发明内容
基于此,有必要提供一种软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨,以安全、有效地预防、改善或治疗衰老或损伤引起的软骨细胞功能衰退,并可应用于再生医学治疗。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下。
一种软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法,包括如下步骤:
步骤一:制备具有如序列表中SEQ ID No.1所示碱基序列的端粒酶mRNA;
步骤二:将所述端粒酶mRNA在完全培养基中转染传代培养的软骨细胞,所述完全培养基是在DMEM/F12或RPMI1640基础培养基中加入血清、终浓度为5-50μg/ml的维生素C、终浓度为0.01-2μg/ml的B18R或p65i、终浓度为0.1-50ng/ml的雷帕霉素和终浓度为0.1-50μM的白藜芦醇制备得到,所述血清是体积终浓度为1%-20%的人AB血清或体积终浓度为1%-20%的胎牛血清;
步骤三:将转染后的细胞继续使用所述完全培养基进行培养。
在其中一个实施例中,在所述步骤一中,具体是:
以人基因组DNA或者携带人TERT基因的CDS区序列的质粒作为模板,以序列表中SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示序列作为PCR引物序列进行PCR扩增,或者进行序列全合成,获得如SEQ ID No.4所示的人TERT基因的CDS区序列片段;
在得到的人TERT基因的CDS区序列片段的两端分别连接上如SEQ ID No.5所示的3’UTR和如SEQ ID No.6所示的5’UTR;
在3’UTR后连接上如SEQ ID No.7所示的含poly A的序列,形成DNA片段5’UTR-TERT CDS-3’UTR-含polyA的序列;
将得到的DNA片段进行线性化,然后在体外转录成mRNA;
纯化回收得到所述端粒酶mRNA。
其中,5’UTR的前端具有EcoR1酶切位点(GGAATTC),SEQ ID No.7所示的含poly A的序列的尾端具有SalI酶切位点(GTCGACGCGT)。
在其中一个实施例中,在体外转录成mRNA可使用现有的转录试剂盒,如mMESSAGET7Kit(ambion AM1344)等。
在其中一个实施例中,所述纯化回收是使用氯化锂沉淀法得到较纯的mRNA,或者进一步进行HPLC纯化获得更高纯度的mRNA。
在其中一个实施例中,在所述步骤二中,所述培养基中血清是体积终浓度为5%-10%的人AB血清或体积终浓度为10%-20%的胎牛血清;所述维生素C的终浓度是20-40μg/ml;所述B18R或p65i的终浓度是0.1-0.5μg/ml;所述雷帕霉素的终浓度为1-10ng/ml;所述白藜芦醇的终浓度为1-10μM。
更进一步,在所述步骤二中,所述培养基中血清是体积终浓度为5%的人AB血清;所述维生素C的终浓度是30μg/ml;所述B18R或p65i的终浓度是0.2μg/ml的;所述雷帕霉素的终浓度为10ng/ml;所述白藜芦醇的终浓度为10μM。血清选用体积终浓度为5%的人AB血清,使用人AB血清对培养软骨细胞和临床应用效果更好。
此外,在部分实施例中,可直接使用体外软骨细胞端粒延长增殖培养用试剂盒进行软骨细胞体外端粒延长增殖培养。所述试剂盒包括上述培养基以及端粒酶mRNA。其中,所述端粒酶mRNA的碱基序列如SEQ ID No.1所示。进一步,所述端粒酶mRNA是加入在转染用减血清培养基中,如加入在I减血清培养基(Life technology,31985070)中。更进一步,所述端粒酶mRNA在所述转染用减血清培养基中的浓度为0.001-0.1μg/μl,优选为0.005-0.02μg/μl,更优选为0.01μg/μl。
在其中一个实施例中,在所述步骤二中,所述软骨细胞是以用胶原酶消化软骨组织后分离得到的P0代软骨细胞进行传代培养得到的P3代软骨细胞。
在其中一个实施例中,所述P0代软骨细胞来源于患者软骨缺损部分,具体可以是从患者缺损部位取一小部分软骨,使用但不限于I型胶原酶消化后得到。所述患者可主要针对老龄患者,如55岁以上的软骨组织缺损的患者。
在其中一个实施例中,在所述步骤二中,转染时,所述软骨细胞的密度为40%-70%。细胞密度在40%-70%时转染,细胞的活性良好,有利于保证转染的效果。细胞密度是指细胞覆盖面积所占基底面积的比例。
在其中一个实施例中,在所述步骤二中,转染时,加入的端粒酶mRNA的浓度为0.1-0.2μg/cm2。
在其中一个实施例中,在所述步骤二中,转染的具体步骤是:转染时先将转染试剂与转染用减血清培养基混合制成混合液A,再将端粒酶mRNA用相应的所述转染用减血清培养基稀释制成B,然后将A和B混合孵育,向P3代软骨细胞中加入所述完全培养基和上述A与B的混合物,混合均匀培养。
在其中一个实施例中,转染试剂是RNAiMAX TransfectionReagent(Life technology,13778150),转染用减血清培养基是I减血清培养基(Life technology,31985070),也可使用同系列或相似的转染试剂进行转染。
在其中一个实施例中,所述软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法还包括根据软骨细胞的密度,重复使用步骤二中的转染方法再对转染后培养的软骨细胞进行一次或多次转染的步骤。
