CN106967686B - 软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨 - Google Patents

软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨。通过在体外对软骨细胞进行端粒酶mRNA转染，使后续培养得到的软骨细胞中端粒延长，并且在端粒酶mRNA的转染与完全培养基中维生素C、B18R或p65i、雷帕霉素和白藜芦醇等小分子化合物的协同作用下，可以显著提高软骨细胞尤其是老龄患者的软骨细胞的增殖与活力，对于改善或治疗衰老引起的细胞功能衰退，使其实际应用于再生医学治疗，具有重大意义。上述软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法使得软骨细胞端粒的延长不是连续的甚至频繁的，无基因组插入诱变风险，也无细胞永生化成瘤风险，在安全性和应用性上有了大大的提高，使之在再生医学治疗上有更好的应用。

Description

软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再 生软骨
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，尤其是涉及一种软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨。
背景技术
端粒是染色体末端的保护帽，其是由短的多重复的非转录序列(TTAGGG)及一些结合蛋白组成的特殊结构，能够保护基因组的稳定性，防止丢失染色体末端的遗传物质。细胞的不断扩增会渐进性地影响端粒的长度。当端粒缩短到一定程度，其保护性将消失，进而引起细胞的老化和凋亡。
端粒酶是合成端粒并保持其长度的酶。端粒酶由两部分组成，一个RNA模板亚单位即端粒酶mRNA组分和一个蛋白催化单位即端粒酶逆转录酶。并非所有的体细胞都有端粒酶。胚胎细胞活跃地表达端粒酶，但是当胚胎细胞分化到一定程度，便停止端粒酶的表达。成体中只有少数细胞被报道有端粒酶表达，比如精原细胞，激活的T细胞和一些干细胞。端粒酶的基因缺陷会造成早老症等疾病，病人会有骨髓衰竭和粘膜疾病等症状，包括异常色素沉积，指甲营养不良，口腔白斑等。有研究证明端粒酶缺失的模型鼠身上重新导入端粒酶后，衰老的症状有被纠正的趋势，包括脑部疾病和不孕等。因端粒与细胞衰老的关系，端粒学说也因此成为氧化应激、糖化、基因等众多衰老学说中的一个，并成为抗衰老研究中的热门课题。
传统的将端粒酶基因导入细胞的DNA重组技术往往涉及到质粒和病毒。Bodar等用含端粒酶基因的载体转染几乎无端粒酶活性的人体细胞，发现端粒明显延长、细胞分离增快、细胞衰老减缓(Bodar(1998)Science.279：349-352)。这种基因工程产品对安全性有很高的要求，包括杂菌、内毒素、质粒等污染物的去除，病毒自我复制能力的测定等，因而限制了其临床使用；其次会造成基因的随机插入，可能会引起基因组的不稳定性；最后，稳定表达端粒酶有造成细胞永生化的风险。这些不利因素影响端粒酶基因疗法的临床使用和市场化。
近年来，导入信使核糖核酸(mRNA)分子让细胞表达基因成为了一种新的基因治疗的手段被研究。由于mRNA直接在细胞质内被作为模板合成蛋白质，mRNA引入细胞后不会整合到基因组中从而影响遗传物质的稳定性。而mRNA作为一种人类自身就拥有的遗传物质，其安全性也比病毒要高。mRNA治疗成为一个研究热门，尤其是作为流感疫苗和肿瘤疫苗被研究。mRNA能够引起长时间的强烈的针对流感病毒的保护性免疫。mRNA作为肿瘤疫苗也已经开展了I/II期临床试验，多数患者产生了针对肿瘤抗原的免疫反应。
随着人们生活质量的提高，越来越多的人加入运动健身的行列，随之而来的问题是运动损伤的患者越来越多，这其中软骨损伤，尤其是膝、踝关节的软骨损伤占很大比例。据国内外文献报道，在膝关节镜检查的人群中，软骨损伤的发病率在61％-68％之间。患者常感觉疼痛、僵硬，最终进展为重度关节炎，甚至无法行走，严重影响生活质量。
由于成熟的软骨组织是无神经，无血管，无淋巴管的组织，并且软骨细胞在软骨组织中分布稀疏，造成软骨组织的自我更新速度缓慢，自身修复能力有限。尤其是老年患者软骨细胞增殖速度和自身修复能力都非常低，大大限制了老年软骨损伤治疗的应用。因此寻求合适的方法，体外增加软骨细胞，尤其是老年患者软骨细胞群体倍增次数，延缓细胞的老化，增加细胞活性，同时避免细胞永生化的可能，是进行软骨修复治疗的难点和重点。
发明内容
基于此，有必要提供一种软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨，以安全、有效地预防、改善或治疗衰老或损伤引起的软骨细胞功能衰退，并可应用于再生医学治疗。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下。
