CN1599793A - 人胚胎干细胞衍生的软骨细胞前体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种系统，通过分化灵长类多能干细胞获得软骨细胞谱系的细胞。该方法涉及将细胞以微团或其它聚集物形式，在促进生长出所需细胞类型的分化剂混合物中培养。子代能合成II型胶原酶或聚集蛋白聚糖，或其它作为软骨细胞谱系特征的产物。根据本公开内容获得的软骨细胞和软骨细胞前体细胞适合用于研究和临床治疗。

Description

人胚胎干细胞衍生的软骨细胞前体
技术领域
本发明一般涉及细胞生物学、胚胎干细胞和细胞分化。公开了新来源的具有软骨细胞特征的分化细胞。
相关申请的引用
本申请要求2001年12月7日提交的美国临时申请号60/339,043的优先权。
背景
软骨细胞退化是两类疾病的特点：骨关节炎，一种变性性疾病，和类风湿性关节炎，它主要是由于炎症引起的。退化导致关节疼痛和运动能力受损到不可忽视的残疾程度。
在最近二十年来，在有效抑制疾病发展的消炎药的开发上已经得到了可观的进步。但是，退化总是在发生，需要新的疗法来辅助关节软骨的再生。
在再生性药物领域，近来的努力针对开发能修复软骨的细胞群。国际专利出版号WO96/18728报道建立了关节软骨细胞谱系。WO98/55594报道了软骨细胞生长和分化的方法。WO00/27996报道了软骨细胞样细胞的无血清培养基，含有极限必需培养基、生长因子、脂类和氨基酸。美国专利6,150,163(Genzyme)描述了软骨细胞培养基配方和培养方法，其中在含有TGFβ和胰岛素或胰岛素样生长因子的培养基中培养去分化的人关节软骨细胞。
Jorgensen等(Ann.Rheum.Dis.60：305，2001)综述了干细胞在修复关节炎中的软骨和骨方面的最新进展。Jakob等(J.Cell.Biochem.26：81，2001)研究了特别的生长因子，它们与成年人关节软骨细胞扩增和再分化有关。这种扩增和再分化增强了软骨发生和软骨形成。M.Brittberg(Clin.Orthop.367 Suppl：S147，1999)综述了目前的软骨细胞移植方法，其中自体收集纯软骨细胞或其它间充质细胞，或者作为健康组织来源的异体移植物体外扩增，然后以高密度移植到缺损中。
尽管这些临床方法取得了初步的成功，但明显目前软骨细胞来源不足，不能治疗目前临床上大部分的软骨退化病例。
Kramer等(Mech.Dev.92：193，2000)报道了可通过骨形态发生蛋白(BMP-2和BMP-4)调节小鼠胚胎干细胞，以产生用Alcian蓝染色(软骨细胞特征)，并表达转录因子scleraxis的细胞。令人遗憾的是，胚胎干细胞开发的小鼠模型本身是一个特例，不能得到能用于其它物种分化的策略。事实上，仅有很少的几种其它哺乳动物物种可重复的分离多能干细胞。
仅最近Thomson等从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science 282：114，1998)。目前，Gearhart和同事从胎儿性腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。不同于用白血病抑制因子(LIF)就可简单从分化中维持鼠胚胎干细胞，人胚胎干细胞必需在非常特殊的条件下维持(美国专利号6,200,806；WO99/20741；WO01/51616)。
因此，需要开发全新的方法，将人多能细胞分化成全功能的分化细胞类型。
发明概要
本发明提供一种有效生产灵长动物细胞的系统，所述细胞是由多能细胞分化成的软骨细胞谱系的细胞。本文描述了适合研究和治疗的相当富集的软骨细胞群。
本发明的实施方式之一是分化灵长动物多能干细胞(pPS)分化而获得的含软骨细胞的细胞群。示范性的pPS细胞是人胚胎干细胞。可通过从内源基因合成II型胶原或聚集蛋白聚糖的能力来鉴定软骨细胞谱。优选该细胞群含有少部分能合成弹性软骨、纤维软骨、肥大软骨或骨细胞。
本发明的另一个实施方式是一群软骨细胞祖细胞，它们在体外培养物中增殖，是通过pPS细胞分化得到的，并能形成具有成熟软骨细胞特征的子代。软骨细胞子代不再是多能的，但负责软骨细胞发育途径。优选使得在该细胞群中未分化的多能细胞的比例最少化，任何剩余的未分化的细胞不负责在进一步增殖后形成软骨细胞。可任选的，可通过增加端粒酶活性增进干细胞的复制能力。
本发明的另一个实施方式是一种获得本发明的细胞群的方法，包括分化pPS细胞(例如，通过形成胚状体)，然后将分化细胞与软骨细胞分化因子的混合物一起培养，例如用微团(micromass)培养。本公开内容下文更详细描述了合适的因子，包括转化生长因子(TGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、生长和分化因子(GDF)、骨形态发生蛋白(BMP)、刺猬蛋白(HH)、L-抗坏血酸、和甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)。