一种人源组织工程化再生软骨,包括胶原膜和上述任一实施例所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法培养得到的端粒延长的软骨细胞;所述软骨细胞贴附在所述胶原膜上。
在其中一个实施例中,胶原膜是Bio-Gide支架,或者类似的组织工程胶原膜。胶原膜为软骨细胞贴附和生长提供了固相支撑。
在其中一个实施例中,所述软骨细胞是以浓度为1×107-4×107个软骨细胞/ml的细胞悬液按照1×106-4×106个软骨细胞/cm2的接种密度滴加接种至所述胶原膜上制备得到。
在其中一个实施例中,所述细胞悬液中软骨细胞的存活率控制不低于80%,且在胶原膜上的贴附率不小于80%。
在其中一个实施例中,所述人源组织工程化再生软骨可使用无菌洁净的运输容器运输,产品有效期为装配结束时间起48h内。运输时,可使用经辐照灭菌的包装袋包装运输容器,抽真空密封。运输过程为常温运输。
对于软骨细胞,尤其是老龄患者软骨细胞来说,目前还没有新的技术能同时达到增加其扩增速率、端粒长度以及细胞活性的效果。本发明通过使用上述软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法,可以在体外对软骨细胞进行端粒酶mRNA转染,使后续培养得到的软骨细胞中端粒延长,并且在端粒酶mRNA的转染与完全培养基中维生素C、B18R或p65i、雷帕霉素和白藜芦醇等小分子化合物的协同作用下,可以显著提高软骨细胞尤其是老龄患者的软骨细胞的增殖与活力,对于改善或治疗衰老引起的细胞功能衰退,使其实际应用于再生医学治疗,具有重大意义。上述软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法使得软骨细胞端粒的延长不是连续的甚至频繁的,无基因组插入诱变风险,也无细胞永生化成瘤风险,在安全性和应用性上有了大大的提高,使之在再生医学治疗上有更好的应用。
本发明获得的人源组织工程化再生软骨具有显著提高软骨细胞的增殖速率和端粒酶活性、延长端粒长度、延缓细胞的衰老的特点,与胶原膜等组合成人源组织工程化再生软骨产品,可进行软骨缺损治疗。本发明人源组织工程化再生软骨中软骨细胞端粒的延长不是连续的甚至频繁的,无基因组插入诱变风险,也无细胞永生化成瘤风险,在安全性和应用性上有了大大的提高,使之在再生医学治疗上有更好的应用。
实施例3 人源组织工程化再生软骨组装
经过端粒酶mRNA处理的,以及包含各种小分子化合物的完全培养基培养的老龄患者软骨细胞,在扩增到足够数量,生长状态良好的情况下,需要制备细胞悬液于胶原膜支架进行组装复合,当软骨细胞完全贴附在胶原膜上后,制成人源组织工程化再生软骨成品,运输到医院进行治疗。
首先配置AM培养基(DMEM/F12(Hyclone)+10%患者自体血清)。取培养的软骨细胞进行细胞消化,使用0.05%的胰酶37度消化5min,加入完全培养基终止消化。300g室温离心5分钟,用AM培养基重悬细胞,进行细胞计数。1500rpm离心5min,去上清重悬细胞,使细胞悬液浓度1×107-4×107个/ml,细胞接种密度在1×106-4×106个/cm2,细胞存活率在80%-100%之间。取密封的Bio-Gide支架或其他类似胶原膜支架,在生物安全柜中,用镊子和一次性手术刀将胶原膜支架裁切成所需要的面积。用移液枪取相应体积的细胞悬液,按从左到右从上到下的顺序缓慢均匀地滴加在支架上,使细胞悬液铺满整块膜而无细胞溢出,将载有细胞的支架放于细胞培养箱中,静置30min,避免倾斜,以防细胞液面渗出。孵育结束后,进行细胞贴附率检测,要求细胞贴附率不小于80%。向运输容器加入50ml AM培养基,将胶原膜支架转移入运输容器内,载有细胞的面朝上,盖上运输容器盖子,产品有效期为自装配结束时间起48h内。用封口膜将盖子和瓶体连接部位缠绕3圈,用经辐照灭菌的包装袋包装运输容器,然后抽真空密封,常温运输到医院进行软骨缺损治疗。
下表2表示人源组织工程化再生软骨细胞质量标准。
表2
如图5所示,经过端粒酶mRNA处理和完全培养基培养得到的老龄患者软骨细胞特异标志物表达流式检测,其中,左图为Collagen I表达流式检测数据,右图为CD44表达流式检测数据。从图5可以看出,得到的软骨细胞几乎全部表达软骨特异表面标志物,证明细胞表达正常。
如图6所示,免疫荧光检测经过端粒酶mRNA处理和完全培养基培养得到的老龄患者软骨细胞特异标志物表达情况,其中,上图为Collagen I免疫荧光图像,下图为CollagenII免疫荧光图像。从图6可以看出,得到的软骨细胞特异表达Collagen I和Collagen II,说明细胞表达正常。
如图7所示,阿尔新蓝染色检测经过端粒酶mRNA处理和完全培养基培养得到的老龄患者软骨细胞形态。从图7可以看出,所得到的细胞呈现软骨细胞样状态,可以被阿尔新蓝染色,说明所得到的软骨细胞状态正常。
其他的质量标准在人源组织工程化再生软骨的组装过程中可以有效控制,由此可见,本实施例组装得到的人源组织工程化再生软骨可以完全满足人源组织工程化再生软骨细胞质量标准,可用于再生软骨的移植。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司、冠昊生物科技股份有限公司
<120> 软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3658
