CN108368501A

CN108368501A - 永生化干细胞及其制作方法

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Publication number: CN108368501A
Application number: CN201680070984.8A
Authority: CN
Inventors: 山下靖弘
Original assignee: QUARRYMEN CORP
Current assignee: QUARRYMEN CORP
Priority date: 2015-11-05
Filing date: 2016-11-07
Publication date: 2018-08-03
Also published as: EP3372681A1; WO2017078176A1; US20190017030A1; JP6868565B2; CN116064386A; EP3372681A4; JPWO2017078176A1; HK1257561A1; US11015171B2

Abstract

本发明的目的在于提供产生能够用于人的疾病治疗的培养上清的永生化干细胞。本发明提供一种永生化干细胞的制作方法，其具备下述步骤：制作DNA片段的步骤，该DNA片段包含选自由Bmi‑1、人乳头瘤病毒E6和人乳头瘤病毒E7组成的组中的至少1种以上的基因、以及端粒酶逆转录酶；制作插入有包含上述基因的DNA片段的病毒载体的步骤；使上述病毒载体转染到哺乳类的干细胞中而将上述基因导入到上述干细胞中的步骤；以及对导入有上述基因的上述干细胞进行培养，利用试剂选择出永生化干细胞的步骤。

Description

永生化干细胞及其制作方法

技术领域

本发明涉及永生化干细胞及其制作方法。更详细地说，本发明涉及导入了包含端粒酶逆转录酶的多个基因的永生化干细胞及其制作方法。

背景技术

生物体的功能可能由于疾病、外伤等而受到损伤。这样的损伤有可能为能够自然愈合的程度，但也可能超出能够自然愈合的程度。并且，对于超出自然愈合的程度的损伤，如果可能，优选使其复原。

使这样的受到损伤的生物体的功能复原的方法大致可分为移植医疗和再生医疗。移植医疗是指接受由供体提供的脏器并通过移植该脏器而使生物体的功能复原。

与之相对，再生医疗是指对包括本人在内的几个人的细胞或组织进行培养，对其进行加工，由此对丧失的组织或脏器进行修复或再生的医疗。并且，在该再生治疗中使用干细胞等。目前，在再生医疗中实际应用的、或者被认为能够应用于再生治疗的干细胞已知有人成体干细胞、人胚胎干细胞(ES细胞)以及人诱导多能干(iPS)细胞这3种。

此处，已经在研究中使用的人成体干细胞是存在于成人的组织中的细胞，因而若进行利用自体细胞的自体移植，则不会产生因免疫应答所致的排斥反应，成活也良好。此外，没有这些干细胞的长期培养会导致肿瘤化的报告。但是，已知：除了存在于骨髓或脂肪组织中的“间充质干细胞”以外，成体干细胞仅能分化成特定的组织、器官或脏器。另外还已知：在由人体组织进行采集时会伴有侵袭；并且培养可传代数短、为四十几次，以天数计为100～200天。

人胚胎干细胞(ES细胞)是将生殖医疗等中产生的剩余胚胎(囊胚)中的“内细胞团”取出、并对其进行培养而得到的干细胞。由于其形成作为具有多分化潜能性的指标的畸胎瘤，因而认为其能够分化为三胚层中的任意层，还有报告称其分化为心肌、神经、视网膜。已知ES细胞为永生化的细胞株，因而能够将一个细胞株无限地持续培养，在适当的培养条件下，能够以细胞的形式大量制造出均匀的制品。

另一方面，由于在ES细胞的制作中利用受精卵，因而需要有严格的对策以使其在提供时不会产生伦理问题。并且，由于其基本上为异体移植，因而需要处理因免疫应答所致的排斥反应。此外还已知：在细胞培养时，需要使用异种细胞或血清；并且当移植后的再生组织中混有即使少量的未分化细胞时，也会容易形成畸胎瘤(良性肿瘤)。

人诱导多能干(iPS)细胞是通过将在ES细胞中特异性表达的基因的一部分导入到成人细胞(皮肤等)中而确立的。若使用自体来源的iPS细胞，则不会产生免疫排斥的问题，能够直接应用ES细胞的分化技术。并且，iPS细胞不像ES细胞那样利用受精卵，能够使用成人组织来制作与胚胎干细胞大致同样性质的细胞，若利用自体来源的iPS细胞，也不会存在因免疫反应所致的排斥反应的问题。

另一方面，已知其不仅容易良性肿瘤化、而且还容易恶性肿瘤(胚细胞癌)化；并且由于从导入有基因的全部细胞中选择形态上与ES细胞类似的细胞，因而被确立为iPS细胞的细胞比例低。

在将干细胞本身用于再生治疗中时，由于具有上述这样的问题，因而摸索出了不使用各种干细胞本身、而使用它们产生的各种生物因子、例如各种生长因子的方法(W02011/118795号，下文中称为“现有技术1”)。

在现有技术1中公开了在非永生化细胞所产生的培养上清中包含血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板来源生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)等生长因子；以及将它们作为损伤部治疗用的试剂用于特定组织的损伤的恢复/再生。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO 2011/118795号

发明内容

发明所要解决的课题

但是，现有技术1中公开的是由正常细胞确立的细胞株。一般来说，已知正常细胞在每次传代时端粒缩短，在50～60次传代后细胞无法分裂而迎来死亡。

即，现有技术1中公开的细胞是会老化的细胞，具有随着细胞的老化、即随着时间的经过，所产生的生物因子的组成也发生变化的问题。这意味着无法获得固定组成的培养上清，导致无法提供稳定品质的治疗剂的问题。因此，对于能够无限增殖的细胞株的确立具有强烈的社会需求。

另一方面，正常细胞作为其本来的性质无法进行无限增殖。作为天然存在的无限增殖细胞的示例，已知有肿瘤细胞(癌细胞)。癌细胞能够无限增殖通常是由于生物体无法控制适当的分裂和增殖而变得无限制地增殖。并且还已知癌细胞会产生对生物体有害的生物因子。因此，即使是能够无限增殖的细胞，癌变的细胞甚至连其培养上清也无法使用。

即，为了将培养上清用作药物组合物，在对上述永生化干细胞进行培养时，其培养上清中含有的生物因子的量和组成需要长期稳定。因此，对于能够无限增殖但未发生癌变的永生化干细胞的确立具有强烈的社会需求。

用于解决课题的手段

本发明是在上述情况下完成的。

即，本发明的第1方式为一种永生化干细胞的制作方法，其具备下述步骤：制作DNA片段的步骤，该DNA片段包含选自由Bmi、人乳头瘤病毒E6和人乳头瘤病毒E7组成的组中的至少1种以上的基因、以及端粒酶逆转录酶；制作插入有包含上述基因的DNA片段的病毒载体的步骤；使上述病毒载体转染到哺乳类的干细胞中而将上述基因集导入到上述干细胞中的步骤；以及对导入有上述基因集的上述干细胞进行培养，利用试剂选择出永生化干细胞的步骤。

此处，上述DNA片段优选包含选自由下述(a)～(e)组成的组中的任一基因集：(a)人乳头瘤病毒E7和端粒酶逆转录酶(TERT)；(b)bmi-1和TERT；(c)bmi-1、人乳头瘤病毒E6和TERT；(d)人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7和TERT；(e)bmi-1、人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7和TERT。另外，上述端粒酶逆转录酶优选来源于人或猪。

另外，上述病毒优选为选自由慢病毒、腺病毒、逆转录病毒组成的组中的任一种，优选为慢病毒。另外，上述哺乳类的干细胞优选为选自由人牙髓干细胞、猪牙髓干细胞和猪脂肪干细胞组成的组中的任一种。

上述试剂优选为抗生素，优选为遗传霉素GENETICIN。本发明的方法还优选进一步具备将上述选择出的永生化干细胞进行克隆的步骤。

本发明的第2方式为一种永生化干细胞，其是利用永生化干细胞的制作方法制作的。此处，上述永生化干细胞优选能够进行至少200次群体倍增(PD)以上的分裂。另外，上述永生化干细胞在200次群体倍增的时刻的STRO-1的表达量优选与永生化前的干细胞大致相等。

发明的效果

根据本发明，由于在染色体中插入上述的基因，因而这些基因得到稳定地表达。因此，可高效地得到能够进行至少200次群体倍增以上的分裂的永生化干细胞。

另外，由于所导入的基因数为2种以上即可，因而与导入多种基因的情况相比，能够通过简便的操作得到永生化干细胞。

附图说明

图1是示出慢病毒质粒载体pLVSIN-CMV Neo的结构的示意图。

图2是示出所制作的慢病毒质粒载体是否存在于细胞内的确认结果的图。图2(A)示出阳性对照、图2(B)示出SYN4122-1-7、图2(C)示出SYN4122-2-2、图2(D)示出SYN4122-3-3、图2(E)示出SYN4122-4-4。

图3是转染质粒的琼脂糖凝胶电泳图像。

图4是用于求出使病毒载体感染猪乳牙牙髓干细胞或猪脂肪干细胞后的基因的扩增量的校正曲线。

图5是示出使病毒载体感染猪乳牙牙髓干细胞或猪脂肪干细胞后的基因的扩增的相对值的图。

图6是示出使用病毒载体导入基因后的细胞群(池细胞(pool cell))或克隆后的各细胞中的基因表达量的相对值的图。图6(A)是示出使用病毒载体#1和#2进行了基因导入的细胞与池细胞中的基因表达的相对值的图，图6(B)是示出使用病毒载体#3和#4进行了基因导入的细胞与池细胞中的基因表达的相对值的图。

图7是示出逆转录病毒载体pDON-5 Neo的结构的示意图。图中，MCS表示多克隆位点，用于插入到该部位的限制酶列记在PmaCI(1370)以下。

图8是用于求出使病毒载体感染人牙髓干细胞后的基因的扩增量的校正曲线。

图9是示出使逆转录病毒载体感染人牙髓干细胞后的基因(hTERT)的表达量的相对值的图。

图10是将利用本发明的方法制作的永生化猪牙髓干细胞以及永生化人牙髓干细胞分别进行培养时的显微镜图像((A)～(E))。

具体实施方式

如上所述，本发明的永生化干细胞的制作方法具备下述步骤：(1)制作DNA片段的步骤，该DNA片段包含导入到哺乳类的干细胞中的基因；(2)制作插入有包含上述DNA片段的基因的病毒载体的步骤；(3)使上述病毒载体转染到哺乳类的干细胞中而将上述基因导入到上述干细胞中的步骤；以及(4)对导入有上述基因集的上述干细胞进行培养，利用试剂选择出永生化干细胞的步骤。

通过采用上述(1)～(4)的制作方法，能够得到为了永生化而导入的基因全部稳定地表达的干细胞。另一方面，这样得到的永生化干细胞并非为在染色体上的相同位置导入有基因的细胞，而是以在不同位置插入有基因的多种细胞混合存在的细胞群的形式得到的(在下文中，有时将这样的细胞群简称为“池细胞”)。因此，可以进一步具备用于对这样的池细胞进一步进行筛选的克隆化步骤。

以下对本发明的方法及使用该方法产生的永生化干细胞进一步进行详细说明。

1.DNA片段的制作和病毒载体制作步骤

1.1病毒插入用DNA片段的制作

首先，获得为了在病毒中插入DNA片段而使用的载体的序列信息。在本发明的方法中，从所导入的基因并非瞬时性地表达的方面出发，优选作为基因导入用载体使用的病毒为选自由慢病毒、腺病毒、逆转录病毒组成的组中的任一种。从导入基因的稳定表达株的产生效率高的方面出发，优选使用慢病毒。

以下举出使用慢病毒质粒载体(pLVSIN)的情况为例进行说明。从例如宝生物网站目录中下载pLVSIN的序列信息，确认多克隆位点。

接着，如下制作DNA片段。在本发明中，在上述DNA片段中插入2～4个基因来制作永生化干细胞。所使用的细胞只要是从哺乳类获得的干细胞就没有特别限定，从容易获得、并且能够得到性状稳定的永生化干细胞的方面出发，优选使用猪牙髓组织、猪脂肪组织以及人牙髓组织。

另外，从能够制作出具有稳定性状的永生化干细胞的方面出发，优选此处所导入的基因为选自由2种乳头瘤病毒的早期基因、端粒酶逆转录酶(TERT)以及bmi组成的组中的至少2种以上的基因集。另外，从表达效率的方面出发，优选上述乳头瘤病毒的早期基因为人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7。

更优选制作包含下述(a)～(e)中的任一基因集的DNA片段来使用：(a)人乳头瘤病毒E7和端粒酶逆转录酶(TERT)；(b)bmi和TERT；(c)bmi、人乳头瘤病毒E6和TERT；(d)人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7和TERT；(e)bmi、人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7以及TERT。从基因的表达效率的方面出发，TERT优选使用hTERT。

上述基因之中，TERT是编码使随着年龄增长而缩短的端粒序列延长的酶的基因。已知人乳头瘤病毒E6和E7均为人乳头瘤病毒的早期基因，E6导致TERT的再活化或对具有PDZ结构域的蛋白质进行分解。已知bmi-1是多梳家族基因，与干细胞的自体复制和分化调控相关。

通过插入上述这样的基因集，能够确认以何种组合导入这样的基因时它们能够高效地表达、细胞能够永生化。

以下对制作慢病毒载体并导入2种基因的情况进行说明。为了插入作为上述(a)的基因集的人乳头瘤病毒E7的基因和端粒酶逆转录酶(TERT)，按照序列信息通过标准的程序合成例如EcoRI/KoZal/E7/T2A4/hTERT/BamHI的双链DNA(序列表的序列编号1)。将所得到的DNA片段通过标准的程序克隆化至上述慢病毒质粒载体(pLVSIN-CMV Neo)的多克隆位点，能够得到插入有上述2种基因的慢病毒载体(E7T)。

同样地，在导入不同的2种基因的情况下、例如在导入上述(b)的基因集的情况下，首先按照标准的程序合成包含Bmi-1的EcoRI/KoZal/Bmi-1/T2A4/hTERT/BamHI的双链DNA(序列表的序列编号2)。将所得到的DNA片段通过标准的程序克隆化至上述慢病毒质粒载体(pLVSIN-CMV Neo)的多克隆位点，能够得到插入有上述2种基因的慢病毒载体(BT)。

同样地，在导入3种基因的情况下，按照序列信息合成T2A3E6的双链DNA，插入到上述(v2)中制作的慢病毒载体的Bmi-1与T2A4之间，制作EcoRI/KoZal/Bmi-1/T2A3/E6/T2A4/hTERT/BamHI的双链DNA(序列表的序列编号3)。将所得到的DNA片段通过标准的程序克隆化至上述慢病毒质粒载体(pLVSIN-CMVNeo)的多克隆位点，能够得到插入有上述3种基因的慢病毒载体(BE6T)。