一种软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，包括如下步骤：
步骤一：制备具有如序列表中SEQ ID No.1所示碱基序列的端粒酶mRNA；
步骤二：将所述端粒酶mRNA在完全培养基中转染传代培养的软骨细胞，所述完全培养基是在DMEM/F12或RPMI1640基础培养基中加入血清、终浓度为5-50μg/ml的维生素C、终浓度为0.01-2μg/ml的B18R或p65i、终浓度为0.1-50ng/ml的雷帕霉素和终浓度为0.1-50μM的白藜芦醇制备得到，所述血清是体积终浓度为1％-20％的人AB血清或体积终浓度为1％-20％的胎牛血清；
步骤三：将转染后的细胞继续使用所述完全培养基进行培养。
在其中一个实施例中，在所述步骤一中，具体是：
以人基因组DNA或者携带人TERT基因的CDS区序列的质粒作为模板，以序列表中SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示序列作为PCR引物序列进行PCR扩增，或者进行序列全合成，获得如SEQ ID No.4所示的人TERT基因的CDS区序列片段；
在得到的人TERT基因的CDS区序列片段的两端分别连接上如SEQ ID No.5所示的3’UTR和如SEQ ID No.6所示的5’UTR；
在3’UTR后连接上如SEQ ID No.7所示的含poly A的序列，形成DNA片段5’UTR-TERT CDS-3’UTR-含polyA的序列；
将得到的DNA片段进行线性化，然后在体外转录成mRNA；
纯化回收得到所述端粒酶mRNA。
其中，5’UTR的前端具有EcoR1酶切位点(GGAATTC)，SEQ ID No.7所示的含poly A的序列的尾端具有SalI酶切位点(GTCGACGCGT)。
在其中一个实施例中，在体外转录成mRNA可使用现有的转录试剂盒，如mMESSAGET7Kit(ambion AM1344)等。
在其中一个实施例中，所述纯化回收是使用氯化锂沉淀法得到较纯的mRNA，或者进一步进行HPLC纯化获得更高纯度的mRNA。
在其中一个实施例中，在所述步骤二中，所述培养基中血清是体积终浓度为5％-10％的人AB血清或体积终浓度为10％-20％的胎牛血清；所述维生素C的终浓度是20-40μg/ml；所述B18R或p65i的终浓度是0.1-0.5μg/ml；所述雷帕霉素的终浓度为1-10ng/ml；所述白藜芦醇的终浓度为1-10μM。
更进一步，在所述步骤二中，所述培养基中血清是体积终浓度为5％的人AB血清；所述维生素C的终浓度是30μg/ml；所述B18R或p65i的终浓度是0.2μg/ml的；所述雷帕霉素的终浓度为10ng/ml；所述白藜芦醇的终浓度为10μM。血清选用体积终浓度为5％的人AB血清，使用人AB血清对培养软骨细胞和临床应用效果更好。
此外，在部分实施例中，可直接使用体外软骨细胞端粒延长增殖培养用试剂盒进行软骨细胞体外端粒延长增殖培养。所述试剂盒包括上述培养基以及端粒酶mRNA。其中，所述端粒酶mRNA的碱基序列如SEQ ID No.1所示。进一步，所述端粒酶mRNA是加入在转染用减血清培养基中，如加入在I减血清培养基(Life technology，31985070)中。更进一步，所述端粒酶mRNA在所述转染用减血清培养基中的浓度为0.001-0.1μg/μl，优选为0.005-0.02μg/μl，更优选为0.01μg/μl。
在其中一个实施例中，在所述步骤二中，所述软骨细胞是以用胶原酶消化软骨组织后分离得到的P0代软骨细胞进行传代培养得到的P3代软骨细胞。
在其中一个实施例中，所述P0代软骨细胞来源于患者软骨缺损部分，具体可以是从患者缺损部位取一小部分软骨，使用但不限于I型胶原酶消化后得到。所述患者可主要针对老龄患者，如55岁以上的软骨组织缺损的患者。
在其中一个实施例中，在所述步骤二中，转染时，所述软骨细胞的密度为40％-70％。细胞密度在40％-70％时转染，细胞的活性良好，有利于保证转染的效果。细胞密度是指细胞覆盖面积所占基底面积的比例。
在其中一个实施例中，在所述步骤二中，转染时，加入的端粒酶mRNA的浓度为0.1-0.2μg/cm2。
在其中一个实施例中，在所述步骤二中，转染的具体步骤是：转染时先将转染试剂与转染用减血清培养基混合制成混合液A，再将端粒酶mRNA用相应的所述转染用减血清培养基稀释制成B，然后将A和B混合孵育，向P3代软骨细胞中加入所述完全培养基和上述A与B的混合物，混合均匀培养。
在其中一个实施例中，转染试剂是RNAiMAX TransfectionReagent(Life technology，13778150)，转染用减血清培养基是I减血清培养基(Life technology，31985070)，也可使用同系列或相似的转染试剂进行转染。