本发明的另一种实施方式是一种产生软骨的方法，包括在产生结缔组织蛋白的条件下培养本发明的细胞群。本发明的另一个实施方式是筛选一种化合物的方法，该化合物能调节软骨生长、分化或软骨成分的合成，该方法包括将该化合物与本发明的一群细胞一起培养，并确定其影响效果。
本发明的另一个实施方式是一种药物组合物，用于在体内产生、修复或维持软骨，该药物组合物包含本发明的一群细胞-该药物是用于在个体内，例如在美容手术或关节创伤、关节炎或骨关节炎的治疗中重建软骨。
将在下面的描述中进一步阐明本发明的这些和其它实施方式。
发明详述
本发明解决了如何从多能干细胞进行有效分化，产生大量生产人软骨细胞的问题。
可通过首先引发一般分化技术，诱使多能干细胞(pPS)，例如人胚胎干(hES)细胞遵循软骨分化途径，然后在促进软骨细胞生长的因子存在下培养，进行分化过程。开发了一种方法，帮助优化用于有效产生软骨细胞谱系的因子组合。本发明的该技术是针对产生一群细胞，富含能通过合成结缔组织成分，例如II型胶原和聚集蛋白聚糖在体内模拟软骨的细胞。
开发从hES细胞有效产生软骨细胞的方法是重要的，因为hES细胞可引起无限增殖。因此，本发明提供了一种系统，用于产生没有数量限制的软骨细胞。
下面的公开内容详细描述了如何制备本发明的软骨细胞。详细说明了这些细胞如何用于研究和药物开发。该公开内容还提供了用pPS衍生的软骨细胞再生和重建软骨，以恢复关节运动能力和用于美容目的的药物组合物、装置和治疗方法。
定义
就本发明的目的而言，除非另外说明，术语“软骨细胞”指任何来自软骨细胞途径的细胞。这包括能通过合成II型胶原和聚集蛋白聚糖模拟软骨的成熟细胞。还包括负责形成成熟软骨细胞的能自我更新的祖细胞。
就细胞个体发育而言，形容词“分化的”是相对而言的。与对照细胞相比，术语“分化细胞”是一步沿着发育路径进行的细胞。
“分化剂”在本文中指用于本发明培养系统产生属于软骨细胞系的分化细胞(包括前体细胞和终末分化细胞)的化合物。对此类化合物的作用方式没有限定。例如，所述分化剂辅助分化的过程可以是通过诱导或辅助表型改变、促进具有特定表型的细胞生长或抑制其它细胞的生长。分化剂还可以是其它因子的抑制剂，所述其它因子存在于培养基中或由细胞群合成，否则可能将分化引向非期望的细胞类型。
原型“灵长动物多能干细胞”(pPS)是来自受精后任何时间的胚前、胚或胎组织的多能细胞，其特征在于能够在合适的条件下产生数种不同细胞类型的子代，它们来自全部三个胚层(内胚层、中胚层、外胚层)的，这可根据标准试验例如在8-12周龄SCID小鼠内形成畸胎瘤的能力来确定。该术语包括各种类型的已建立的干细胞系和根据上述方式确认为是获得自初级组织的多能细胞。
PPS细胞的定义包括各种类型的胚胎细胞，例如人胚胎干细胞(hES)，见Thomson等(Science 282：1145，1998)；其它灵长动物的胚胎干细胞，例如恒河猴干细胞(Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995)，绒猴干细胞(Thomson等，Biol.Reprod.55：254，1996)和人胚胎生殖(hEG)细胞(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。该术语还包括其它类型的多能细胞。包括能产生所有三个生发层的衍生物、子代的任何灵长动物细胞，不论它们是来自胚组织、胎组织还是其它来源。pPS细胞最好不要来自恶性来源。通常希望(但非必须)此类细胞核型正常。
当细胞群中大部分干细胞及其后代衍生物显示明显区别于胚胎或成人的分化细胞的未分化细胞形态特征时，就称pPS细胞培养物为“未分化的”。本领域技术人员很容易识别未分化pPS细胞，一般在二维显微镜下表现为具有高核/胞质比和明显核仁的细胞集落。应理解的是，细胞群内非未分化细胞的集落通常被临近的分化细胞所包围。
“饲养细胞”指一种类型的细胞与另一种类型的细胞共培养，用于为第二种类型的细胞提供可生长环境的细胞。某些类型的pPS细胞可用初级小鼠胚胎成纤维细胞，无限增殖的小鼠胚胎成纤维细胞或分化自hES细胞的人成纤维细胞样细胞来支持。如果分裂后细胞已生长了至少一个周期，期间没有加新鲜饲养细胞来支持pPS细胞生长，则称pPS细胞群为“基本无”饲养细胞。
术语“胚状体”与“聚集体”同义，指已分化和未分化细胞的聚集体，出现在pPS细胞在单层培养物中过度生长或悬浮培养中维持。胚状体是不同细胞类型(通常源自不同胚层)的混合物，可根据形态学标准区别和可用免疫组织化学方法检测细胞标记。
“生长环境”指感兴趣的细胞增殖、分化或成熟的体外环境。此类环境的特征包括培养细胞的培养基，可能存在的任何生长因子或分化诱导因子，以及可能存在的支持结构(例如固体表面上的基质)。