同样地，在导入4种基因的情况下，合成E6T2A3的双链DNA，插入到上述(d)中制作的慢病毒载体E7T的Kozak序列与E7之间，按照标准的程序合成EcoRI/KoZal/E6/T2A3/E7/T2A4/hTERT/BamHI(序列表的序列编号4)。将所得到的DNA片段通过标准的程序克隆化至上述慢病毒质粒载体(pLVSIN-CMV Neo)的多克隆位点，能够得到插入有上述3种基因的慢病毒载体(E6E7T)。以上这样的DNA片段的合成可以委托受托进行DNA合成的企业来进行。

在逆转录病毒的情况下，与慢病毒载体的情况不同，制作插入有单个基因的载体并通过共感染进行导入。例如，按照常规方法制备在起始密码子的上游附加有Kozak序列(gccacc)的5种永生化基因(hTERT(序列表的序列编号5)、人乳头瘤病毒的E6(序列表的序列编号6)和人乳头瘤病毒的E7(序列表的序列编号7)、pigTERT(序列表的序列编号8)以及hBmi-1(序列表的序列编号9))，按照常规方法克隆化至pDON-5 NEO DNA(Takara编号3657：参照图7)的PmaC I-Hpa I位点，能够制备出逆转录病毒质粒载体(pDON-5 Neo hTERT载体、pDON-5 Neo HPV16E6载体、pDON-5 Neo HPV16E7载体、pDON-5 Neo pHTERT载体和pDON-5Neo hBmi1载体)。

之后，使用如上制作的5种质粒DNA，按照常规方法转化大肠杆菌，将所得到的转化体在CO₂温箱中培养，能够得到转染级别的质粒DNA。

接着，将G3T-hi细胞以5.5～6.5×10⁶个/皿接种在所期望的微孔板中，在5％CO₂温箱中在约37℃培养约20～28小时，加入期望量的转染试剂(例如0.3～0.5mL的TransIT-293)，从上述5种质粒载体中选择出3种，共导入pGP和pE-Ampho(均为逆转录病毒包装试剂盒Ampho所附带的载体))，进一步在相同条件下进行40～56小时培养，能够导入这些基因。

1.2载体产生细胞的制备

与上述作业并行地，准备重组慢病毒载体产生细胞。作为这样的细胞株，可以使用例如Lenti-X 293T(Clontech公司制造、编号：632180)等市售的细胞株。Lenti-X 293T的培养中可以使用含有胎牛血清和抗生素的培养基。作为这样的培养基，例如可以举出最低必需培养基(MEM)、杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)等。例如，从细胞的增殖效率的方面出发，优选使用含有5～15％胎牛血清(FBS、HyClone公司制造)、0.5～2％抗生素(青霉素/链霉素、Gibco公司制造)的DMEM(SIGMA公司制造、圣路易斯、MO)等。

例如，也可以制备含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM并将该培养基用作基本培养基。以下，在本说明书中，将培养基称为“293T基本培养基”。

例如，在使用Lenti-X 293T作为上述细胞株的情况下，制备1～5×10⁵细胞/mL的细胞悬浮液，将该悬浮液10mL加入至10cm培养皿中，在5％CO₂温箱中培养约24小时，之后，根据细胞的状态进行传代直到使用为止。在使用时，首先除去持续传代的细胞的培养上清，用PBS清洗，加入市售的剥离剂将细胞从培养皿剥离并回收。接着，取期望量的约3～5倍稀释的细胞悬浮液，加入台盼蓝染色液，使用血细胞计数板计数活细胞数。加入上述基本培养基，制备约5×10⁵细胞/mL的细胞悬浮液，以例如期望的浓度接种在培养皿中，在期望的条件下进行培养。例如，以1～4×10⁶细胞/4mL将上清细胞接种在直径6cm的胶原包被培养皿中，之后在5％CO₂温箱中在约37℃培养约24小时，更换培养基，进一步继续培养。

另外，作为逆转录病毒制备细胞，优选使用G3T-hi细胞，其是使用潮霉素抗性基因向来源于人肾脏的细胞株293T(G418抗性)中导入人N-乙酰葡糖胺基转移酶III(N-acetylglucosaminyltransferase III：GnT-III)而得到的GnT-III高表达细胞株(宝生物株式会社制造)。

上述G3T-hi细胞是如下进行设计的：使用逆转录病毒包装试剂盒Eco或Ampho(宝生物株式会社制造、产品编码6160、6161)，共导入插入有gag-pol、env基因的表达载体质粒和目的基因的重组逆转录病毒载体质粒，由此能够迅速且瞬时性地产生高滴度的重组病毒。并且其原因在于，由于上述G3T-hi细胞来源于293T，因而导入有SV40的T抗原基因，在该基因的作用下逆转录病毒的RNA被扩增，得到高滴度的病毒液。通常，通过使用逆转录病毒包装试剂盒的瞬时性表达，可得到包含10⁵～10⁷cfu/mL的病毒的溶液。

在上述G3T-hi细胞中，细胞膜糖链被GnT-III进行修饰。据推测，由于出芽的逆转录病毒缠绕宿主细胞膜，因而由上述G3T-hi细胞得到的重组逆转录病毒的膜蛋白质的糖链受到GnT-III的修饰。通过该糖链修饰，使用上述G3T-hi细胞制备的逆转录病毒对RetroNectin(重组人纤连蛋白片段)的亲和性增高，因而通过使用RetroNectin作为培养器的包被剂，可大幅提高基因向靶细胞的导入效率。RetroNectin在以血细胞系细胞为靶标的基因导入中是特别有效的。

在使用G3T-hi细胞的情况下，从逆转录病毒的产生效率的方面出发，优选代替上述293T基本培养基而使用在包含葡萄糖(4.5g/L)和L-谷氨酰胺(584mg/L)的DMEM中添加10％FBS和1％青霉素/链霉素而成的培养基。

1.3病毒载体的制作

以下举出慢病毒载体的情况为例进行说明。

在加入有按以上说明进行培养的细胞的多个培养皿中分别加入如上制作的慢病毒载体质粒，进行共转染。这样的共转染可以使用市售的包装系统、例如Lenti-X HTX包装系统(Clontech公司制造)等。具体的程序按照这种系统附带的手册进行即可。

共转染结束后，将培养基更换成新鲜的完全培养基，在约37℃培养24～48小时。进行病毒载体的滴度测定来确定回收的时机，在病毒滴度达到最大的时刻回收包含病毒载体的培养上清。病毒载体的滴度测定可以使用市售的简易滴度测定试剂盒，作为这样的试剂盒，例如可以举出Lenti-X GoStix(Clontech公司制造)等。

例如，在更换培养基的翌日，用期望大小的注射器吸取、回收上述培养皿的培养上清，对回收的培养上清进行过滤，得到病毒载体。例如，用10mL的一次性注射器(TERUMO株式会社制造)吸取培养上清，之后在该注射器上安装例如0.45μm的过滤器(MILEX-HV、Millipore公司制造)，一边对注射器内的培养上清进行过滤，一边将病毒载体溶液回收到例如15mL管中。

接着，使用市售的简易滴度测定试剂盒中包含的试剂，确认重组慢病毒载体的存在。例如，可以在上述的Lenti-X GoStix的S中加入期望量的病毒载体溶液、例如20μL，进一步添加Chase缓冲液1，在室温使其反应期望的时间、例如10分钟，通过有无条带来确认重组慢病毒载体的存在。

将如上得到的包含4种质粒(E7T、BT、BE6T和E6E7T)的细胞在琼脂培养基上划线，挑取所形成的集落，接种在期望量的培养基、例如包含抗生素的约2mL的LB培养基中，在约37℃一边剧烈搅拌一边振荡培养约8小时。

接着，将期望量、例如100μL的如上培养的细胞的培养液移植到包含不同的抗生素、例如氨苄青霉素的LB培养基例如约50mL中，在约37℃一边剧烈搅拌一边振荡培养约14～18小时。

使用市售的试剂盒、例如MN NucleoBond Xtra Mid试剂盒(Clontech公司制造)，测定用水洗脱的质粒的量。与此同时，利用期望的凝胶、例如约1％的琼脂糖凝胶进行分析，确认所插入的DNA各不相同。作为凝胶电泳分析的标记物，可以使用例如超螺旋DNA梯状条带、λ-Hind III消化DNA等。如上能够制作出病毒载体。

2.哺乳类的干细胞的制备

2.1猪牙髓干细胞的制备

获得出生后5～6个月的猪的颌骨(带有下颌齿的下颌骨)和肠系膜。按照以下的程序从上述猪的牙齿和下颌骨得到猪的牙髓干细胞(下文中有时称为“SHED”)。

首先，将上述猪的牙齿和下颌骨用适当的消毒剂、例如用聚维酮碘(ISODINE)消毒。之后，使用例如齿科用金刚石划针将下颌齿的牙冠在水平方向切断，接着，沿垂直方向切削而除去髓腔顶。使用例如齿科用手术用刮垢器从牙冠和牙根部采集牙髓。

利用例如眼科用穿刺刀将所得到的牙髓切碎，悬浮在期望的浓度、例如1～3mg/mL的胶原酶溶液中，在约37℃的恒温槽中放置期望的时间、例如1小时来分离细胞。将分离出的细胞在期望的培养基、例如包含10％FBS和1％Anti-Anti(Invitrogen公司制造、卡尔斯巴德、CA)的DMEM中在约37℃在5％CO₂温箱中进行预培养，得到传代用的细胞。

首先，一边以每周2～3次的频率更换培养基一边进行培养，直至达到近汇合为止，使用剥离剂、例如包含0.05％胰蛋白酶的Hepes溶液将达到近汇合的细胞剥离，以期望的条件、例如室温下1,500rpm离心约3分钟来进行收集。将所得到的细胞转移到新鲜的培养基中，在与上述同样的条件下使用期望量、例如全部量进行传代培养。

2.2猪脂肪干细胞的制备

利用例如解剖用剪刀和穿刺刀从猪的肠系膜切出脂肪组织并收集，除去多余的组织，在生理盐水中冲洗血液。将所得到的脂肪细胞转移到期望的培养基、例如包含5～15％的牛血清和期望浓度的抗生素的DMEM中，在与上述相同的条件下进行预培养，接着在上述DMEM中在37℃、5％CO₂的条件下培养至达到近汇合为止。上述的添加量全部以最终浓度表示。作为这样的培养基，例如可以使用含有约10％牛血清、约100U/mL的青霉素和约100μg/mL的链霉素的DMEM。

与猪SHED同样地使用剥离剂进行剥离并进行离心分离，对所得到的细胞进行传代培养，能够得到脂肪干细胞。

2.3人乳牙牙髓干细胞的制备

获得由健康儿童得到的脱落乳牙或拔牙得到的乳牙。将这样的乳牙利用适当的消毒剂、例如聚维酮碘溶液消毒后，与得到猪的牙髓同样地回收牙髓组织。将所得到的牙髓组织在期望浓度的胶原酶和中性蛋白酶、例如约3mg/mL的I型胶原酶和约4mg/mL的中性蛋白酶的溶液中在期望的温度下消化期望的时间、例如在约37℃消化约1小时。接着，将该溶液使用例如70mm的细胞过滤网(Falcon公司制造)进行过滤，滤出细胞。

将这样滤出的细胞重悬浮在期望量、例如4mL的上述培养基中，接种在期望直径、例如直径6cm的贴壁性细胞培养用培养皿中。向其中添加期望的培养基、例如含有约10％FCS的DMEM，在调整为5％CO₂、37℃的温箱中培养期望的时间、例如2周左右。将形成了集落的贴壁性细胞(牙髓干细胞)利用期望的剥离剂、例如包含约0.05％胰蛋白酶的约0.2mMEDTA在约37℃下处理期望的时间、例如5分钟，回收从培养皿上剥离的细胞。

接着，将如上回收的贴壁性细胞接种在例如贴壁性细胞培养用培养皿(胶原包被培养皿)中，在调整为例如5％CO₂、37℃的温箱中进行初次培养，得到原代培养细胞。在通过肉眼观察达到近汇合或汇合时，使用与上述同样的剥离剂同样地进行处理，回收包含在培养皿内的细胞。

之后，使用上述培养基以期望的浓度、例如约1×10⁴细胞/cm²的浓度对初次培养细胞进行传代培养，将传代了1～3次左右的细胞用于实验。如上能够得到人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。

根据需要，可以将如上得到的猪乳牙牙髓干细胞、猪脂肪干细胞和人乳牙牙髓干细胞分别装入小瓶中，在负80度冷冻保存。

3.基因导入细胞的制作

3.1利用慢病毒载体的基因导入

将如上得到的猪牙髓干细胞、猪脂肪干细胞以及人牙髓干细胞与上述同样地进行培养，在达到约70～90％汇合时，使用市售的试剂盒进行支原体检测。作为这样的试剂盒，例如可以使用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza公司制造、LT07-318)等。

接着，使用聚凝胺试剂，使如上制作的慢病毒载体感染上述各干细胞，进行试剂选择，选择出目的基因的稳定表达株。

除去如上培养的各干细胞的培养上清，用例如PBS(pH 7.4)清洗后，使用期望的剥离剂将细胞剥离，分别进行回收。作为这样的剥离剂，例如对于猪乳牙牙髓干细胞和猪脂肪干细胞，可以使用StemPro(注册商标：GIBCO公司制造)，对于人乳牙牙髓干细胞，可以使用Trypsin-EDTA等。

按照常规方法对所得到的细胞进行计数，在例如进行了组织培养处理(T.C.trematment)的6孔板(CORNING公司制造)的各孔中按照约1×10⁵细胞/孔进行接种，在约37℃的CO²温箱内培养约24小时，确认细胞在整体均匀地存在。

之后，除去培养上清，对于猪乳牙牙髓干细胞和猪脂肪干细胞，以期望量、例如750μL/孔分别添加包含期望浓度的聚凝胺的期望培养基、例如包含约8μg/mL的聚凝胺和约10％FBS的DMEM培养基。接着，向各孔中以例如约250μL/孔分别添加如上得到的慢病毒载体溶液。

在人乳牙牙髓干细胞的情况下，以期望量、例如约1.2mL/孔分别添加与上述同样的包含聚凝胺和FBS的DMEM，接着向各孔中以期望量、例如约400μL/孔分别添加上述慢病毒载体溶液。

将如上添加了病毒载体的各微孔板以期望的条件、例如约1,000×g在约32℃离心约30分钟，使病毒感染细胞。之后以期望的条件、例如在约37℃的CO²温箱内培养约4小时～约6小时，之后向各孔中分别添加期望量、例如约1mL/孔的培养用培养基，进一步以期望的条件、例如在37℃的CO²温箱内培养约24小时，进行基因导入。