在其中一个实施例中，所述软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法还包括根据软骨细胞的密度，重复使用步骤二中的转染方法再对转染后培养的软骨细胞进行一次或多次转染的步骤。
一种人源组织工程化再生软骨，包括胶原膜和上述任一实施例所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法培养得到的端粒延长的软骨细胞；所述软骨细胞贴附在所述胶原膜上。
在其中一个实施例中，胶原膜是Bio-Gide支架，或者类似的组织工程胶原膜。胶原膜为软骨细胞贴附和生长提供了固相支撑。
在其中一个实施例中，所述软骨细胞是以浓度为1×107-4×107个软骨细胞/ml的细胞悬液按照1×106-4×106个软骨细胞/cm2的接种密度滴加接种至所述胶原膜上制备得到。
在其中一个实施例中，所述细胞悬液中软骨细胞的存活率控制不低于80％，且在胶原膜上的贴附率不小于80％。
在其中一个实施例中，所述人源组织工程化再生软骨可使用无菌洁净的运输容器运输，产品有效期为装配结束时间起48h内。运输时，可使用经辐照灭菌的包装袋包装运输容器，抽真空密封。运输过程为常温运输。
对于软骨细胞，尤其是老龄患者软骨细胞来说，目前还没有新的技术能同时达到增加其扩增速率、端粒长度以及细胞活性的效果。本发明通过使用上述软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，可以在体外对软骨细胞进行端粒酶mRNA转染，使后续培养得到的软骨细胞中端粒延长，并且在端粒酶mRNA的转染与完全培养基中维生素C、B18R或p65i、雷帕霉素和白藜芦醇等小分子化合物的协同作用下，可以显著提高软骨细胞尤其是老龄患者的软骨细胞的增殖与活力，对于改善或治疗衰老引起的细胞功能衰退，使其实际应用于再生医学治疗，具有重大意义。上述软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法使得软骨细胞端粒的延长不是连续的甚至频繁的，无基因组插入诱变风险，也无细胞永生化成瘤风险，在安全性和应用性上有了大大的提高，使之在再生医学治疗上有更好的应用。
本发明获得的人源组织工程化再生软骨具有显著提高软骨细胞的增殖速率和端粒酶活性、延长端粒长度、延缓细胞的衰老的特点，与胶原膜等组合成人源组织工程化再生软骨产品，可进行软骨缺损治疗。本发明人源组织工程化再生软骨中软骨细胞端粒的延长不是连续的甚至频繁的，无基因组插入诱变风险，也无细胞永生化成瘤风险，在安全性和应用性上有了大大的提高，使之在再生医学治疗上有更好的应用。
附图说明
图1为实施例2中老龄患者软骨细胞经过不同处理后的细胞增殖情况；
图2为实施例2中不同处理的细胞经后续几代传代后的细胞增殖情况；
图3为实施例2中老龄患者软骨细胞各种处理后端粒长度检测结果；
图4为实施例2中老龄患者软骨细胞各种处理后细胞代谢检测结果；
图5为经过端粒酶mRNA处理和完全培养基培养得到的老龄患者软骨细胞特异标志物表达流式检测结果；
图6为免疫荧光检测经过端粒酶mRNA处理和完全培养基培养得到的老龄患者软骨细胞特异标志物表达情况；
图7为阿尔新蓝染色检测经过端粒酶mRNA处理和完全培养基培养得到的老龄患者软骨细胞形态。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。常用术语的定义在所有分子生物学书中可以找到，例如，Benjamin Lewin，Genes VIII，Oxford University Press，2004(ISBN 0-13-145140-5)。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1 端粒酶mRNA和完全培养基处理老龄患者软骨细胞
1.端粒酶mRNA首先要进行体外合成。对质粒pBABE-neo-hTERT(plasmid 1774，Addgene，Cambridge，MA，USA)进行PCR扩增(引物分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)，扩增出含有端粒酶TERT CDS区的DNA(SEQ ID No.4)。然后从人的基因组DNA中扩增出3’UTR(SEQID No.5)和5’UTR(SEQ ID No.6)，以及全序列合成含polyA的序列(SEQ ID No.7)，使用重叠PCR方法将其全部连接到TERT CDS区的DNA上，形成片段：5’UTR-TERT CDS-3’UTR-含polyA的序列。然后将该片段使用限制性内切酶EcoR1和SalI双酶切后连接到同样酶切的质粒Pcmv6-XL4上。经测序验证序列正确的端粒酶质粒，经过酶切或用PCR将这些质粒中的目的基因片段线性化，使用胶回收试剂盒纯化回收目的DNA片段。将线性化并纯化后的DNA模板用体外转录试剂盒mMESSAGE T7Kit(ambion AM1344)按照说明书进行体外转录。然后将体外转录后的产物用氯化锂沉淀法沉淀。沉淀完成后用RNase-free水重悬，将浓度稀释为1μg/μl。合成的端粒酶mRNA(SEQ ID No.1)放置于-80℃保存。