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaattcaca tttgcttctg acacaactgt gttcactagc aacctcaaac agacaccatg 60
ccgcgcgctc cccgctgccg agccgtgcgc tccctgctgc gcagccacta ccgcgaggtg 120
ctgccgctgg ccacgttcgt gcggcgcctg gggccccagg gctggcggct ggtgcagcgc 180
ggggacccgg cggctttccg cgcgctggtg gcccagtgcc tggtgtgcgt gccctgggac 240
gcacggccgc cccccgccgc cccctccttc cgccaggtgt cctgcctgaa ggagctggtg 300
gcccgagtgc tgcagaggct gtgcgagcgc ggcgcgaaga acgtgctggc cttcggcttc 360
gcgctgctgg acggggcccg cgggggcccc cccgaggcct tcaccaccag cgtgcgcagc 420
tacctgccca acacggtgac cgacgcactg cgggggagcg gggcgtgggg gctgctgctg 480
cgccgcgtgg gcgacgacgt gctggttcac ctgctggcac gctgcgcgct ctttgtgctg 540
gtggctccca gctgcgccta ccaggtgtgc gggccgccgc tgtaccagct cggcgctgcc 600
actcaggccc ggcccccgcc acacgctagt ggaccccgaa ggcgtctggg atgcgaacgg 660
gcctggaacc atagcgtcag ggaggccggg gtccccctgg gcctgccagc cccgggtgcg 720
aggaggcgcg ggggcagtgc cagccgaagt ctgccgttgc ccaagaggcc caggcgtggc 780
gctgcccctg agccggagcg gacgcccgtt gggcaggggt cctgggccca cccgggcagg 840
acgcgtggac cgagtgaccg tggtttctgt gtggtgtcac ctgccagacc cgccgaagaa 900
gccacctctt tggagggtgc gctctctggc acgcgccact cccacccatc cgtgggccgc 960
cagcaccacg cgggcccccc atccacatcg cggccaccac gtccctggga cacgccttgt 1020
cccccggtgt acgccgagac caagcacttc ctctactcct caggcgacaa ggagcagctg 1080
cggccctcct tcctactcag ctctctgagg cccagcctga ctggcgctcg gaggctcgtg 1140
gagaccatct ttctgggttc caggccctgg atgccaggga ctccccgcag gttgccccgc 1200
ctgccccagc gctactggca aatgcggccc ctgtttctgg agctgcttgg gaaccacgcg 1260
cagtgcccct acggggtgct cctcaagacg cactgcccgc tgcgagctgc ggtcacccca 1320
gcagccggtg tctgtgcccg ggagaagccc cagggctctg tggcggcccc cgaggaggag 1380
gacacagacc cccgtcgcct ggtgcagctg ctccgccagc acagcagccc ctggcaggtg 1440
tacggcttcg tgcgggcctg cctgcgccgg ctggtgcccc caggcctctg gggctccagg 1500
cacaacgaac gccgcttcct caggaacacc aagaagttca tctccctggg gaagcatgcc 1560
aagctctcgc tgcaggagct gacgtggaag atgagcgtgc gggactgcgc ttggctgcgc 1620
aggagcccag gggttggctg tgttccggcc gcagagcacc gtctgcgtga ggagatcctg 1680
gccaagttcc tgcactggct gatgagtgtg tacgtcgtcg agctgctcag gtctttcttt 1740
tatgtcacgg agaccacgtt tcaaaagaac aggctctttt tctaccggaa gagtgtctgg 1800
agcaagttgc aaagcattgg aatcagacag cacttgaaga gggtgcagct gcgggagctg 1860
tcggaagcag aggtcaggca gcatcgggaa gccaggcccg ccctgctgac gtccagactc 1920
cgcttcatcc ccaagcctga cgggctgcgg ccgattgtga acatggacta cgtcgtggga 1980