3.2试剂选择

从如上培养的干细胞(猪牙髓干细胞、猪脂肪干细胞和人牙髓干细胞)的培养板的各孔中除去培养上清，将包含期望浓度的选择试剂、例如约0.4mg/mL或约0.8mg/mL的GENETICIN(G418、GIBCO公司制造)的选择培养基以期望量、例如约2mL/孔加入到各孔中，更换成选择培养基。之后一边更换培养基一边培养期望的时间、例如约3天～约5天，进行基因导入细胞的选择。

将上述各培养细胞的一部分用于克隆化，余下的部分作为池细胞在选择用培养基中继续培养。克隆化可以如下进行。

例如，使用不含抗生素的选择培养基、例如不含青霉素、链霉素和G418的选择培养基将细胞稀释，将期望浓度、例如约1×10³细胞/4mL或约5×10³细胞/4mL接种到各培养皿中，接着在约37℃的CO²温箱内培养约24小时。从培养皿的背面侧对所形成的集落进行标记，在集落数达到期望的数目、例如约100个时，除去培养上清，用PBS清洗。将克隆环设置到培养皿中，将使用剥离剂剥离的集落的细胞分别加入到各自加入有期望量、例如约1mL的培养基的48孔板的各孔中。

3.3总RNA的制备

为了确认基因表达，使用例如NucleoSpin RNA II(MACHEREY-NAGEL公司制造的试剂盒)制备总RNA。以下使用的各种缓冲液、环形过滤器(ring filter)等使用上述试剂盒的附带品，从可得到高纯度的总mRNA的方面出发，优选按照试剂盒附带的操作手册进行操作。

将利用期望的数目、例如约5×10⁵个细胞制作的细胞团块溶解来制备溶解液，将该溶解液加入到紫色的环形过滤器中，以期望的条件、例如约11,000×g离心约1分钟。离心后弃掉过滤器，向收集管中加入期望量的乙醇、例如约350μL的约70％乙醇，进行期望次数、例如约5次的吹打。

接着，取期望量、例如约700μL所得到的溶液，加载到设置在收集管中的淡蓝色的环形柱中，以期望的条件、例如约11,000×g进行约30秒离心，使RNA结合。离心后，将该柱设置于新的收集管中，加入期望量的试剂、例如约350μL的MDB，以期望的条件、例如约11,000×g进行约1分钟离心分离，将其脱盐。

离心后，将期望量、例如约10μL的rDNase与约90μL的DNase用反应缓冲液轻轻地混合，制备DNA反应混合液，将期望量、例如约95μL加入到该柱中，以期望的条件、例如在室温下温育约15分钟，对DNA进行消化。接着，将期望量、例如200μL的缓冲液RA2加入到柱中，以期望的条件、例如约11,000×g离心约30秒，进行清洗。接着，将柱设置于新的收集管中，将期望量、例如约700μL的缓冲液RA3加入到该柱中，以期望的条件、例如约11,000×g进一步离心约30秒，进行清洗。

接着，弃掉流出到收集管中的溶液，再次将期望量、例如约250μL的缓冲液RA3加入到该柱中，进一步以期望的条件、例如约11,000×g离心约2分钟，使该柱的二氧化硅膜风干。将该柱设置于期望尺寸、例如约1.5mL的收集管中，将期望量、例如约60μL的不含RNAase的水加入到该柱中，以期望的条件、例如约11,000×g离心约1分钟，得到总RNA样品。

3.4逆转录反应

由如上得到的总RNA样品进行逆转录，接着进行实时PCR，得到PCR产物。逆转录使用例如PrimeScript RT试剂盒(Perfect Real time、宝生物株式会社制造)等市售品，按照这样的试剂盒中附带的操作手册进行逆转录即可。

实时PCR可以使用例如SYBR Premix Ex Taq等市售的试剂盒来进行。另外，作为此处使用的标准基因，例如可以举出猪β-肌动蛋白、人β-肌动蛋白等，作为引物，例如可以制备序列表的序列编号10～15所示的引物来使用。

首先，将期望量、例如约350μL的SYBR Premix Ex Taq II(x2)、约28μL的引物混合物(约10μL)和约266μL的二次蒸馏水混合，制备实时PCR用预混合物。接着，将期望量、例如约23μL的上述预混合物分别分装到实时PCR用管中，向各管中各加入约2μL模板cDNA。接着，以期望的条件、例如以在约95℃约30秒、约40次循环的(在约95℃约5秒、之后在约60℃约30秒)的条件进行实时PCR。接着，以在约95℃约15秒、在约60℃约30秒、在约95℃约15秒的条件使其解离，求出熔解曲线。对于人牙髓干细胞也进行同样的操作。

由如上制作的校正曲线能够求出利用各病毒载体导入基因后的细胞中的各基因的表达量。通过利用内标基因的表达量进行校正，能够得到精度良好的结果。

在导入基因后的各干细胞中，确认到所导入的基因进行了表达。通过该确认，能够求出基于如上制作的各病毒载体的基因导入效率。

接着，由如上得到的基因导入细胞(以下有时称为“导入基因稳定表达细胞群”或“池细胞”)进行细胞的单细胞克隆。

首先，将上述的池细胞以期望的个数接种在期望尺寸的培养皿中，例如以约1×10³个/皿的细胞浓度接种在60mm培养皿中，在CO₂温箱中在期望的温度培养期望的时间，例如在37℃培养24小时。之后，将培养基更换成上述的包含选择试剂的生长培养基，继续进行培养，形成集落。对于所形成的集落，使用克隆环和剥离剂将每个集落剥离，分别接种在期望的微孔板、例如24孔板中。

使接种的细胞增殖后，接种在培养用培养皿等中使其增殖，进行扩大培养，由此能够以单克隆形式得到导入基因稳定细胞。接着，将所得到的克隆与上述同样地进行培养，使其增殖，得到总mRNA。以所得到的总RNA作为模板，使用期望的试剂盒、例如PrimeScript RT试剂盒进行逆转录反应，得到模板cDNA。

之后，例如以cDNA(逆转录产物)作为模板，使用上述的SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)、引物(对导入基因和内标基因分别具有特异性的引物、例如序列表的序列编号10～15所示的引物)，与上述同样地进行实时PCR。

以由上述实时PCR的二阶微分曲线计算出的Ct值为X轴、以总RNA的相对值为Y轴分别进行作图，制作各基因的表达量测定用的校正曲线。求出将池细胞的表达量设为1时的猪牙髓干细胞来源的导入基因和人牙髓干细胞来源的导入基因的表达量的相对值，由此确定导入的基因是否全部进行了表达、并且求出它们的表达量，选择出目的克隆。

如上能够得到导入有期望基因的永生化干细胞的细胞群、以及由该细胞群克隆得到的永生化干细胞的克隆。

实施例

(实施例1)病毒载体制备(之一)

(1)病毒制备用细胞的制备

(1-1)试剂等和细胞的复苏

作为重组慢病毒载体产生细胞株，使用Lenti-X 293T(Clontech公司制造、编号：632180)。Lenti-X 293T的培养使用含有10％胎牛血清(FBS、HyClone公司制造、批号：GRD0051)和抗生素(1％青霉素/链霉素、Gibco公司制造、编号15140-122)的DMEM(Sigma公司制造、编号：D5796-500ML)。以下在本说明书中将该培养基称为“293T基本培养基”。细胞冻存液(Cellbanker、编号：BLC-1)由日本全药工业公司购入。

首先，将Lenti-X 293T细胞悬浮在293T基本培养基中，取一部分进行8倍稀释。向上述稀释液20μL中加入140μL的台盼蓝染色液，用血细胞计数板计数，结果为2.94×10⁶细胞/mL。将所得到的10mL的悬浮液和4个保存小瓶的各2.0×10⁶个细胞转移到离心管中。将该离心管在室温以200×g离心3分钟，回收细胞。从回收的细胞中完全除去上清，悬浮在必要量的细胞保存液中，制备细胞悬浮液。将该细胞悬浮液以1mL/小瓶进行分装，保存于-80℃。根据需要，在翌日转移到液氮保存容器中进行保存。

(1-2)重组慢病毒载体产生用细胞的制备

DMEM、抗生素、FBS使用与上述(1-1)相同的制品。另外，磷酸缓冲生理盐水(PBS(-)、编号：10010-049、以下有时简称为“PBS”)由Gibco公司购入。经T.C.处理的培养皿(直径10cm)由IWAKI株式会社购入。作为剥离剂，由Gibco公司购入0.25％胰蛋白酶-EDTA(1×)。

在15mL的离心管中加入10mL的293T基本培养基。在37℃的水浴中对上述(1-1)中保存的小瓶进行加温，使细胞悬浮液快速融化，加入到上述离心管中。于室温以200×g离心3分钟，回收细胞。与上述(1-1)同样地进行台盼蓝染色，使用血细胞计数板计数细胞。每1小瓶的细胞数为2.0×10⁶个细胞。

以1～5×10⁶细胞/10mL/10cm培养皿接种细胞，在5％CO₂温箱中培养约24小时。之后根据细胞的状态进行传代直到使用为止。

(2)重组慢病毒载体的制备

(2-1)试剂等

DMEM、抗生素、FBS、剥离剂、PBS使用与上述(1-1)相同的制品。胶原包被培养皿(6cm)由IWAKI株式会社购入，另外转染试剂(TransIT-293、编号：MIR2700)由Mirus公司购入。重组慢病毒载体产生用试剂(Lenti-X^TM HTX包装系统、编号：631247、Clontech公司制造)和Lenti-X HTX包装混合物(VSV-G)由Clontech公司购入。

(2-2)重组慢病毒载体(转染质粒)的制备

构建以下4种慢病毒载体。由宝生物网站商品目录下载pLVSIN载体的序列信息，通过以下的程序进行构建。

(v1)慢病毒载体E7T(EcoRI/KoZal/E7/T2A4/hTERT/BamHI)

按照序列信息合成EcoRI/KoZal/E7/T2A4/hTERT/BamHI的双链DNA(序列表的序列编号1)，通过标准的程序克隆化至慢病毒质粒载体(pLVSIN-CMV Neo、参照图1)的多克隆位点，得到SYN4122-1-7(序列表的序列编号1)。

(v2)慢病毒载体BT(EcoRI/KoZal/Bmi-1/T2A4/hTERT/BamHI)

按照序列信息合成Bmi-1的双链DNA，与上述(v1)中制作的慢病毒载体E7T的E7进行替换(序列表的序列编号2)。

(v3)慢病毒载体BE6T(EcoRI/KoZal/Bmi-1/T2A3/E6/T2A4/hTERT/BamHI)

按照序列信息合成T2A3E6的双链DNA，插入到上述(v2)中制作的慢病毒载体的Bmi-1与T2A4之间(序列表的序列编号3)。

(v4)慢病毒载体E6E7T(EcoRI/KoZal/E6/T2A3/E7/T2A4/hTERT/BamHI)

按照序列信息合成E6T2A3的双链DNA，插入到上述(v1)中制作的慢病毒载体E7T的Kozak序列与E7之间(序列表的序列编号4)。

(2-3)共转染用细胞的制备

除去在上述(1)(1-2)中进行了传代的Lenti-X 293T细胞的培养上清，用PBS清洗，将剥离剂加到培养皿中，使细胞剥离并进行回收。

取50μL进行了4倍稀释的细胞悬浮液，加入等量的台盼蓝，使用血细胞计数板对细胞进行计数，结果为2.38×10⁶细胞/mL。向该悬浮液中加入上述基本培养基，制备成5×10⁵细胞/mL，以2×10⁶细胞/4mL/皿接种在直径6cm的胶原包被培养皿中。之后在5％CO₂温箱中于37℃培养约24小时，更换培养基，进一步继续培养。

(2-4)慢病毒载体的转染和包装

使用Lenti-X HTX包装系统(以下有时简称为“包装系统”)进行共转染。将Xfect聚合物充分涡旋振荡，对于转染用的各样品，准备2根微量离心管(管1和2)。在管1中加入179～182μL的Xfect反应缓冲液，向其中加入15μL的Lenti-X 293T包装混合物，最后加入3～6μL的表1所示的载体质粒(质粒溶液、合计200μL)。另外，在管2中加入197μL的Xfect反应缓冲液，向其中加入3μL的Xfect聚合物(聚合物溶液、200μL)。

[表1]

载体No.	序列名称	序列长(bp)	5’末端修饰/3’末端修饰	浓度(ng/mL)
					SYN4122-1-7	LVE7T	3,780	EcoRI/BamHI	543
SYN4122-2-2	LVBT	975	-	650
					SYN4122-3-3	LVBE6T	537	-	736
SYN4122-4-4	LVE6E7T	537	-	569

将这2根管分别进行涡旋振荡来充分混合，接着将聚合物溶液添加到质粒溶液中，以中等程度的强度进行涡旋振荡来混合，制成DNA-Xfect混合液。将该DNA-Xfect混合液在室温静置10分钟，使其形成纳米粒子。将上述(2-3)中制备的Lenti-X 293T细胞从CO₂温箱中取出，除去2mL的培养基。向其中滴加加入全部量(400μL)的上述DNA-Xfect混合液。轻轻地摇动培养皿，使DNA-Xfect混合液遍及整个培养皿内。

接着，将培养皿送回到CO₂温箱中，于37℃进行温育。4小时后在2mL的包含高浓度葡萄糖(4.5g/L)、4mM L-谷氨酰胺和3.7g/L碳酸氢钠的DMEM中追加添加有10％Tet SystemAproved FBS、1mM丙酮酸钠的Lenti-X 293T细胞株增殖培养基(以下有时简称为“完全培养基”)，在37℃培养一夜。

接着，将培养基用新鲜的完全培养基(4mL)进行更换，在37℃培养24～48小时。一边使用Lenti-X GoStix(3次检测的量、Clontech公司制造)进行病毒载体的简易滴度测定，一边决定回收的时机。在病毒滴度达到最大的时刻回收包含慢病毒的培养上清。

(2-5)慢病毒载体的回收

在更换培养基的翌日，用10mL的一次性注射器(TERUMO株式会社制造)吸取、回收上述培养皿的培养上清。在该注射器中安装0.45μm的过滤器(MILEX-HV、Millipore公司制造)，一边对注射器内的培养上清进行过滤，一边将病毒载体溶液回收到15mL管中。将回收到管内的过滤后的培养上清混合，分装到1mL/小瓶中，在-80℃进行保存。将约200μL作为滴度测定用病毒载体溶液另行保存。

(2-6)慢病毒载体的简易滴度测定

在Lenti-X GoStix中加入20μL如上得到的滴度测定用病毒载体溶液，添加4滴Chase缓冲液1。接着，于室温反应10分钟，确认有无条带。如图2(A)～(E)所示，在进行测定的SYN4122-1-7、SYN4122-2-2、SYN4122-3-3和SYN4122-4-4中全部确认到2条条带，确认到重组慢病毒载体的存在。图中，左侧示出表示对照的条带、右侧示出重组慢病毒载体。