2.配置软骨细胞完全培养基：DMEM/F12(Hyclone)+5％人AB血清(Innovative)+30μg/ml维生素C(sigma)+0.2μg/ml B18R(Abcam)+10ng/ml雷帕霉素(sigma)+10μM白藜芦醇(sigma)。在其他实施例中，该完全培养基也可以使用RPMI1640基础培养基配置，其中的B18R也可以用p65i代替，5％人AB血清也可以使用胎牛血清代替；并且各组分的含量也不限于此，如维生素C的含量可以控制在5-50μg/ml，B18R或p65i的含量可以控制在0.01-2μg/ml，雷帕霉素的含量可以控制在0.1-50ng/ml，白藜芦醇的含量可以控制在0.1-50μM，人AB血清的含量可以控制在1％-20％；进一步，维生素C的含量可以控制在20-40μg/ml，B18R或p65i的含量可以控制在0.1-0.5μg/ml，雷帕霉素的含量可以控制在1-10ng/ml，白藜芦醇的含量可以控制在1-10μM，人AB血清的含量可以控制在5％-10％。
3.P0代软骨细胞：取自中山大学附属第三医院，年龄为76岁的男性软骨缺损患者的软骨组织经I型胶原酶消化后，分离得到。该研究经中山大学附属第三医院伦理委员会批准，且征得患者的知情同意。在其他实施例中，P0代软骨细胞也可以取自相应研究机构的细胞冻存库等细胞存储中心。
4.软骨细胞转染：将P0代软骨细胞传代培养，取正在培养的第二代P2软骨细胞，待细胞密度长至约100％时，使用0.05％的胰酶37℃消化5min，基础培养基(DMEM/F12(Hyclone)+5％人AB血清(Innovative))培养终止消化，然后300g/min室温离心5min，基础培养基重悬计数。取一个6孔板，按照2万/孔的细胞数量，使细胞均匀贴壁在6孔板中，每隔一天换液一次。第四天时，此时6孔板中的软骨细胞密度在40％-70％时进行转染。转染时先将每孔量3μlRNAiMAX Transfection Reagent(Life technology，13778150)与97μlI减血清培养基(Life technology，31985070)混合制成混合液A，再将端粒酶mRNA 1μg用I减血清培养基稀释为100μl制成B，然后将A和B混合在室温孵育5分钟。将每孔加入1ml软骨细胞完全培养基和200μl上述A+B混合物，混合均匀后37℃培养，16h后细胞换液。第六天时，按照第四天的方法重新转染一次。待细胞密度达到近100％时，对细胞进行传代或其他处理。
实施例2 端粒酶mRNA和完全培养基处理后的软骨细胞增殖情况检测、端粒酶活性检测、端粒长度检测和细胞代谢检测
本实施例设置4组实验，分别为control、hTERT、Compound和hTERT+compound，其中control代表细胞未经任何处理，使用基础培养基(DMEM/F12(Hyclone)+5％人AB血清(Innovative))培养；hTERT代表细胞转染了端粒酶mRNA后，使用基础培养基培养；Compound代表细胞未转染端粒酶mRNA，使用添加了各种小分子化合物的完全培养基培养；hTERT+compound代表细胞转染端粒酶mRNA，使用完全培养基培养。原代软骨细胞为第零代，在第三代时，于6孔板的孔中种植细胞，每孔两万个P3代软骨细胞。
在细胞密度达到近100％时，用0.05％的胰酶37℃消化细胞5分钟，用完全培养基终止消化，300g/min室温离心5分钟，用相应培养基重悬细胞，进行细胞计数。具体结果如图1所示，可见老龄患者软骨细胞转染了端粒酶mRNA后，使用包含了各种化合物的完全培养基培养，细胞增殖速度大大增加。
在实际操作过程中，无论在转染完后的第三代细胞计数，还是在后续的几代细胞传代中，使用端粒酶mRNA转染且使用完全培养基培养，相比其他组的处理，细胞增殖速率明显增加，详见图2。