当用任一合适的人工手段将一段聚核苷酸转移到某细胞内，或该细胞是遗传了多核苷酸的原来改变的细胞的后代时，则称细胞为“遗传改变的”或“转染的”细胞，或“遗传转化的”细胞。多核苷酸通常包含编码感兴趣的蛋白质的可转录序列，使细胞能在提高的水平上表达蛋白质。如果改变的细胞的子代有相同的变化，则称遗传改变为“可遗传的”。
常规技术
分子遗传学和基因工程中的常规方法可参见“Molecular Cloning：A laboratoryManual”(Sambrook等，Cold Spring Harbor)；“Gene Transfer Vectors for MammalianCells”(Miller&Calos编)和“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等，Wiley&Sons)。细胞生物学、蛋白质化学和抗体技术可参见“Current Protocolsin Protein Sceince”(J.E.Colligan等，Wiley&Sons)；“Current Protocols in CellBiology”(J.S.Bonifacino等，Wiley&Sons)和“Current Protocols in Immunology”(J.E.Colligan等，Wiley&Sons)。试剂、克隆载体和基因操作所用的试剂盒可向例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTeck和Sigma-Aldrich Co.等厂商购买。
细胞培养方法可参见最新版的“Culture of Animal Cells：A Manual of BasicTechnique”(R.I.Freshney编，Wiley&Sons)；General Techniques of CellCulture(M.A.Harrison&I.F.Rae.，Cambridge Univ.Press)和“Embryonic StemCells：Methods and Protocols”(K.Turksen等，Humana Press)。组织培养物和试剂可向Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International，Sigma Chemical Co.和Biomedicals等厂商购买。
在下列参考书中可找到软骨的生物学和病理学，软骨在关节维持中的作用的一般方面：Mechanobiology：Cartilage and Chondrocyte，J.F.Stoltz编，IOS Press2000；Biological Regulations of the Chondrocytes，M.Adolphe编，CRC Press 1992；Bone and Cartilage Allografts，G.E.Friedlaender等编，Amer.Acad.Orthopaedic1991；Joint Cartilage Degration，J.F.Woessner&D.S.Howell编，Marcel Dekker 1992；Skeletal Tissue Mechanics，第二版，R.B.Martin等，Springer Verlag 1998；Molecularand Developmental Biology of Cartilage，B.De Crombrugghe等编，Ann.N.Y.Acad.Sci.Vol.785：1996；和Joint Structure and Function：A Comprehensive Analysis，第3版，P.K.Levangie等编，F.A.Davis，2000。
干细胞来源
本发明可用各种干细胞来实施。其中，包括来自妊娠后形成的组织的灵长动物多能干细胞(pPS)，或来自妊娠期间任何时间的胚泡或胎或胚组织。非限定性例子是胚胎干细胞或胚胎生殖细胞的初级培养物或细胞系，详见后文。
本发明也以直接用初级胚或胎组织来实施，即直接由能够产生软骨细胞的原代细胞衍生获得软骨细胞而不先建立未分化细胞系。
胚胎干细胞
胚胎干细胞可自灵长动物的胚泡分离获得(美国专利5,843,780；Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995)。人胚胎干细胞(hES)可由人胚泡细胞制得，方法参见Thomson等(美国专利6,200,806；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.，38：133ff，1998)和Reubinoff等，Nature Biotch.18：399，2000)。与hES相当的细胞包括它们的多能衍生物，例如原始外胚层样(EPL)细胞，参见WO01/51610(Bresagen)。
