皺改善剤 |
JP2016210730A (ja) * | 2015-05-08 | 2016-12-15 | 上田 実 | 医薬組成物及びその製造方法並びに医薬品 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
照沼裕,他: "不死化体性幹細胞の培養上清による糖尿病治療の安全性に関する臨床研究", 再生医療, vol. 第14巻増刊号, JPN6017000795, 1 February 2015 (2015-02-01), pages 327 - 02, ISSN: 0004462848 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11566223B2 (en) | 2017-06-01 | 2023-01-31 | Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. | Chimeric antigen receptor cell preparation and uses thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HK1257561A1 (zh) | 2019-10-25 |
CN108368501A (zh) | 2018-08-03 |
WO2017078176A1 (ja) | 2017-05-11 |
EP3372681A4 (en) | 2019-07-03 |
CN116064386A (zh) | 2023-05-05 |
EP3372681A1 (en) | 2018-09-12 |
JP6868565B2 (ja) | 2021-05-12 |
US11015171B2 (en) | 2021-05-25 |
US20190017030A1 (en) | 2019-01-17 |
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