(3)SYN4122转染质粒

将如上得到的包含4种质粒(SYN4122-1-7、SYN4122-2-2、SYN4122-3-3和SYN4122-4-4)的Lenti-X 293T细胞在琼脂培养基上划线，使其形成集落。挑取所形成的集落，接种在包含抗生素的2mL的LB培养基中，一边剧烈搅拌(200rpm)一边在37℃培养约8小时。

接着，在包含氨苄青霉素的50mL的LB培养基中移植100μL如上培养的细胞的培养液，一边剧烈搅拌(200rpm)一边在37℃培养约16小时。

使用MN NucleoBond Xtra Mid试剂盒(Clontech公司制造)，用水洗脱质粒，测定洗脱量。与此同时，利用琼脂糖凝胶(1％)进行分析。关于标记物，M1为超螺旋的DNA梯状条带、M2为λ-Hind III消化DNA。将结果示于表1和图3中。由琼脂糖凝胶电泳分析的结果显示，所插入的DNA各不相同。

(实施例2)病毒载体制备(之二)

(1)逆转录病毒制备用细胞的制备

(1-1)试剂等和细胞的复苏

作为逆转录病毒制备细胞株，使用G3T-hi细胞。G3T-hi细胞的培养使用含有葡萄糖(4.5g/L)、L-谷氨酰胺(584mg/L)、10％胎牛血清(FBS、HyClone公司制造、批号：GRD0051)和抗生素(1％青霉素/链霉素、Gibco公司制造、编号15140-122)的DMEM(Sigma公司制造、编号：D5796-500ML)。

关于细胞培养，与将Lenti-X 293T细胞悬浮在293T基本培养基中的情况同样地进行。从回收的细胞中完全除去上清，悬浮在必要量的细胞保存液中，制备细胞悬浮液。另外，将该细胞悬浮液以1mL/小瓶进行分装，在-80℃保存。根据需要，在翌日转移到液氮保存容器中进行保存。

(1-2)逆转录病毒载体产生用细胞的制备

DMEM、抗生素、FBS、葡萄糖和L-谷氨酰胺使用与上述(1-1)相同的制品。另外，PBS、经T.C.处理的培养皿(直径10cm)和0.25％胰蛋白酶-EDTA(1×)使用与上述实施例1相同的制品。

向15mL的离心管中加入10mL的上述培养基。在37℃的水浴中对上述(1-1)中保存的小瓶进行加温，使细胞悬浮液快速融化，加入到上述离心管中。于室温以200×g离心3分钟，回收细胞。与上述(1-1)同样地进行台盼蓝染色，使用血细胞计数板计数细胞。每1小瓶的细胞数为3.0×10⁶个细胞。

(2)重组逆转录病毒载体的制备

(2-1)试剂等

DMEM、抗生素、FBS、剥离剂、PBS等使用与上述(1-1)相同的制品。胶原包被培养皿(6cm)、转染试剂(TransIT-293、编号：MIR2700)使用与上述实施例1相同的制品。另外，使用逆转录病毒包装试剂盒Ampho、逆转录病毒滴度检测套装(用于实时PCR)以及一步法SYBRPrimeScript RT-PCR试剂盒(均由宝生物株式会社制造)。

(2-2)逆转录病毒载体(转染质粒)的制备

构建以下5种逆转录病毒载体。使用pDON-5 NEO载体的序列信息，通过以下的程序进行构建。

按照常规方法制备在起始密码子的上游附加有Kozak序列(gccacc)的5种永生化基因(hTERT(序列表的序列编号5)、人乳头瘤病毒的E6(序列表的序列编号6)和E7(序列表的序列编号7)、pigTERT(序列表的序列编号8)以及hBmi-1(序列表的序列编号9))，克隆化至pDON-5 NEO DNA(Takara编号3657：参照图7)的PmaC I-Hpa I位点，制备出5种逆转录病毒载体(pDON-5 Neo hTERT载体、pDON-5 Neo HPV16E6载体、pDON-5 Neo HPV16E7载体、pDON-5 Neo pHTERT载体和pDON-5 Neo hBmi1载体)。

使用如上制作的5种质粒DNA，按照常规方法转化大肠杆菌，将转化体于37℃在CO₂温箱中进行培养，分别制备出转染级别的质粒DNA(约50μg)。将各质粒DNA溶解在灭菌水中，制备DNA溶液。

(2-3)重组逆转录病毒载体的产生

将G3T-hi细胞以6×10⁶个/皿接种在5个组织培养用培养皿(100mm)中，在5％CO₂温箱中于37℃培养约24小时，加入0.4mL的转染试剂(TransIT-293)，从上述5种质粒载体中选择出3种，共导入pGP和pE-Ampho(均为逆转录病毒包装试剂盒Ampho所附带的载体))，进一步在相同条件下进行40～56小时培养，导入这些基因，进一步在相同条件下进行48小时培养。培养结束后回收包含逆转录病毒载体的培养上清，用0.45μm的过滤器(Millipore公司制造)过滤灭菌，以各1mL分装到管中。

(2-4)重组逆转录病毒载体的滴度的计算

使用逆转录病毒滴度检测套装(用于实时PCR)和一步法SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒(Perfect Real Time)(均为宝生物株式会社制造)，按照各自的使用说明书对重组逆转录病毒载体的滴度进行定量。以各试剂盒附带的RNA对照模板的拷贝数为X轴、并且以由二阶微分曲线(第二阶导数)求出的Ct值为Y轴进行作图，制作校正曲线。基于该校正曲线求出被检试样的滴度。

使用12.5μL的重组逆转录病毒载体、2.5μL的10×DNase I缓冲液、2.0μL的DNaseI(5U/μL)、0.5μL的RNase抑制剂(40U/μL)和7.5μL的不含RNase的灭菌蒸馏水(总量25.0μL)，于37℃处理30分钟、接着于70℃处理10分钟、之后冷却至4℃，进行DNase I处理。DNaseI处理反应结束后，迅速进行实时PCR。

为了进行PCR，设计制作下述表2所示的4种引物。使PCR用引物混合物(各10μL)的组成为：40μL的正向引物(50μM；目的基因：CH000987-F、标准基因：HA067803-F))、40μL的反向引物(50μM；目的基因：CH000987-R、标准基因：HA067803-R))以及灭菌蒸馏水120μL。使用该PCR引物混合物，利用与实施例1相同的条件进行实时PCR。

[表2]

接着，使用12.5μL的2×一步法SYBR RT-PCR缓冲液III、0.5μL的Takara ExTaq HS(5U/μL)、0.5μL的PrimeScript RT酶混合物II、0.5μL的正向滴度引物FRT-1(10pmol/μL)、0.5μL的反向滴度引物FRT-1(10pmol/μL)、8.5μL的不含RNase的灭菌蒸馏水以及2μL的模板(总量25.0μL)，以在42℃反应5分钟、在95℃反应10秒后、进行40次循环的(在95℃5秒、之后在60℃30秒)的条件进行实时PCR。接着，以在95℃15秒、在60℃30秒、在95℃15秒的条件使其解离，求出熔解曲线。将被检试样(各载体)的滴度示于下表3。

[表3]

(实施例3)干细胞的制备

使在上述实施例1中得到的慢病毒载体分别感染如下制作的猪乳牙干细胞、猪脂肪干细胞、人牙髓干细胞，制作出目的基因的稳定表达株。

(1)干细胞的制备

(1-1)猪牙髓干细胞

由食肉公社(日本爱知县名古屋市港区)获得出生后5～6个月的猪的颌骨(带有下颌齿的下颌骨)和肠系膜。刚屠杀后的食肉用猪的下颌齿、颌骨和肠系膜用装有保冷剂的冰盒(-30℃)进行搬运。按照以下的程序由上述猪的牙齿和下颌骨得到猪的牙髓干细胞(SHED)，搬运到实验室中。

将所搬运的猪的牙齿和下颌骨用聚维酮碘消毒，之后利用齿科用金刚石划针将下颌齿的牙冠在水平方向切断，接着沿髄腔在垂直方向切削而除去髓腔顶。使用齿科用手术用刮垢器由这样处理后的牙冠和牙根部采集牙髓。

利用眼科用穿刺刀将所得到的牙髓切碎，悬浮在2mg/mL的胶原酶溶液中。将该悬浮液在37℃的恒温槽中放置1小时来分离细胞。将分离出的细胞在包含10％FBS和1％Anti-Anti(Invitrogen公司制造)的DMEM(SIGMA公司制造)中在37℃、5％CO₂的条件下进行预培养，得到传代用的细胞。

首先，在培养初期，一边以每周2～3次的频率更换培养基一边进行培养，直至达到近汇合为止。使用包含0.05％胰蛋白酶的Hepes溶液将达到近汇合的细胞剥离，在1,500rpm于室温离心3分钟来进行收集。将所得到的细胞转移到新鲜的培养基中，在与上述同样的条件下使用全部量进行传代培养。

(1-2)猪脂肪干细胞

利用解剖用剪刀和穿刺刀从猪的肠系膜切出脂肪组织并进行收集，除去多余的组织，在生理盐水中冲洗血液。将所得到的脂肪细胞转移到含有10％牛血清、100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素的DMEM中，在与上述相同的条件下进行预培养，接着在上述DMEM中在37℃、5％CO₂的条件下培养至达到近汇合为止。上述的添加量全部以最终浓度表示。与猪SHED同样地使用上述的0.05％胰蛋白酶溶液进行剥离，以1,500rpm进行3分钟离心分离，进行传代培养，得到脂肪干细胞。

(1-3)人乳牙牙髓干细胞

使用由10岁健康男孩得到的脱落乳牙。将该脱落乳牙用聚维酮碘溶液消毒后，使用齿科用金刚石划针将牙冠沿水平方向切断，使用齿科用铰刀回收牙髓组织。将所得到的牙髓组织在3mg/mL的I型胶原酶和4mg/mL的中性蛋白酶的溶液中于37℃消化1小时。接着，将该溶液用70mm的细胞过滤网(Falcon公司制造)进行过滤。

将滤出的细胞重悬浮在4mL的上述培养基中，接种在直径6cm的贴壁性细胞培养用培养皿中。向该培养皿中添加含有10％FCS的DMEM，在调整为5％CO₂、37℃的温箱中培养2周左右。将形成了集落的贴壁性细胞(牙髓干细胞)利用含有0.05％胰蛋白酶的0.2mM EDTA在37℃处理5分钟，回收从培养皿上剥离的细胞。

接着，将如上回收的贴壁性细胞接种在贴壁性细胞培养用培养皿(胶原包被培养皿)中，在调整为5％CO₂、37℃的温箱中进行初次培养，得到原代培养细胞。在通过肉眼观察达到近汇合(细胞占培养容器的表面的约70％的状态)或汇合时，用包含0.05％胰蛋白酶的0.2mM EDTA于37℃处理5分钟，使细胞从培养容器剥离并进行回收。

将这样得到的细胞再次接种在加入有上述培养基的培养皿中，进行数次传代培养，使其增殖到约1×10⁷个/mL。将所得到的细胞保存在液氮中。

之后，使用上述培养基以约1×10⁴细胞/cm²的浓度对初次培养细胞进行传代培养。将1～3次传代后的细胞用于实验。如上得到人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。将如上得到的猪乳牙牙髓干细胞、猪脂肪干细胞和人乳牙牙髓干细胞分别装入小瓶中，在负80度进行冷冻保存。

(实施例4)基因导入用细胞的准备

(1)细胞的建立

(1-1)猪牙髓干细胞和猪脂肪干细胞的培养

猪牙髓干细胞和猪脂肪干细胞的培养使用培养用培养基(包含10％FBS的DMEM(GIBCO公司制造))。在15mL的离心管中加入10mL的上述培养用培养基。在37℃的水浴中对猪牙髓干细胞的保存用小瓶进行加温，使其快速融化，加入到上述离心管中。于室温以200×g离心3分钟。除去上清，加入10mL的培养用培养基制成悬浮液，取其一部分进行台盼蓝染色，使用血细胞计数板计测细胞数。结果为5×10⁵细胞/小瓶。

接着，以1～5×10⁵细胞/10mL/皿接种在直径10cm的培养皿(Iwaki公司制造、T.C.处理)中，在5％CO₂温箱内于37℃培养约24小时。之后用显微镜观察细胞的状态。将该培养皿的培养基完全除去，加入10mL的新鲜的培养用培养基，在5％CO₂温箱内于37℃培养约24小时。之后根据细胞的状态继续传代直到使用为止。从培养皿剥离细胞时使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(GIBCO公司制造)。对于猪脂肪干细胞也进行同样的操作。

(1-2)人牙髓干细胞

在人牙髓干细胞的培养中，除了使用含有10％FBS的DMEM(SIGMA公司制造)以外，进行与上述(1-1)同样的操作。需要说明的是，细胞数的计测结果为1.0×10⁵细胞/小瓶。

(实施例5)基因导入株的试剂选择和基因表达分析(池细胞的制备)

(1)慢病毒载体基因导入细胞的制作

使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数如上建立的细胞中的活细胞数，以1×10⁶细胞/10mL接种在加入有培养用培养基的直径10cm的培养皿中，在37℃的CO₂温箱内培养约24小时。在细胞密度达到7～9成汇合时，稀释成1×10⁴细胞/mL的浓度，进行传代。另外，如下确认有无支原体感染。

(2)培养细胞的支原体检测

使用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza公司制造、LT07-318)确认有无支原体感染。

将Mycoplasma Alert试剂以100μL/孔加入到96孔板(Corning公司制造、平底)中。向其中以100μL/孔加入猪牙髓干细胞或猪脂肪干细胞的培养上清(各6孔)。对于各孔分别进行5次吹打。在室温静置5分钟，使用干燥机除去气泡。使用化学发光仪(Tecan(infinite200、多检测模式酶标仪))以动力学循环5进行测定A。

接着，以100μL/孔加入MycoAlert底物，对于各孔分别进行5次吹打。于室温静置5分钟，使用干燥机除去气泡。使用化学发光仪以动力学循环5进行测定B。将样品中的活支原体溶解、使支原体的酶(荧光素)作用于MycoAlert底物时，ADP被转换为ATP。测定MycoAlert添加前后的样品中的ATP水平，利用下式进行计算，将R为1以上的情况判定为阳性、小于1判定为阴性。激发波长设定为565nm。将结果示于下表4。

R＝测定值B的平均/测定值A的平均

[表4]

样品	测定值A	测定值B	B/A	判定
					培养基(DMEM)	269	136	0.50	阴性
猪牙髓干细胞上清	266	115	0.43	阴性
					猪脂肪干细胞上清	257	131	0.51	阴性
阳性对照	1201	3712	3.09	阳性
					阴性对照(无试剂)	1253	183	0.15	阴性