gccagaacgt tccgcagaga aaagagggcc gagcgtctca cctcgagggt gaaggcactg 2040
ttcagcgtgc tcaactacga gcgggcgcgg cgccccggcc tcctgggcgc ctctgtgctg 2100
ggcctggacg atatccacag ggcctggcgc accttcgtgc tgcgtgtgcg ggcccaggac 2160
ccgccgcctg agctgtactt tgtcaaggtg gatgtgacgg gcgcgtacga caccatcccc 2220
caggacaggc tcacggaggt catcgccagc atcatcaaac cccagaacac gtactgcgtg 2280
cgtcggtatg ccgtggtcca gaaggccgcc catgggcacg tccgcaaggc cttcaagagc 2340
cacgtctcta ccttgacaga cctccagccg tacatgcgac agttcgtggc tcacctgcag 2400
gagaccagcc cgctgaggga tgccgtcgtc atcgagcaga gctcctccct gaatgaggcc 2460
agcagtggcc tcttcgacgt cttcctacgc ttcatgtgcc accacgccgt gcgcatcagg 2520
ggcaagtcct acgtccagtg ccaggggatc ccgcagggct ccatcctctc cacgctgctc 2580
tgcagcctgt gctacggcga catggagaac aagctgtttg cggggattcg gcgggacggg 2640
ctgctcctgc gtttggtgga tgatttcttg ttggtgacac ctcacctcac ccacgcgaaa 2700
accttcctca ggaccctggt ccgaggtgtc cctgagtatg gctgcgtggt gaacttgcgg 2760
aagacagtgg tgaacttccc tgtagaagac gaggccctgg gtggcacggc ttttgttcag 2820
atgccggccc acggcctatt cccctggtgc ggcctgctgc tggatacccg gaccctggag 2880
gtgcagagcg actactccag ctatgcccgg acctccatca gagccagtct caccttcaac 2940
cgcggcttca aggctgggag gaacatgcgt cgcaaactct ttggggtctt gcggctgaag 3000
tgtcacagcc tgtttctgga tttgcaggtg aacagcctcc agacggtgtg caccaacatc 3060
tacaagatcc tcctgctgca ggcgtacagg tttcacgcat gtgtgctgca gctcccattt 3120
catcagcaag tttggaagaa ccccacattt ttcctgcgcg tcatctctga cacggcctcc 3180
ctctgctact ccatcctgaa agccaagaac gcagggatgt cgctgggggc caagggcgcc 3240
gccggccctc tgccctccga ggccgtgcag tggctgtgcc accaagcatt cctgctcaag 3300
ctgactcgac accgtgtcac ctacgtgcca ctcctggggt cactcaggac agcccagacg 3360
cagctgagtc ggaagctccc ggggacgacg ctgactgccc tggaggccgc agccaacccg 3420
gcactgccct cagacttcaa gaccatcctg gactgagctc gctttcttgc tgtccaattt 3480
ctattaaagg ttcctttgtt ccctaagtcc aactactaaa ctgggggata ttatgaaggg 3540
ccttgagcat ctggattctg cctaataaaa aacatttatt ttcattgcaa aaaaaaaaaa 3600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagt cgacgcgt 3658
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgccgcgcg ctccccgctg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcagtccagg atggtcttga a 21
<210> 4
<211> 3399
<212> DNA
<213> 天然序列
<400> 4
atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60
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<212> DNA
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