进行端粒酶活性检测时，首先将第三代软骨细胞收集后细胞计数，取105个细胞200g/min室温离心5分钟，去上清。用20μl裂解液CHAPS Lysis Buffer(来自端粒酶检测试剂盒Telomerase Detection Kit)将细胞裂解，用涡旋振荡器震荡至细胞沉淀消失。再用CHAPS Lysis Buffer将样本按1:20稀释为工作浓度。根据端粒酶检测试剂盒Telomerase Detection Kit说明书进行PCR扩增。扩增完成后配制10％PAGE胶20ml(12.75ml H2O，10×TBE buffer 0.5ml，40％PAGE 6.25ml，10％APS 120μl，TEMED24μl)，配置缓冲液0.5×TBE buffer，将PCR产物进行DNA凝胶电泳。使用Bio-Rad GelDocTMXR+成像系统进行凝胶成像检测端粒酶活性。具体检测结果如图3所示，图中1代表未经任何处理的，使用基础培养基培养的软骨细胞样品；2代表细胞未转染端粒酶mRNA，使用完全培养基培养的样品；3代表细胞转染了端粒酶mRNA后，使用基础培养基培养；4代表细胞转染端粒酶mRNA，使用完全培养基培养的样品；5代表试剂盒中的阳性对照。从图3可见，转染了端粒酶mRNA的软骨细胞，端粒酶活性明显提高。
进行端粒长度检测时，首先根据罗氏TeloTAGGG Telomere Length Assay试剂盒说明书配置裂解液。将第三代的软骨细胞收集后细胞计数，按照10，000细胞/10μl的比例加入上述裂解液裂解，然后转移至0.2ml PCR管中，将裂解后的样本放置在恒温杂交炉中于55℃转动过夜(至少8小时)。次日将样本放置于PCR仪85℃加热用以灭活PK酶。将样本放置于-20℃。用QIAmp DNA mini试剂盒将样本DNA提取出来，使用NanoDrop2000测定DNA的浓度，用Rnase/Dnase free water稀释成5ng/μl。使用Bio-Rad QPCR仪器进行端粒酶长度检测。将标准样品DNA按照25ng/μl，15ng/μl，9ng/μl，5.4ng/μl，3.24ng/μl，1.94ng/μl浓度稀释制作梯度标准样品。每板用标准样品同时进行端粒QPCR和基因组拷贝数(SGC)QPCR，用CT值和相应标准样品浓度建立标准曲线。在同一板同时进行待测样本的端粒QPCR和SGC QPCR，求出相应CT值。再用CT值和标准曲线求出待测样本所对应的标准样本的端粒模板浓度和SGC模板浓度。端粒模板浓度与端粒长度成正比，而端粒/SGC即T/S值即代表了所测样本的平均相对端粒长度大小。比较各个样本的T/S比值大小来看细胞在体外扩增后端粒长度的变化。按照两条标准曲线计算得出各个样本的T/S比值。观察T/S比值的变化即相对端粒长度的变化。具体结果如表1所示，从表1检测结果可以看出，转染了端粒酶mRNA，并且使用完全培养基培养的软骨细胞，端粒长度明显延长。
表1老龄患者软骨细胞经不同处理后端粒长度检测
进行细胞代谢检测时，使用alamarBlue assay试剂盒进行检测。具体检测结果如图4所述，从图4的检测结果可以看出，转染了端粒酶mRNA的细胞，细胞代谢明显增强，细胞活力增加。使用了包含各种化合物的完全培养基，并且转染了端粒酶mRNA的条件下，细胞代谢最旺盛，细胞活力最高。
实施例3 人源组织工程化再生软骨组装
经过端粒酶mRNA处理的，以及包含各种小分子化合物的完全培养基培养的老龄患者软骨细胞，在扩增到足够数量，生长状态良好的情况下，需要制备细胞悬液于胶原膜支架进行组装复合，当软骨细胞完全贴附在胶原膜上后，制成人源组织工程化再生软骨成品，运输到医院进行治疗。
首先配置AM培养基(DMEM/F12(Hyclone)+10％患者自体血清)。取培养的软骨细胞进行细胞消化，使用0.05％的胰酶37度消化5min，加入完全培养基终止消化。300g室温离心5分钟，用AM培养基重悬细胞，进行细胞计数。1500rpm离心5min，去上清重悬细胞，使细胞悬液浓度1×107-4×107个/ml，细胞接种密度在1×106-4×106个/cm2，细胞存活率在80％-100％之间。取密封的Bio-Gide支架或其他类似胶原膜支架，在生物安全柜中，用镊子和一次性手术刀将胶原膜支架裁切成所需要的面积。用移液枪取相应体积的细胞悬液，按从左到右从上到下的顺序缓慢均匀地滴加在支架上，使细胞悬液铺满整块膜而无细胞溢出，将载有细胞的支架放于细胞培养箱中，静置30min，避免倾斜，以防细胞液面渗出。孵育结束后，进行细胞贴附率检测，要求细胞贴附率不小于80％。向运输容器加入50ml AM培养基，将胶原膜支架转移入运输容器内，载有细胞的面朝上，盖上运输容器盖子，产品有效期为自装配结束时间起48h内。用封口膜将盖子和瓶体连接部位缠绕3圈，用经辐照灭菌的包装袋包装运输容器，然后抽真空密封，常温运输到医院进行软骨缺损治疗。
下表2表示人源组织工程化再生软骨细胞质量标准。
表2
如图5所示，经过端粒酶mRNA处理和完全培养基培养得到的老龄患者软骨细胞特异标志物表达流式检测，其中，左图为Collagen I表达流式检测数据，右图为CD44表达流式检测数据。从图5可以看出，得到的软骨细胞几乎全部表达软骨特异表面标志物，证明细胞表达正常。
如图6所示，免疫荧光检测经过端粒酶mRNA处理和完全培养基培养得到的老龄患者软骨细胞特异标志物表达情况，其中，上图为Collagen I免疫荧光图像，下图为CollagenII免疫荧光图像。从图6可以看出，得到的软骨细胞特异表达Collagen I和Collagen II，说明细胞表达正常。