对于人牙髓干细胞也进行同样的检查。将结果示于表5。确认到任一干细胞均未被支原体感染。

[表5]

样品	测定值A	测定值B	B/A	判定
					培养基(DMEM)	250	106	0.42	阴性
人牙髓干细胞上清	264	115	0.43	阴性
					人牙髓干细胞上清	276	115	0.42	阴性
阳性对照	1256	3971	3.16	阳性
					阴性对照(无试剂)	1298	173	0.13	阴性

(2)慢病毒载体基因的导入

使用聚凝胺试剂，使上述实施例1中制作的慢病毒载体感染上述实施例3中得到的各干细胞，利用GENETICIN添加培养基选择出目的基因的稳定表达株。

除去如上培养的各干细胞的培养上清，用PBS(pH7.4)清洗后，使用剥离剂(对于猪乳牙牙髓干细胞和猪脂肪干细胞使用StemPro(注册商标：GIBCO公司制造)、对于人乳牙牙髓干细胞使用胰蛋白酶-EDTA)将细胞剥离，分别进行回收。与上述同样地使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数细胞数，在组织培养处理(T.C.trematment)6孔板(CORNING公司制造)的各孔中加入适量的培养用培养基，按照1×10⁵细胞/孔进行接种，在37℃的CO₂温箱内培养约24小时，确认细胞在整体均匀地存在。

之后除去上清，在猪乳牙牙髓干细胞和猪脂肪干细胞的情况下，以750μL/孔分别添加含有8μg/mL的聚凝胺和10％FBS的DMEM培养基，接着，以250μL/孔向各孔中分别添加实施例1中得到的上述慢病毒载体溶液。

在人牙髓干细胞的情况下，以1.2mL/孔分别添加含有8μg/mL的聚凝胺和10％FBS的DMEM培养基，以400μL/孔同样地向各孔中分别添加上述慢病毒载体溶液。将如上添加了病毒载体的微孔板于32℃以1,000×g离心30分钟，使病毒感染细胞。在37℃的CO₂温箱内培养约4～6小时，之后以1mL/孔分别添加培养用培养基。接着在37℃的CO₂温箱内培养约24小时，进行基因导入。

(3)试剂选择

从如上培养的6孔板的各孔中除去培养上清，更换成含有0.4mg/mL或0.8mg/mL的GENETICIN(G418、GIBCO公司制造)的选择用培养基(2mL/孔)。之后一边进行培养基更换一边培养3～5天，进行基因导入细胞的选择。对于猪牙髓干细胞、猪脂肪干细胞和人牙髓干细胞均同样地进行试剂选择。

使用上述各培养细胞的一部分进行克隆化，余下的部分作为池细胞在选择用培养基中继续培养。为了进行克隆化，使用不含青霉素、链霉素和G418的选择培养基将细胞稀释，将细胞以1×10³细胞/4mL/皿或5×10³细胞/4mL/皿接种在60mm培养皿中。接着，在37℃的CO₂温箱内培养约24小时。

从培养皿的背面侧对所形成的集落进行标记，在标记的集落数达到100个左右时，除去培养上清，用PBS清洗。将克隆环设置到培养皿中，将使用剥离剂剥离的集落的细胞分别加入到加入有1mL培养基的48孔板的各孔中。在37℃的CO₂温箱内继续培养，一边观察细胞密度一边进行规模扩大。从选择试剂开始起约2～3周后，将形成试剂抗性而增殖的细胞群分别冷冻保存。在增殖达到5×10⁶细胞/mL左右时，以2×10⁶细胞/小瓶进行储存。

作为冷冻保存液，在猪乳牙牙髓干细胞和猪脂肪干细胞的情况下使用Cellbanker(全药工业株式会社制造)、另外在人乳牙牙髓干细胞的情况下使用Bambanker(日本Genetics公司制造))。使用这些冷冻保存液，将各干细胞以0.5×10⁶细胞/小瓶(猪乳牙牙髓干细胞和猪脂肪干细胞)或1×10⁶细胞/小瓶(人乳牙干细胞)进行冷冻，在负80℃保存至使用为止。

(4)总RNA的制备

总RNA(Total RNA)的制备使用NucleoSpin RNA II(MACHEREY-NAGEL公司制造的试剂盒)。首先，为了进行表达确认用的RNA提取，制作出5×10⁵个细胞的团块。向其中加入350μL的RA1缓冲液(上述试剂盒中所附带)和利用0.22μm过滤器灭菌后的7μL的1M DTT(二硫代苏糖醇)，充分地混合，使细胞溶解，得到溶解液。将该溶解液装入设置于收集管中的紫色的环形过滤器(上述的试剂盒所附带)中，以11,000×g离心1分钟。离心后弃掉过滤器，向收集管中加入350μL的70％乙醇，进行5次吹打，调整RNA的结合条件。

接着，将该溶液700μL加载到设置于收集管中的淡蓝色的环形柱(上述试剂盒所附带)中，以11,000×g离心30秒，使RNA结合。离心后，将该柱设置于新的收集管中，加入350μL的MDB(上述试剂盒所附带)，以11,000×g进行1分钟离心分离，将其脱盐。

离心后，将10μL的rDNase(540μL/小瓶)与90μL的DNase用反应缓冲液(上述试剂盒所附带)轻轻地混合，制备DNA反应混合液，将95μL加入到该柱中，在室温温育15分钟，将DNA消化。温育结束后，将200μL的缓冲液RA2(上述试剂盒所附带)加入到柱中，以11,000×g离心30秒，进行清洗。接着，将柱设置于新的收集管中，将700μL的缓冲液RA3(上述试剂盒所附带)加入到该柱中，以11,000×g进一步离心30秒，进行清洗。

在该离心后，弃掉流出到收集管中的溶液，再次将250μL的缓冲液RA3加入到该柱中，进一步以11,000×g离心2分钟，使该柱的二氧化硅膜风干。将该柱设置于1.5mL的收集管中，将60μL的不含RNAase的水加入到该柱中，以11,000×g离心1分钟，得到高纯度的总RNA样品(40～60μL)。

(5)逆转录反应

使用PrimeScript RT试剂盒(Perfect Real time、宝生物株式会社制造)，由如上得到的总RNA试样进行逆转录。

(5-1)使用PrimeScript RT试剂盒的逆转录

使用上述试剂盒所附带的EASY稀释液将如上得到的总RNA样品如下述表6所示稀释成20ng/μL。

[表6]

制备包含72μL的5×PrimeScript缓冲液、18μL的PrimeScript RT酶混合物、18μL的随机6聚体(100μM)以及72μL的2次蒸馏水(D2W)的180μL的预混合物(反应液)。接着，将该预混合物在PCR管中各分装10μL，向各管中加入10μL的模板RNA，以在37℃反应15分钟、在85℃反应5秒、之后设定为4℃的条件进行逆转录。所得到的产物用于以下的实时PCR。

(5-2)使用SYBR Premix Ex Taq的实时PCR

将350μL的SYBR Premix Ex Taq II(×2)、28μL的引物混合物(10μM)、266μL的二次蒸馏水混合，制备实时PCR用预混合物。引物以0.4μM的最终浓度使用。作为标准基因，使用猪β-肌动蛋白、人β-肌动蛋白。在PCR中使用下述表7所示的碱基序列的引物(序列表的序列编号10～15)。另外，如下述表8所示制备标准样品。

[表7]

编号	碱基序列	序列编号
			1	GGCACTGCCCTCAGACTTCA	10
2	CTGCTAAAGCGCATGCTCCA	11
			3	CTGCGGCATCCACGAACTA	12
4	ACAGCACCGTGTTGGCGTA	13
			5	TTGGTCAAGCAGCATAATCCAAAG	14
6	GTCAAGGGCATAGCCTACCACAA	15

[表8]

将上述的预混合物以各23μL分装到实时PCR用管中，在各管中分别加入2μL的模板cDNA。接着，以在95℃30秒、40次循环的(在95℃5秒、之后在60℃30秒)的条件实施实时PCR。接着，以在95℃15秒、在60℃30秒、在95℃15秒的条件使其解离，求出熔解曲线。对于人牙髓干细胞也进行同样的操作。将结果示于下述表9～11、图4和图5中。

[表9]

^*1：由猪来源导入基因标准试样的扩增曲线(二阶微分曲线)求出。

[表10]

*2：慢病毒

*3：人乳头瘤病毒E7、人端粒酶逆转录酶(hTERT)

*4：bmi、hTERT

*5：bmi、人乳头瘤病毒E6、hTERT

*6：bmi、人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7、hTERT

[表11]

(7)结果

以由上述实时PCR的二阶微分曲线计算出的Ct值为X轴、以总RNA的相对值为Y轴，分别进行作图，制作各基因的校正曲线。由该校正曲线计算出各基因的表达量，将导入基因的表达量除以作为各自的内标基因的β肌动蛋白的表达量，由此进行样品间的校正。

由猪来源导入基因试样的实时PCR的结果显示：在导入了基因的猪牙髓干细胞中，观察到了导入基因的扩增；与此相对，在未导入基因的该细胞中，未观察到扩增。这表明使用在上述实施例1中制作的慢病毒载体导入的基因在导入了基因的猪牙髓干细胞中进行了表达。

另外，由猪来源内标基因试样的实时PCR的结果显示：内标基因进行了扩增。图4和图5中示出了将病毒#1的表达量设为1时的猪牙髓干细胞和猪脂肪干细胞中的各导入基因的表达量的相对值。以相对表达量来看，显示出：猪牙髓干细胞中的导入基因的表达量在病毒#4中与病毒#1接近，其他2种为其一半以下。在猪脂肪干细胞的情况下，病毒#4的表达率为病毒#1的大致一半，使用病毒#2和病毒#3的情况下的表达量低、为1/3～小于1/5。

上述表10以及图6(A)和图6(B)中示出了人牙髓干细胞中的基因表达状态。在人牙髓干细胞中，也与上述猪的各干细胞的情况同样地显示出病毒#4与病毒#1接近。另外显示出：使用其他2种的情况下的表达率低于猪干细胞的情况、为1/5～1/10以下。

由以上确认到：虽然表达效率不同且具有种属差异，但在上述的基因导入细胞中，导入的基因全部进行了表达。

(实施例6)基因导入株的试剂选择和基因表达分析(池细胞的制备)

(1)逆转录病毒载体基因导入细胞的制作

使用台盼蓝染色和血细胞计数板对如上建立的细胞中的活细胞数进行计数，以6×10⁶细胞/10mL接种在加入有培养用培养基的直径10cm的培养皿中，在37℃的CO₂温箱内培养约24小时。在细胞密度达到7～9成汇合时，稀释成6×10⁴细胞/mL的浓度，进行传代。另外，与上述实施例5同样地确认有无支原体感染。判定结果全部为阴性。

(2)逆转录病毒载体基因的导入和试剂选择

使上述实施例2中制作的逆转录病毒载体感染上述实施例3中得到的各干细胞，利用GENETICIN添加培养基选择目的基因的稳定表达株。此时，搭载有永生化基因的逆转录病毒载体中的基因的组合为：细胞A-1和A-2为(hTERT,HPV16_E6,HPV16_E7)这三种基因、细胞B-1和B-2为(hTERT,hBmi-1,HPV16_E6,HPV16_E7)这四种基因。在感染时，对于细胞A-1和B-1，将逆转录病毒载体溶液稀释成4倍来制备，对于细胞A-2和B-2，将逆转录病毒载体稀释成10倍来制备。

逆转录病毒载体向各干细胞(靶细胞)中的导入以及导入后的试剂选择依据上述实施例5来进行。将试剂选择后的细胞群作为试剂抗性池细胞进行回收并冷冻保存。另外，为了进行实时PCR分析，制备5×10⁵个细胞的团块，在-80℃保存。

(3)总RNA的制备

总RNA的制备使用NucleoSpin RNA II(MACHEREY-NAGEL公司制造的试剂盒)与上述实施例5同样地进行。将由各细胞团块得到的总RNA的提取结果示于下述表12。

[表12]

*：未处理的靶细胞株

(4)逆转录反应和实时PCR

(4-1)逆转录反应

使用逆转录反应试剂盒(PrimeScript RT试剂盒(Perfect Real time、宝生物株式会社制造))，由如上得到的总RNA样品进行逆转录反应。

制备包含4μL的5×PrimeScript缓冲液(最终浓度为1倍)、1μL的PrimeScript RT酶混合物、1μL的随机6聚体(100μM、最终浓度为5μM)、10μL的总RNA和4μL的2次蒸馏水(D2W)的20μL的预混合物(反应液)。接着，将预混合物以各10μL分装到PCR管中，向各管中加入10μL的模板RNA，以在37℃反应15分钟、在85℃反应5秒、之后设定为4℃的条件进行逆转录。所得到的产物(逆转录反应液)用于以下的实时PCR。

(4-2)使用SYBR Premix Ex Taq的实时PCR

将12.5μL的SYBR Premix Ex Taq II(×2、最终浓度为1倍)、0.5μL的PCR引物混合物(10μM、最终浓度分别为0.2μM)、2.0μL的逆转录反应液以及10.0μL的灭菌蒸馏水混合，制备实时PCR用预混合物(25.0μL)。引物以0.4μM的最终浓度使用。作为标准基因，使用人β-肌动蛋白。在PCR中使用上述表7所示的碱基序列的引物(序列表的序列编号10～15)，如上述表8所示制备标准样品。

将上述的预混合物以各25μL分装到实时PCR用管中，使用实时PCR装置(ThermalCycler Dice实时系统：宝生物株式会社制造)，以在95℃30秒、40次循环的(在95℃5秒、之后在60℃30秒)的条件进行实时PCR。接着，以在95℃15秒、在60℃30秒、在95℃15秒的条件进行解离，求出熔解曲线。

熔解曲线是升高PCR后的反应液的温度，以温度为X轴、以荧光强度为Y轴分别进行作图而得到的曲线图。另外，一阶微分曲线的峰表示各PCR扩增产物的双链DNA解离成单链DNA时的温度、即Tm值(熔解温度)，将其作为PCR扩增产物相同的标准。在本实施例中，对人牙髓干细胞进行了作业。将结果示于下述表13、图8和图9中(n＝2)。另外，下述表13的相对表达量是将试样1的β-肌动蛋白的校正后的相对表达量设为1的情况下的各试样的相对表达量。

[表13]

*1：二阶微分曲线(对PCR产物的扩增曲线的荧光强度进行二阶微分而得到的曲线图)

(5)结果

以由上述实时PCR的二阶微分曲线计算出的Ct值为X轴、以总RNA的相对值为Y轴分别进行作图，制作各基因的校正曲线。由该校正曲线计算出各基因的表达量，将导入基因的表达量除以作为各自的内标基因的β肌动蛋白的表达量，由此进行试样间的校正。