如图7所示，阿尔新蓝染色检测经过端粒酶mRNA处理和完全培养基培养得到的老龄患者软骨细胞形态。从图7可以看出，所得到的细胞呈现软骨细胞样状态，可以被阿尔新蓝染色，说明所得到的软骨细胞状态正常。
其他的质量标准在人源组织工程化再生软骨的组装过程中可以有效控制，由此可见，本实施例组装得到的人源组织工程化再生软骨可以完全满足人源组织工程化再生软骨细胞质量标准，可用于再生软骨的移植。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司、冠昊生物科技股份有限公司
<120> 软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3658
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaattcaca tttgcttctg acacaactgt gttcactagc aacctcaaac agacaccatg 60
ccgcgcgctc cccgctgccg agccgtgcgc tccctgctgc gcagccacta ccgcgaggtg 120
ctgccgctgg ccacgttcgt gcggcgcctg gggccccagg gctggcggct ggtgcagcgc 180
ggggacccgg cggctttccg cgcgctggtg gcccagtgcc tggtgtgcgt gccctgggac 240
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gcccgagtgc tgcagaggct gtgcgagcgc ggcgcgaaga acgtgctggc cttcggcttc 360
gcgctgctgg acggggcccg cgggggcccc cccgaggcct tcaccaccag cgtgcgcagc 420
tacctgccca acacggtgac cgacgcactg cgggggagcg gggcgtgggg gctgctgctg 480
cgccgcgtgg gcgacgacgt gctggttcac ctgctggcac gctgcgcgct ctttgtgctg 540
gtggctccca gctgcgccta ccaggtgtgc gggccgccgc tgtaccagct cggcgctgcc 600
actcaggccc ggcccccgcc acacgctagt ggaccccgaa ggcgtctggg atgcgaacgg 660
gcctggaacc atagcgtcag ggaggccggg gtccccctgg gcctgccagc cccgggtgcg 720
aggaggcgcg ggggcagtgc cagccgaagt ctgccgttgc ccaagaggcc caggcgtggc 780
gctgcccctg agccggagcg gacgcccgtt gggcaggggt cctgggccca cccgggcagg 840
acgcgtggac cgagtgaccg tggtttctgt gtggtgtcac ctgccagacc cgccgaagaa 900
gccacctctt tggagggtgc gctctctggc acgcgccact cccacccatc cgtgggccgc 960
cagcaccacg cgggcccccc atccacatcg cggccaccac gtccctggga cacgccttgt 1020
cccccggtgt acgccgagac caagcacttc ctctactcct caggcgacaa ggagcagctg 1080
cggccctcct tcctactcag ctctctgagg cccagcctga ctggcgctcg gaggctcgtg 1140
gagaccatct ttctgggttc caggccctgg atgccaggga ctccccgcag gttgccccgc 1200
ctgccccagc gctactggca aatgcggccc ctgtttctgg agctgcttgg gaaccacgcg 1260
cagtgcccct acggggtgct cctcaagacg cactgcccgc tgcgagctgc ggtcacccca 1320
gcagccggtg tctgtgcccg ggagaagccc cagggctctg tggcggcccc cgaggaggag 1380