由人来源导入基因试样的实时PCR的结果显示：在导入了基因的人牙髓干细胞中，观察到了导入基因的扩增；与此相对，在未导入基因的该细胞中，未观察到扩增。这表明使用在上述实施例1中制作的逆转录病毒载体导入的基因在导入了基因的人牙髓干细胞中进行了表达。

另外，由人来源内标基因试样的实时PCR的结果显示：内标基因进行了扩增。图9中示出了将试样1的表达量设为1时的人牙髓干细胞中的各导入基因的表达量的相对值。以相对表达量来看，显示出：人牙髓干细胞中的导入基因的表达量在试样3中与试样1接近，其他2种为6成左右。

由上述表13和图9可知，在人牙髓干细胞中，在导入了3种基因的情况下以及导入了4种基因的情况下均确认到了hTERT的表达。

(实施例7)单细胞克隆和基因表达分析

(1)材料和方法

作为单细胞克隆用的细胞，使用实施例5中制备的基因导入细胞。另外，所使用的培养用培养基和选择试剂、逆转录反应和实时PCR中使用的试剂盒和试剂等与实施例1～6中所记载的相同，培养方法等实验方法以及各种条件也相同。

(2)扩大培养

将上述导入基因稳定表达细胞群以1×10³个/皿的细胞浓度接种在60mm培养皿中，在CO₂温箱中于37℃培养24小时。之后，更换成包含上述选择试剂(G418)的生长培养基(含有10％FBS的DMEM)，继续进行培养，使其形成集落。与上述实施例4和5同样地，对于所形成的集落，使用克隆环和剥离剂将每个克隆剥离，分别接种在24孔板中。在24孔板中增殖后，接种在60mm培养皿中使其增殖，接着依次接种在100mm培养皿、之后接种在T-225烧瓶中使其增殖，进行扩大培养。基因导入中使用的病毒载体与上述相同。

(3)单克隆化的结果

对于猪乳牙牙髓干细胞来源的导入基因稳定表达细胞株，进行2次单细胞克隆化，获得下述表14所示的5个克隆。对于猪脂肪干细胞来源的导入基因稳定表达细胞株，也进行2次单细胞克隆化，但在培养的过程中全部细胞死亡，无法获得克隆。

另一方面，对于人乳牙牙髓干细胞来源的导入基因稳定表达细胞株，针对病毒#1、病毒#3和病毒#4分别获得了下述表14所示的5个克隆。另一方面，在感染了病毒#2的细胞中，在扩大培养中细胞发生肥大化，未增殖到所需要的细胞数，因而中断了作业。

[表14]

(4)基因表达分析

对于上述(3)中得到的基因稳定表达细胞株的克隆细胞，使用实时PCR测定导入基因和内标基因的表达。与上述实施例3同样地，使用NucleoSpin RNA从上述表14所示的各克隆细胞约5×10⁵个中制备总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒，以所得到的总RNA作为模板进行逆转录反应，得到模板cDNA。

之后，使用SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)以及对导入基因和内标基因分别具有特异性的引物(序列表的序列编号16～19)，以逆转录产物作为模板，利用上述的实时PCR装置(Thermal Cycler Dice实时系统)，在与实施例3同样的反应条件下进行实时PCR。各操作按照上述试剂盒所附带的操作手册来进行。

(5)导入基因的表达结果

以由上述实时PCR的二阶微分曲线计算出的Ct值为X轴、以总RNA的相对值为Y轴分别进行作图，制作各基因的表达量测定用的校正曲线。与上述实施例6(5)同样地进行样品间的校正。

下述表15～17、图6(A)和(B)中分别示出了将使用病毒#1导入了基因的池细胞的表达量设为1时的猪牙髓干细胞来源的导入基因和人牙髓干细胞来源的导入基因的表达量的相对值。

[表15]

*1：由猪来源导入基因标准试样的扩增曲线(二阶微分曲线)求出。

[表16]

[表17]

由以上确认：在人乳牙牙髓干细胞来源的导入基因稳定表达株中，所导入的基因在全部表达株中均进行了表达。另外还显示出：根据所导入的基因的不同，表达量存在相当大的差异。

另外，在图10(A)～图10(E)中示出对所得到的克隆进行培养时的显微镜照片。均确认到：细胞的大小非常一致，达到完美的汇合，正常地进行了增殖。

工业实用性

本发明在医药和诊断药的领域中有用。

序列表自由文本

序列编号1：包含导入到细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(1)。

序列编号2：包含导入到细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(2)。

序列编号3：包含导入到细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(3)。

序列编号4：包含导入到细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(4)。

序列编号5：包含导入到细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(5)。

序列编号6：包含导入到细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(6)。

序列编号7：包含导入到细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(7)。

序列编号8：包含导入到细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(8)。

序列编号9：包含导入到细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(9)。

序列编号10：PCR用引物(1)。

序列编号11：PCR用引物(2)。

序列编号12：PCR用引物(3)。

序列编号13：PCR用引物(4)。

序列编号14：PCR用引物(5)。

序列编号15：PCR用引物(6)。

序列编号16：PCR用引物(7)。

序列编号17：PCR用引物(8)。

序列编号18：PCR用引物(9)。

序列编号19：PCR用引物(10)。

序列表

<110> 石匠株式会社(Quarrymen&Co. Inc.)

<120> 永生化干细胞及其制作方法(A method for producing immortal stem celland a sell produced)

<130> P16QU004PCT

<150> 2015-21748

<151> 2015-11-05

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3928

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SYN4122-1-7

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3928)

<223> 基因导入用DNA片段(DNA fragment for gene transduction)

<400> 1

acgctgtttt gacctccata gaagacaccg actctactag aggatctatt tccggtgaat 60

tcgccaccca tggagataca cctacattgc atgaatatat gttagatttg caaccagaga 120

caactgatct ctactgttat gagcaattaa atgacagctc agaggaggag gatgaaatag 180

atggtccagc tggacaagca gaaccggaca gagcccatta caatattgta accttttgtt 240

gcaagtgtga ctctacgctt cggttgtgcg tacaaagcac acacgtagac attcgtactt 300

tggaagacct gttaatgggc acactaggaa ttgtgtgccc catctgttct cagaaaccag 360

gatctgaagg taggggaagt ttgcttactt gcggtgacgt cgaagagaat ccaggaccag 420

atggccgcaa catgccgcgc gctccccgct gccgagccgt gcgctccctg ctgcgcagcc 480

actaccgcga ggtgctgccg ctggccacgt tcgtgcggcg cctggggccc cagggctggc 540

ggctggtgca gcgcggggac ccggcggctt tccgcgcgct ggtggcccag tgcctggtgt 600

gcgtgccctg ggacgcacgg ccgccccccg ccgccccctc cttccgccag gtgtcctgcc 660

tgaaggagct ggtggcccga gtgctgcaga ggctgtgcga gcgcggcgcg aagaacgtgc 720

tggccttcgg cttcgcgctg ctggacgggg cccgcggggg cccccccgag gccttcacca 780

ccagcgtgcg cagctacctg cccaacacgg tgaccgacgc actgcggggg agcggggcgt 840

gggggctgct gctgcgccgc gtgggcgacg acgtgctggt tcacctgctg gcacgctgcg 900

cgctctttgt gctggtggct cccagctgcg cctaccaggt gtgcgggccg ccgctgtacc 960

agctcggcgc tgccactcag gcccggcccc cgccacacgc tagtggaccc cgaaggcgtc 1020

tgggatgcga acgggcctgg aaccatagcg tcagggaggc cggggtcccc ctgggcctgc 1080

cagccccggg tgcgaggagg cgcgggggca gtgccagccg aagtctgccg ttgcccaaga 1140

ggcccaggcg tggcgctgcc cctgagccgg agcggacgcc cgttgggcag gggtcctggg 1200

cccacccggg caggacgcgt ggaccgagtg accgtggttt ctgtgtggtg tcacctgcca 1260

gacccgccga agaagccacc tctttggagg gtgcgctctc tggcacgcgc cactcccacc 1320

catccgtggg ccgccagcac cacgcgggcc ccccatccac atcgcggcca ccacgtccct 1380

gggacacgcc ttgtcccccg gtgtacgccg agaccaagca cttcctctac tcctcaggcg 1440

acaaggagca gctgcggccc tccttcctac tcagctctct gaggcccagc ctgactggcg 1500

ctcggaggct cgtggagacc atctttctgg gttccaggcc ctggatgcca gggactcccc 1560

gcaggttgcc ccgcctgccc cagcgctact ggcaaatgcg gcccctgttt ctggagctgc 1620

ttgggaacca cgcgcagtgc ccctacgggg tgctcctcaa gacgcactgc ccgctgcgag 1680

ctgcggtcac cccagcagcc ggtgtctgtg cccgggagaa gccccagggc tctgtggcgg 1740

cccccgagga ggaggacaca gacccccgtc gcctggtgca gctgctccgc cagcacagca 1800

gcccctggca ggtgtacggc ttcgtgcggg cctgcctgcg ccggctggtg cccccaggcc 1860

tctggggctc caggcacaac gaacgccgct tcctcaggaa caccaagaag ttcatctccc 1920

tggggaagca tgccaagctc tcgctgcagg agctgacgtg gaagatgagc gtgcgggact 1980

gcgcttggct gcgcaggagc ccaggggttg gctgtgttcc ggccgcagag caccgtctgc 2040

gtgaggagat cctggccaag ttcctgcact ggctgatgag tgtgtacgtc gtcgagctgc 2100

tcaggtcttt cttttatgtc acggagacca cgtttcaaaa gaacaggctc tttttctacc 2160

ggaagagtgt ctggagcaag ttgcaaagca ttggaatcag acagcacttg aagagggtgc 2220

agctgcggga gctgtcggaa gcagaggtca ggcagcatcg ggaagccagg cccgccctgc 2280

tgacgtccag actccgcttc atccccaagc ctgacgggct gcggccgatt gtgaacatgg 2340

actacgtcgt gggagccaga acgttccgca gagaaaagag ggccgagcgt ctcacctcga 2400

gggtgaaggc actgttcagc gtgctcaact acgagcgggc gcggcgcccc ggcctcctgg 2460

gcgcctctgt gctgggcctg gacgatatcc acagggcctg gcgcaccttc gtgctgcgtg 2520

tgcgggccca ggacccgccg cctgagctgt actttgtcaa ggtggatgtg acgggcgcgt 2580

acgacaccat cccccaggac aggctcacgg aggtcatcgc cagcatcatc aaaccccaga 2640

acacgtactg cgtgcgtcgg tatgccgtgg tccagaaggc cgcccatggg cacgtccgca 2700

aggccttcaa gagccacgtc tctaccttga cagacctcca gccgtacatg cgacagttcg 2760

tggctcacct gcaggagacc agcccgctga gggatgccgt cgtcatcgag cagagctcct 2820

ccctgaatga ggccagcagt ggcctcttcg acgtcttcct acgcttcatg tgccaccacg 2880

ccgtgcgcat caggggcaag tcctacgtcc agtgccaggg gatcccgcag ggctccatcc 2940

tctccacgct gctctgcagc ctgtgctacg gcgacatgga gaacaagctg tttgcgggga 3000

ttcggcggga cgggctgctc ctgcgtttgg tggatgattt cttgttggtg acacctcacc 3060

tcacccacgc gaaaaccttc ctcaggaccc tggtccgagg tgtccctgag tatggctgcg 3120

tggtgaactt gcggaagaca gtggtgaact tccctgtaga agacgaggcc ctgggtggca 3180

cggcttttgt tcagatgccg gcccacggcc tattcccctg gtgcggcctg ctgctggata 3240

cccggaccct ggaggtgcag agcgactact ccagctatgc ccggacctcc atcagagcca 3300

gtctcacctt caaccgcggc ttcaaggctg ggaggaacat gcgtcgcaaa ctctttgggg 3360

tcttgcggct gaagtgtcac agcctgtttc tggatttgca ggtgaacagc ctccagacgg 3420

tgtgcaccaa catctacaag atcctcctgc tgcaggcgta caggtttcac gcatgtgtgc 3480

tgcagctccc atttcatcag caagtttgga agaaccccac atttttcctg cgcgtcatct 3540

ctgacacggc ctccctctgc tactccatcc tgaaagccaa gaacgcaggg atgtcgctgg 3600

gggccaaggg cgccgccggc cctctgccct ccgaggccgt gcagtggctg tgccaccaag 3660

cattcctgct caagctgact cgacaccgtg tcacctacgt gccactcctg gggtcactca 3720

ggacagccca gacgcagctg agtcggaagc tcccggggac gacgctgact gccctggagg 3780

ccgcagccaa cccggcactg ccctcagact tcaagaccat cctggactga ggatccaatt 3840

ctaccgggta ggggaggcgc ttttcccaag gcagtctgga gcatgcgctt tagcagcccc 3900

gctgggcact tggcgctaca caagtggc 3928

<210> 2

<211> 2556

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SYN4122-2-2

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2556)

<400> 2

ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgactc tactagagga tctatttccg 60

gtgaattcgc cacccatcga acaacgagaa tcaagatcac tgagctaaat ccccacctga 120

tgtgtgtgct ttgtggaggg tacttcattg atgccacaac cataatagaa tgtctacatt 180

ccttctgtaa aacgtgtatt gttcgttacc tggagaccag caagtattgt cctatttgtg 240

atgtccaagt tcacaagacc agaccactac tgaatataag gtcagataaa actctccaag 300

atattgtata caaattagtt ccagggcttt tcaaaaatga aatgaagaga agaagggatt 360

tttatgcagc tcatccttct gctgatgctg ccaatggctc taatgaagat agaggagagg 420

ttgcagatga agataagaga attataactg atgatgagat aataagctta tccattgaat 480

tctttgacca gaacagattg gatcggaaag taaacaaaga caaagagaaa tctaaggagg 540

aggtgaatga taaaagatac ttacgatgcc cagcagcaat gactgtgatg cacttaagaa 600

agtttctcag aagtaaaatg gacataccta atactttcca gattgatgtc atgtatgagg 660

aggaaccttt aaaggattat tatacactaa tggatattgc ctacatttat acctggagaa 720

ggaatggtcc acttccattg aaatacagag ttcgacctac ttgtaaaaga atgaagatca 780

gtcaccagag agatggactg acaaatgctg gagaactgga aagtgactct gggagtgaca 840

aggccaacag cccagcagga ggtattccct ccacctcttc ttgtttgcct agccccagta 900

ctccagtgca gtctcctcat ccacagtttc ctcacatttc cagtactatg aatggaacca 960

gcaacagccc cagcggtaac caccaatctt cttttgccaa tagacctcga aaatcatcag 1020

taaatgggtc atcagcaact tcttctggtg gatctgaagg taggggaagt ttgcttactt 1080

gcggtgacgt cgaagagaat ccaggaccag atggccgcaa catgccgcgc gctccccgct 1140

gccgagccgt gcgctccctg ctgcgcagcc actaccgcga ggtgctgccg ctggccacgt 1200

tcgtgcggcg cctggggccc cagggctggc ggctggtgca gcgcggggac ccggcggctt 1260

tccgcgcgct ggtggcccag tgcctggtgt gcgtgccctg ggacgcacgg ccgccccccg 1320

ccgccccctc cttccgccag gtgtcctgcc tgaaggagct ggtggcccga gtgctgcaga 1380

ggctgtgcga gcgcggcgcg aagaacgtgc tggccttcgg cttcgcgctg ctggacgggg 1440

cccgcggggg cccccccgag gccttcacca ccagcgtgcg cagctacctg cccaacacgg 1500

tgaccgacgc actgcggggg agcggggcgt gggggctgct gctgcgccgc gtgggcgacg 1560

acgtgctggt tcacctgctg gcacgctgcg cgctctttgt gctggtggct cccagctgcg 1620

cctaccaggt gtgcgggccg ccgctgtacc agctcggcgc tgccactcag gcccggcccc 1680

cgccacacgc tagtggaccc cgaaggcgtc tgggatgcga acgggcctgg aaccatagcg 1740

tcagggaggc cggggtcccc ctgggcctgc cagccccggg tgcgaggagg cgcgggggca 1800

gtgccagccg aagtctgccg ttgcccaaga ggcccaggcg tggcgctgcc cctgagccgg 1860

agcggacgcc cgttgggcag gggtcctggg cccacccggg caggacgcgt ggaccgagtg 1920

accgtggttt ctgtgtggtg tcacctgcca gacccgccga agaagccacc tctttggagg 1980

gtgcgctctc tggcacgcgc cactcccacc catccgtggg ccgccagcac cacgcgggcc 2040

ccccatccac atcgcggcca ccacgtccct gggacacgcc ttgtcccccg gtgtacgccg 2100

agaccaagca cttcctctac tcctcaggcg acaaggagca gctgcggccc tccttcctac 2160

tcagctctct gaggcccagc ctgactggcg ctcggaggct cgtggagacc atctttctgg 2220

gttccaggcc ctggatgcca gggactcccc gcaggttgcc ccgcctgccc cagcgctact 2280

ggcaaatgcg gcccctgttt ctggagctgc ttgggaacca cgcgcagtgc ccctacgggg 2340

tgctcctcaa gacgcactgc ccgctgcgag ctgcggtcac cccagcagcc ggtgtctgtg 2400

cccgggagaa gccccagggc tctgtggcgg cccccgagga ggaggacaca gacccccgtc 2460

gcctggtgca gctgctccgc cagcacagca gcccctggca ggtgtacggc ttcgtgcggg 2520

cctgcctgcg ccggctggtg cccccaggcc tctggg 2556

<210> 3

<211> 2983

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SYN4122-3-3

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2983)

<400> 3

ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgactctact agaggatcta tttccggtga 60

attcgccacc catcgaacaa cgagaatcaa gatcactgag ctaaatcccc acctgatgtg 120

tgtgctttgt ggagggtact tcattgatgc cacaaccata atagaatgtc tacattcctt 180

ctgtaaaacg tgtattgttc gttacctgga gaccagcaag tattgtccta tttgtgatgt 240

ccaagttcac aagaccagac cactactgaa tataaggtca gataaaactc tccaagatat 300

tgtatacaaa ttagttccag ggcttttcaa aaatgaaatg aagagaagaa gggattttta 360

tgcagctcat ccttctgctg atgctgccaa tggctctaat gaagatagag gagaggttgc 420

agatgaagat aagagaatta taactgatga tgagataata agcttatcca ttgaattctt 480

tgaccagaac agattggatc ggaaagtaaa caaagacaaa gagaaatcta aggaggaggt 540

gaatgataaa agatacttac gatgcccagc agcaatgact gtgatgcact taagaaagtt 600

tctcagaagt aaaatggaca tacctaatac tttccagatt gatgtcatgt atgaggagga 660

acctttaaag gattattata cactaatgga tattgcctac atttatacct ggagaaggaa 720

tggtccactt ccattgaaat acagagttcg acctacttgt aaaagaatga agatcagtca 780

ccagagagat ggactgacaa atgctggaga actggaaagt gactctggga gtgacaaggc 840

caacagccca gcaggaggta ttccctccac ctcttcttgt ttgcctagcc ccagtactcc 900

agtgcagtct cctcatccac agtttcctca catttccagt actatgaatg gaaccagcaa 960

cagccccagc ggtaaccacc aatcttcttt tgccaataga cctcgaaaat catcagtaaa 1020

tgggtcatca gcaacttctt ctggtggatc tgaaggcaga ggctctctgc tgacatgtgg 1080

ggatgtggag gaaaatcctg gccctacgcg tcaccaaaag agaactgcaa tgtttcagga 1140

cccacaggag cgacccagaa agttaccaca gttatgcaca gagctgcaaa caactataca 1200

tgatataata ttagaatgtg tgtactgcaa gcaacagtta ctgcgacgtg aggtatatga 1260

ctttgctttt cgggatttat gcatagtata tagagatggg aatccatatg ctgtatgtga 1320

taaatgttta aagttttatt ctaaaattag tgagtataga cattattgtt atagtttgta 1380

tggaacaaca ttagaacagc aatacaacaa accgttgtgt gatttgttaa ttaggtgtat 1440

taactgtcaa aagccactgt gtcctgaaga aaagcaaaga catctggaca aaaagcaaag 1500

attccataat ataaggggtc ggtggaccgg tcgatgtatg tcttgttgca gatcatcaag 1560

aacacgtaga gaaacccagc tgggatctga aggtagggga agtttgctta cttgcggtga 1620

cgtcgaagag aatccaggac cagatggccg caacatgccg cgcgctcccc gctgccgagc 1680

cgtgcgctcc ctgctgcgca gccactaccg cgaggtgctg ccgctggcca cgttcgtgcg 1740

gcgcctgggg ccccagggct ggcggctggt gcagcgcggg gacccggcgg ctttccgcgc 1800

gctggtggcc cagtgcctgg tgtgcgtgcc ctgggacgca cggccgcccc ccgccgcccc 1860

ctccttccgc caggtgtcct gcctgaagga gctggtggcc cgagtgctgc agaggctgtg 1920

cgagcgcggc gcgaagaacg tgctggcctt cggcttcgcg ctgctggacg gggcccgcgg 1980

gggccccccc gaggccttca ccaccagcgt gcgcagctac ctgcccaaca cggtgaccga 2040

cgcactgcgg gggagcgggg cgtgggggct gctgctgcgc cgcgtgggcg acgacgtgct 2100

ggttcacctg ctggcacgct gcgcgctctt tgtgctggtg gctcccagct gcgcctacca 2160

ggtgtgcggg ccgccgctgt accagctcgg cgctgccact caggcccggc ccccgccaca 2220

cgctagtgga ccccgaaggc gtctgggatg cgaacgggcc tggaaccata gcgtcaggga 2280

ggccggggtc cccctgggcc tgccagcccc gggtgcgagg aggcgcgggg gcagtgccag 2340

ccgaagtctg ccgttgccca agaggcccag gcgtggcgct gcccctgagc cggagcggac 2400

gcccgttggg caggggtcct gggcccaccc gggcaggacg cgtggaccga gtgaccgtgg 2460

tttctgtgtg gtgtcacctg ccagacccgc cgaagaagcc acctctttgg agggtgcgct 2520

ctctggcacg cgccactccc acccatccgt gggccgccag caccacgcgg gccccccatc 2580

cacatcgcgg ccaccacgtc cctgggacac gccttgtccc ccggtgtacg ccgagaccaa 2640

gcacttcctc tactcctcag gcgacaagga gcagctgcgg ccctccttcc tactcagctc 2700

tctgaggccc agcctgactg gcgctcggag gctcgtggag accatctttc tgggttccag 2760

gccctggatg ccagggactc cccgcaggtt gccccgcctg ccccagcgct actggcaaat 2820

gcggcccctg tttctggagc tgcttgggaa ccacgcgcag tgcccctacg gggtgctcct 2880

caagacgcac tgcccgctgc gagctgcggt caccccagca gccggtgtct gtgcccggga 2940

gaagccccag ggctctgtgg cggcccccga ggaggaggac aca 2983

<210> 4

<211> 2223

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SYN4122-4-4

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2223)

<400> 4

acgctgtttt gacctccata gaagacaccg actctactag aggatctatt tccggtgaat 60

tcgccaccca ccaaaagaga actgcaatgt ttcaggaccc acaggagcga cccagaaagt 120

taccacagtt atgcacagag ctgcaaacaa ctatacatga tataatatta gaatgtgtgt 180

actgcaagca acagttactg cgacgtgagg tatatgactt tgcttttcgg gatttatgca 240

tagtatatag agatgggaat ccatatgctg tatgtgataa atgtttaaag ttttattcta 300

aaattagtga gtatagacat tattgttata gtttgtatgg aacaacatta gaacagcaat 360

acaacaaacc gttgtgtgat ttgttaatta ggtgtattaa ctgtcaaaag ccactgtgtc 420

ctgaagaaaa gcaaagacat ctggacaaaa agcaaagatt ccataatata aggggtcggt 480

ggaccggtcg atgtatgtct tgttgcagat catcaagaac acgtagagaa acccagctgg 540

gatctgaagg cagaggctct ctgctgacat gtggggatgt ggaggaaaat cctggcccta 600

cgcgtcatgg agatacacct acattgcatg aatatatgtt agatttgcaa ccagagacaa 660

ctgatctcta ctgttatgag caattaaatg acagctcaga ggaggaggat gaaatagatg 720

gtccagctgg acaagcagaa ccggacagag cccattacaa tattgtaacc ttttgttgca 780

agtgtgactc tacgcttcgg ttgtgcgtac aaagcacaca cgtagacatt cgtactttgg 840

aagacctgtt aatgggcaca ctaggaattg tgtgccccat ctgttctcag aaaccaggat 900

ctgaaggtag gggaagtttg cttacttgcg gtgacgtcga agagaatcca ggaccagatg 960

gccgcaacat gccgcgcgct ccccgctgcc gagccgtgcg ctccctgctg cgcagccact 1020

accgcgaggt gctgccgctg gccacgttcg tgcggcgcct ggggccccag ggctggcggc 1080

tggtgcagcg cggggacccg gcggctttcc gcgcgctggt ggcccagtgc ctggtgtgcg 1140

tgccctggga cgcacggccg ccccccgccg ccccctcctt ccgccaggtg tcctgcctga 1200

aggagctggt ggcccgagtg ctgcagaggc tgtgcgagcg cggcgcgaag aacgtgctgg 1260

ccttcggctt cgcgctgctg gacggggccc gcgggggccc ccccgaggcc ttcaccacca 1320

gcgtgcgcag ctacctgccc aacacggtga ccgacgcact gcgggggagc ggggcgtggg 1380

ggctgctgct gcgccgcgtg ggcgacgacg tgctggttca cctgctggca cgctgcgcgc 1440

tctttgtgct ggtggctccc agctgcgcct accaggtgtg cgggccgccg ctgtaccagc 1500

tcggcgctgc cactcaggcc cggcccccgc cacacgctag tggaccccga aggcgtctgg 1560

gatgcgaacg ggcctggaac catagcgtca gggaggccgg ggtccccctg ggcctgccag 1620

ccccgggtgc gaggaggcgc gggggcagtg ccagccgaag tctgccgttg cccaagaggc 1680

ccaggcgtgg cgctgcccct gagccggagc ggacgcccgt tgggcagggg tcctgggccc 1740

acccgggcag gacgcgtgga ccgagtgacc gtggtttctg tgtggtgtca cctgccagac 1800

ccgccgaaga agccacctct ttggagggtg cgctctctgg cacgcgccac tcccacccat 1860

ccgtgggccg ccagcaccac gcgggccccc catccacatc gcggccacca cgtccctggg 1920

acacgccttg tcccccggtg tacgccgaga ccaagcactt cctctactcc tcaggcgaca 1980

aggagcagct gcggccctcc ttcctactca gctctctgag gcccagcctg actggcgctc 2040

ggaggctcgt ggagaccatc tttctgggtt ccaggccctg gatgccaggg actccccgca 2100

ggttgccccg cctgccccag cgctactggc aaatgcggcc cctgtttctg gagctgcttg 2160

ggaaccacgc gcagtgcccc tacggggtgc tcctcaagac gcactgcccg ctgcgagctg 2220

cgg 2223

<210> 5

<211> 3399

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<220>

<221> 基因(gene)

<222> (1)..(3399)

<223> hTERT, 基因导入用DNA片段(DNA fragment for gene transduction)