gacacagacc cccgtcgcct ggtgcagctg ctccgccagc acagcagccc ctggcaggtg 1440
tacggcttcg tgcgggcctg cctgcgccgg ctggtgcccc caggcctctg gggctccagg 1500
cacaacgaac gccgcttcct caggaacacc aagaagttca tctccctggg gaagcatgcc 1560
aagctctcgc tgcaggagct gacgtggaag atgagcgtgc gggactgcgc ttggctgcgc 1620
aggagcccag gggttggctg tgttccggcc gcagagcacc gtctgcgtga ggagatcctg 1680
gccaagttcc tgcactggct gatgagtgtg tacgtcgtcg agctgctcag gtctttcttt 1740
tatgtcacgg agaccacgtt tcaaaagaac aggctctttt tctaccggaa gagtgtctgg 1800
agcaagttgc aaagcattgg aatcagacag cacttgaaga gggtgcagct gcgggagctg 1860
tcggaagcag aggtcaggca gcatcgggaa gccaggcccg ccctgctgac gtccagactc 1920
cgcttcatcc ccaagcctga cgggctgcgg ccgattgtga acatggacta cgtcgtggga 1980
gccagaacgt tccgcagaga aaagagggcc gagcgtctca cctcgagggt gaaggcactg 2040
ttcagcgtgc tcaactacga gcgggcgcgg cgccccggcc tcctgggcgc ctctgtgctg 2100
ggcctggacg atatccacag ggcctggcgc accttcgtgc tgcgtgtgcg ggcccaggac 2160
ccgccgcctg agctgtactt tgtcaaggtg gatgtgacgg gcgcgtacga caccatcccc 2220
caggacaggc tcacggaggt catcgccagc atcatcaaac cccagaacac gtactgcgtg 2280
cgtcggtatg ccgtggtcca gaaggccgcc catgggcacg tccgcaaggc cttcaagagc 2340
cacgtctcta ccttgacaga cctccagccg tacatgcgac agttcgtggc tcacctgcag 2400
gagaccagcc cgctgaggga tgccgtcgtc atcgagcaga gctcctccct gaatgaggcc 2460
agcagtggcc tcttcgacgt cttcctacgc ttcatgtgcc accacgccgt gcgcatcagg 2520
ggcaagtcct acgtccagtg ccaggggatc ccgcagggct ccatcctctc cacgctgctc 2580
tgcagcctgt gctacggcga catggagaac aagctgtttg cggggattcg gcgggacggg 2640
ctgctcctgc gtttggtgga tgatttcttg ttggtgacac ctcacctcac ccacgcgaaa 2700
accttcctca ggaccctggt ccgaggtgtc cctgagtatg gctgcgtggt gaacttgcgg 2760
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atgccggccc acggcctatt cccctggtgc ggcctgctgc tggatacccg gaccctggag 2880
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cagctgagtc ggaagctccc ggggacgacg ctgactgccc tggaggccgc agccaacccg 3420
gcactgccct cagacttcaa gaccatcctg gactgagctc gctttcttgc tgtccaattt 3480
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ccttgagcat ctggattctg cctaataaaa aacatttatt ttcattgcaa aaaaaaaaaa 3600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagt cgacgcgt 3658