<400> 5

atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60

gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag 120

cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180

gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240

gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc 300

ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc 360

agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg 420

ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg 480

ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct 540

gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa 600

cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt 660

gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt 720

ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc 780

aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa 840

gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc 900

cgccagcacc acgcgggccc cccatccaca tcgcggccac cacgtccctg ggacacgcct 960

tgtcccccgg tgtacgccga gaccaagcac ttcctctact cctcaggcga caaggagcag 1020

ctgcggccct ccttcctact cagctctctg aggcccagcc tgactggcgc tcggaggctc 1080

gtggagacca tctttctggg ttccaggccc tggatgccag ggactccccg caggttgccc 1140

cgcctgcccc agcgctactg gcaaatgcgg cccctgtttc tggagctgct tgggaaccac 1200

gcgcagtgcc cctacggggt gctcctcaag acgcactgcc cgctgcgagc tgcggtcacc 1260

ccagcagccg gtgtctgtgc ccgggagaag ccccagggct ctgtggcggc ccccgaggag 1320

gaggacacag acccccgtcg cctggtgcag ctgctccgcc agcacagcag cccctggcag 1380

gtgtacggct tcgtgcgggc ctgcctgcgc cggctggtgc ccccaggcct ctggggctcc 1440

aggcacaacg aacgccgctt cctcaggaac accaagaagt tcatctccct ggggaagcat 1500

gccaagctct cgctgcagga gctgacgtgg aagatgagcg tgcgggactg cgcttggctg 1560

cgcaggagcc caggggttgg ctgtgttccg gccgcagagc accgtctgcg tgaggagatc 1620

ctggccaagt tcctgcactg gctgatgagt gtgtacgtcg tcgagctgct caggtctttc 1680

ttttatgtca cggagaccac gtttcaaaag aacaggctct ttttctaccg gaagagtgtc 1740

tggagcaagt tgcaaagcat tggaatcaga cagcacttga agagggtgca gctgcgggag 1800

ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga 1860

ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cggccgattg tgaacatgga ctacgtcgtg 1920

ggagccagaa cgttccgcag agaaaagagg gccgagcgtc tcacctcgag ggtgaaggca 1980

ctgttcagcg tgctcaacta cgagcgggcg cggcgccccg gcctcctggg cgcctctgtg 2040

ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag 2100

gacccgccgc ctgagctgta ctttgtcaag gtggatgtga cgggcgcgta cgacaccatc 2160

ccccaggaca ggctcacgga ggtcatcgcc agcatcatca aaccccagaa cacgtactgc 2220

gtgcgtcggt atgccgtggt ccagaaggcc gcccatgggc acgtccgcaa ggccttcaag 2280

agccacgtct ctaccttgac agacctccag ccgtacatgc gacagttcgt ggctcacctg 2340

caggagacca gcccgctgag ggatgccgtc gtcatcgagc agagctcctc cctgaatgag 2400

gccagcagtg gcctcttcga cgtcttccta cgcttcatgt gccaccacgc cgtgcgcatc 2460

aggggcaagt cctacgtcca gtgccagggg atcccgcagg gctccatcct ctccacgctg 2520

ctctgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt ttgcggggat tcggcgggac 2580

gggctgctcc tgcgtttggt ggatgatttc ttgttggtga cacctcacct cacccacgcg 2640

aaaaccttcc tcaggaccct ggtccgaggt gtccctgagt atggctgcgt ggtgaacttg 2700

cggaagacag tggtgaactt ccctgtagaa gacgaggccc tgggtggcac ggcttttgtt 2760

cagatgccgg cccacggcct attcccctgg tgcggcctgc tgctggatac ccggaccctg 2820

gaggtgcaga gcgactactc cagctatgcc cggacctcca tcagagccag tctcaccttc 2880

aaccgcggct tcaaggctgg gaggaacatg cgtcgcaaac tctttggggt cttgcggctg 2940

aagtgtcaca gcctgtttct ggatttgcag gtgaacagcc tccagacggt gtgcaccaac 3000

atctacaaga tcctcctgct gcaggcgtac aggtttcacg catgtgtgct gcagctccca 3060

tttcatcagc aagtttggaa gaaccccaca tttttcctgc gcgtcatctc tgacacggcc 3120

tccctctgct actccatcct gaaagccaag aacgcaggga tgtcgctggg ggccaagggc 3180

gccgccggcc ctctgccctc cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaagc attcctgctc 3240

aagctgactc gacaccgtgt cacctacgtg ccactcctgg ggtcactcag gacagcccag 3300

acgcagctga gtcggaagct cccggggacg acgctgactg ccctggaggc cgcagccaac 3360

ccggcactgc cctcagactt caagaccatc ctggactga 3399

<210> 6

<211> 477

<212> DNA

<213> 人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16)

<220>

<221> 基因(gene)

<222> (1)..(477)

<223> HPV16 E6

<400> 6

atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60

cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120

aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180

tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240

agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300

aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360

gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420

ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaa 477

<210> 7

<211> 297

<212> DNA

<213> 人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16)

<220>

<221> 基因(gene)

<222> (1)..(297)

<223> HPV 16 E7,导入用基因(gene for transduction)

<400> 7

atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60

gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120

ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180

tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240

gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297

<210> 8

<211> 3396

<212> DNA

<213> swine(猪)

<220>

<221> 基因(gene)

<222> (1)..(3396)

<223> pigTERT, 基因导入用DNA片段(DNA fragment for gene transduction)

<400> 8

atgccgcgcg cgccccggtg ccgggccgtg cgctccctgc tccgggaccg ctacaggcag 60

gtgctgccgc tggccacctt cgtgcggcgc ctgggccctg agggccggcg gcttgttcgg 120

cgcggggacc cggcggccta ccgcgcgctg gtggcgcagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180

gacgcgcagc cgcctcctgc ctccccgtcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240

gtggccaggg tcgtgcagag gctctgcgag cgcggcgcga ggaacgtgct ggcctttggc 300

ttcgcgctgc tggacggggc tcgcggcggg ccgcccgtgg ccttcacgac cagcgtgcgc 360

agctacctgc ccaacaccgt gaccgacaca ctgcgcggga gcggcgcgtg ggggctgctg 420

ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctcacc cacctgttgg cgcgctgcgc gctgtacctg 480

ctggtgcccc cgagttgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cactctatga cctctacacc 540

gcagcggagg ctcggcccat gcgacacaag ggccagaccc cgactggcct cggactcacg 600

cgccccgttt gcaatgggga agccgggcga ccccaggagc agagggcgca aggtgtgagg 660

cgacgtcggg gcagagcggg gggacatcca cttccagcca agaggcccag gcacgtcccg 720

gagcctgaac agggtcccga agggcaggcg tcccgggccc accagggcag ggcgcctggg 780

ccgagcgaca gcgacccccc cgtgatgaca cctaccagag ccgctgcgaa agccaagtct 840

cgggagggtg aggcgcccgg aacccggcac ctttcccctc aagcaggcgg tgcgcggggt 900

acctgccccc catcctggtg gcagccacac ctccagggca agcccagtcc tcatgtgtgc 960

gctgccgaga ccaagcgctt cctctactgc tcggggagca aggaagggct gcgccgctcg 1020

ttcctgctct gctccctgcc gcccagcctg gcgggggccg ggaggctcgt ggaggtcatc 1080

tttctggcct caaagcccgg gcagccaggg gcgcgccgcg tgcccgcacg ctactggcgg 1140

atgaggcccc tgttccggga gctgcttaag aaccacgcgc ggtgccccta caaggcgctt 1200

ctcagggcgc actgcccgtt gcgggctgcg gcgaccctct cggggtccgg cggtcaggtg 1260

tgcgaccaca aagtgggccc cctcgctcca gagcggctgg cagcggccgc cgagggggac 1320

tcggcctcga ggcgcctagt ccagctgctc cgccagcaca gcagcccctg gcaggtgtac 1380

cgcctcctgc gggcctgtct tcaccggctg gtgcccccgg gcctctgggg ctccccgcac 1440

aacaagcggc gctttctgaa gaatgtgaag aagctcgtct ccctggggaa gcacgccagg 1500

ctctcgctgc aggagctgat gtggaagatg aaagtgcaag actgcatctg gctgcgccgg 1560

agcccggacg ctcgccatgt ccaggccgcc gagcaccgtc tgagagaggc cattctggcc 1620

aagttcctgc gctggttgat gggcacgtac gtggtcgagc tgctcaggtc gtttttttat 1680

gtcacggaga ccacgtttca gaagaaccgg ctcttcttct tccggaagcg catctggagc 1740

cggctgcaga gcgcaggcat caggcaacac ttagatcgtg tgcggcttcg agaactgtcg 1800

gaagcagaga tcaggcgacg ccgggaggcc aggcccgctg tactgacctc caagctccgc 1860

ttcgtcccca aacccgacgg gctgcggccc atcgtgaaca tggcgaacgt cgtgcgagcc 1920

aggacaggcc ccggagacaa gaaggtccgg cgtctcacgg ggcaggtcaa gacgctgttt 1980

gctgtgctga actacgagcg ggcgcggcgc ccgcgcctcc tgggggcctc cgtgctgggc 2040

gtgggtgaca tccacagggc gtggcgggcc tttgtgctgc ccctgcgggc ccaggacccg 2100

gcccccccgc tgtactttgt caaggtggac gtgacggggg cctacgacgc cctccctcag 2160

gacaggcttg ctgaggtggt cgccaacgtg atccggccct acgagagcac gtactgcgtg 2220

cgccagtgcg ccgtgctccg gaggaccgcc cgcgggcacg tgcgcaagtc cttccaaacc 2280

cacgtgtcca ccttcgcaga cctccagcct tacatgagac agtttgtggc acacctgcag 2340

gcaaccggcc cgctgaggga cgccgtggtc atcgagcaga gctgctctct gaacgaggcc 2400

ggcagccgtc ccctggagct tttcctgagc ctgctgcgaa accacgtcat ccggatcggg 2460

ggcaggtcct acgtccagtg tcaggggatc ccacagggct ccattctgtc cacgctgctc 2520

tgcagcctgt gctacgggga catggaaaac agactgtccc cggggatcca gcgtgacggg 2580

gtgctcctgc gcttggtgga cgacttcctg ctggtgaccc ctcacctgac acgagccaaa 2640

gcctttctca ggaccctggt ccgcggcgtg cccgagtacg gctgcctggc caacttgcgg 2700

aagacggccg tgaacttccc tgtggaggac ggcgcccggg gcggcccggc cccactgcag 2760

ctgccggcac actgcctgtt cccctggtgc gggctgctgc tggacacccg cacgctggag 2820

gtgcactgcg actatgccag ttacgcccgg acctcgatca gagcgagtct caccttcaac 2880

cagggcttca agcccgggag gaacatgcgc cgcaagctct tggcggtctt gcggctaaag 2940

tgccacggga tccttctgga cctgcaggtg aacagtcttc cgacggtgct cgccaacgtt 3000

tacaagatct tcctgctgca ggcctacagg ttccacgcgt gtgtgctgca gctgcccttc 3060

cgtcagccgc ttgcgaggaa cccctcattt ttcctccggc ttgtctccga caccgcgtcc 3120

tgctgctact cgctcctgaa agccagaaac gcagggatgt ccctgggagc caggggcgcc 3180

tccggcccgt ttccctctga agccgcagag tggctctgcc tccacgcctt cctgctcaag 3240

ctggttcgtc accgcgttac ctacagctgt cttctggggc cgctccgggc agccagagag 3300

cgattgtgcc agcggctccc tggggccaca ctggccgccc tcgaggccgc cgccgaccca 3360

gccctgacta cagacttccg gaccatcctg gactga 3396

<210> 9

<211> 981

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<220>

<221> 基因(gene)

<222> (1)..(981)

<223> hbmi1, 基因导入用DNA片段(DNA fragment for gene transduction)

<400> 9

atgcatcgaa caacgagaat caagatcact gagctaaatc cccacctgat gtgtgtgctt 60

tgtggagggt acttcattga tgccacaacc ataatagaat gtctacattc cttctgtaaa 120

acgtgtattg ttcgttacct ggagaccagc aagtattgtc ctatttgtga tgtccaagtt 180

cacaagacca gaccactact gaatataagg tcagataaaa ctctccaaga tattgtatac 240

aaattagttc cagggctttt caaaaatgaa atgaagagaa gaagggattt ttatgcagct 300

catccttctg ctgatgctgc caatggctct aatgaagata gaggagaggt tgcagatgaa 360

gataagagaa ttataactga tgatgagata ataagcttat ccattgaatt ctttgaccag 420

aacagattgg atcggaaagt aaacaaagac aaagagaaat ctaaggagga ggtgaatgat 480

aaaagatact tacgatgccc agcagcaatg actgtgatgc acttaagaaa gtttctcaga 540

agtaaaatgg acatacctaa tactttccag attgatgtca tgtatgagga ggaaccttta 600

aaggattatt atacactaat ggatattgcc tacatttata cctggagaag gaatggtcca 660

cttccattga aatacagagt tcgacctact tgtaaaagaa tgaagatcag tcaccagaga 720

gatggactga caaatgctgg agaactggaa agtgactctg ggagtgacaa ggccaacagc 780

ccagcaggag gtattccctc cacctcttct tgtttgccta gccccagtac tccagtgcag 840

tctcctcatc cacagtttcc tcacatttcc agtactatga atggaaccag caacagcccc 900

agcggtaacc accaatcttc ttttgccaat agacctcgaa aatcatcagt aaatgggtca 960

tcagcaactt cttctggttg a 981

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 正向引物(Forward primer)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 10

ggcactgccc tcagacttca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 反向引物(Reverse primer)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 11

ctgctaaagc gcatgctcca 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR用引物(Primer for PCR)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<400> 12

ctgcggcatc cacgaacta 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR用引物(Primer for PCR)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<400> 13

acagcaccgt gttggcgta 19

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR用引物(Primer for PCR)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(24)

<400> 14

ttggtcaagc agcataatcc aaag 24

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR用引物(Primer for PCR)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(23)

<400> 15

gtcaagggca tagcctacca caa 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 正向引物(Forward primer)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<400> 16

gcactgccct cagacttcaa ga 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 反向引物(Reverse primer)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 17

gcgggactat ggttgctgac 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 正向引物(Forward primer)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<400> 18

tggcacccag cacaatgaa 19

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 反向引物(Reverse primer)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<400> 19

ctaagtcata gtccgcctag aagca 25

Claims

1.一种永生化干细胞的制作方法，其具备下述步骤：

制作DNA片段的步骤，该DNA片段包含选自由Bmi、人乳头瘤病毒E6和人乳头瘤病毒E7组成的组中的至少1种以上的基因、以及端粒酶逆转录酶；

制作插入有包含所述基因的DNA片段的病毒载体的步骤；

使所述病毒载体转染到哺乳类的干细胞中而将所述基因导入到所述干细胞中的步骤；以及

对导入有所述基因的所述干细胞进行培养，利用试剂选择出永生化干细胞的步骤。

2.如权利要求1所述的永生化细胞的制作方法，其特征在于，所述DNA片段包含选自由下述(a)～(e)组成的组中的任一基因集，

(a)人乳头瘤病毒E7和端粒酶逆转录酶(TERT)；

(b)bmi-1和TERT；

(c)bmi-1、人乳头瘤病毒E6和TERT；

(d)人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7和TERT；

(e)bmi-1、人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7和TERT。

3.如权利要求1或2所述的永生化干细胞的制作方法，其特征在于，所述端粒酶逆转录酶来源于人或猪。

4.如权利要求1～3中任一项所述的永生化细胞的制作方法，其特征在于，所述病毒为选自由慢病毒、腺病毒、逆转录病毒组成的组中的任一种。

5.如权利要求1～4中任一项所述的永生化细胞的制作方法，其特征在于，所述哺乳类的干细胞为选自由人牙髓干细胞、猪牙髓干细胞和猪脂肪干细胞组成的组中的任一种。

6.如权利要求1～5中任一项所述的永生化细胞的制作方法，其特征在于，所述试剂为遗传霉素GENETICIN。

7.如权利要求1所述的永生化细胞的制作方法，其中，进一步具备将所述选择出的永生化干细胞进行克隆的步骤。

8.一种永生化干细胞，其是利用权利要求1～7中任一项所述的永生化细胞的制作方法制作的。

9.如权利要求8所述的永生化干细胞，其特征在于，所述永生化干细胞能够进行至少200次群体倍增以上的分裂。

10.如权利要求8或9所述的永生化干细胞，其特征在于，所述永生化干细胞在200次群体倍增的时刻的STRO-1的表达量与永生化之前的干细胞大致相等。