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgccgcgcg ctccccgctg 20
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<211> 21
<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 7
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gtcgacgcgt 70

Claims (10)

1.一种软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：制备具有如序列表中SEQ ID No.1所示cDNA序列对应的RNA序列的端粒酶mRNA；
步骤二：将所述端粒酶mRNA在完全培养基中转染传代培养的人软骨细胞，所述完全培养基是在DMEM/F12或RPMI1640基础培养基中加入血清、终浓度为5-50μg/ml的维生素C、终浓度为0.01-2μg/ml的B18R或p65i、终浓度为0.1-50ng/ml的雷帕霉素和终浓度为0.1-50μM的白藜芦醇制备得到，所述血清是体积终浓度为1％-20％的人AB血清或体积终浓度为1％-20％的胎牛血清；
步骤三：将转染后的细胞继续使用所述完全培养基进行培养。
2.如权利要求1所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，在所述步骤一中，具体是：
以人基因组DNA或者携带人TERT基因的CDS区序列的质粒作为模板，以序列表中SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示序列作为PCR引物序列进行PCR扩增，或者进行序列全合成，获得如SEQ ID No.4所示的人TERT基因的CDS区序列片段；
在得到的人TERT基因的CDS区序列片段的两端分别连接上如SEQ ID No.5所示的3’UTR和如SEQ ID No.6所示的5’UTR；
在3’UTR后连接上如SEQ ID No.7所示的含poly A的序列，形成DNA片段5’UTR-TERTCDS-3’UTR-含polyA的序列；
将得到的DNA片段进行线性化，然后在体外转录成mRNA；
纯化回收得到所述端粒酶mRNA。
3.如权利要求1所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述人软骨细胞是以用胶原酶消化软骨组织后分离得到的P0代人软骨细胞进行传代培养得到的P3代人软骨细胞。
4.如权利要求3所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，在所述步骤二中，转染时，所述人软骨细胞的密度为40％-70％。
5.如权利要求4所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，在所述步骤二中，转染时，加入的端粒酶mRNA的浓度为0.1-0.2μg/cm3。
6.如权利要求5所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，在所述步骤二中，转染的具体步骤是：转染时先将转染试剂与转染用减血清培养基混合制成混合液A，再将端粒酶mRNA用相应的所述转染用减血清培养基稀释制成B，然后将A和B混合孵育，向P3代人软骨细胞中加入所述完全培养基和上述A与B的混合物，混合均匀培养。
7.如权利要求6所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，还包括根据人软骨细胞的密度，重复使用步骤二中的转染方法再对转染后培养的人软骨细胞进行一次或多次转染的步骤。
8.一种人源组织工程化再生软骨，其特征在于，包括胶原膜和如权利要求1-7中任一项所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法培养得到的端粒延长的人软骨细胞；所述人软骨细胞贴附在所述胶原膜上。
9.如权利要求8所述的人源组织工程化再生软骨，其特征在于，所述人软骨细胞是以浓度为1×107-4×107个人软骨细胞/ml的细胞悬液按照1×106-4×106个人软骨细胞/cm2的接种密度滴加接种至所述胶原膜上制备得到。
10.如权利要求9所述的人源组织工程化再生软骨，其特征在于，所述细胞悬液中人软骨细胞的存活率控制不低于80％，且在胶原膜上的贴附率不小于80％。
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