hES细胞可由人前植入胚胎制备。或者，也可用体外授精(IVF)胚胎，还使一细胞人胚胎扩增到胚泡阶段(Bongso等，Hum Reprod 4：706，1998)。可在G1.2和G22.培养基中将胚培养至胚泡阶段(Gardner等，Fertil.Steril.69：84，1998)。通过与链霉蛋白酶(Sigma)的短暂接触从发育的胚泡中除去透明带(zonapellucida)。内细胞团通过免疫外科分离获得，其中，胚泡与兔抗人脾细胞抗血清的1∶50稀释液接触30分钟，然后在DMEM中洗涤三次，每次5分钟，然后与豚鼠补体(Gibco)的1∶5稀释液接触3分钟(Solter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：5099，1975)。DMEM中再洗涤2次后，从完整细胞体(ICM)中用移液管小心去除裂解的滋养外胚层细胞，然后将ICM平板培养在mEF饲养细胞层上。
9至15天后，通过与含1mM EDTA的无钙、无镁的磷酸盐缓冲液(PBS)接触，或分散酶或胰蛋白酶接触，或用微量移液管机械分离，将由内细胞团衍生的生长物分散成小块；然后，重新平板培养在新鲜培养基中的mEF上。用微量移液管挑出含有未分化形态的正在生长的单菌落，机械分散，再平板培养。ES样形态的特征是：菌落致密，高核/质比，核仁明显。然后，通过胰蛋白酶消化，Dulbecco′s PBS(含2mM EDTA)，IV型胶原酶(约200U/ml，Gibco)处理或用微量移液管挑选单菌落，使所得ES细胞每隔1至2周常规分裂。最佳菌落块大小约为50-100细胞。
胚胎生殖细胞
人胚胎生殖(hEG)细胞可由距最后一次月经后约8-11周时采集的人胎材料中的原始生殖细胞来制备。合适的制备方法参见Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998和美国专利6,090,622。
简而言之，用等渗缓冲液漂洗性腺嵴，然后置于0.1ml 0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA钠溶液(BRL)中，并切成小于1立方毫米的块。然后用100μl移液管的管尖吸细胞以进一步细胞解聚。37℃保温约5分钟，然后加入约3.5毫升的EG生长培养基。EG生长培养基是DMEM，4500mg/L D-葡萄糖，2200mg/L mM NaHCO3；15％ES级(ES合格的)胎牛血清(BRL)；2mM谷氨酰胺(BRL)；1mM丙酮酸钠(BRL)；1000-2000U/ml人重组白血病抑制因子(LIF，Genzyme)；1-2ng/ml人重组bFGF(Genzyme)和10μM毛喉萜(10％的DMSO溶液)。在另一种方法中，用透明质酸酶/胶原酶/DNAse分离EG细胞。从胚胎材料上切下具有肠系膜的性腺原基或生殖嵴，用PBS漂洗生殖嵴，然后置于0.1ml HCD消化溶液(0.01％V型透明质酸酶、0.002％DNAse I、0.1％IV型胶原酶，都购自Sigma，制备于EG生长培养基中)。切碎组织，37℃保温1小时或过夜，重新悬浮于1-3ml EG生长培养基中，并置于饲养细胞层上。
由亚汇合的饲养细胞层(例如STO细胞，ATCC No.CRL1503)制备的96孔组织培养板，在无LIF、bFGF和毛喉萜的改良EG生长培养基中培养3天，然后用5000rad的γ-辐射灭活。在每孔中加入约2ml初级生殖细胞(PGC)。在EG生长培养基中培养7-10天后进行第一次传代，将每孔中的培养物转移到另一24孔培养板的孔中，后者预先用辐照过的STO小鼠成纤维细胞处理过。培养细胞，每日更好新鲜培养基，直至观察到符合EG细胞的细胞形态，一般需7-30天或1-4代。
pPS细胞在未分化状态下的增殖
采用促进增殖但不促进分化的培养条件，可使pPS细胞可在培养物中持续繁殖。例如采用含血清的ES培养基，其中含80％DMEM(例如敲除DMEM，Gibco)，20％确定成分的胎牛血清(FBS，Hyclone)或代血清(WO98/30679)，1％非必需氨基酸，1mM L-谷氨酰胺和0.1mM β-巯基乙醇。临用前，加入4ng/ml人bFGF(WO99/20741，Geron Corp.)。
通常将ES细胞培养在一层饲养细胞上，饲养细胞一般为衍生自胚组织或胎组织的成纤维细胞。从怀孕13天的CF1小鼠收集胚胎，转移到2ml胰蛋白酶/EDTA中，然后小心切碎，37℃温育5分钟。加入10％FBS，使碎片沉淀，细胞在90％DMEM、10％FBS和2mM谷氨酰胺中增殖。为了制备饲养细胞层，辐照细胞以抑制增殖，但允许其合成支持ES细胞的因子(约4000radγ-辐射)。用0.5％明胶包被培养板过夜，每孔铺375,000辐射过的mEF，并在铺板5小时到4天使用。在接种pPS细胞之前用新鲜hES培养基置换该培养基。
Geron的科学家发现，既使不用饲养细胞也可将pPS细胞维持于未分化状态。无饲养细胞培养的条件包括合适的培养基质，尤其是胞外基质，例如Matrigel或层粘连蛋白。pPS细胞以＞15,000个细胞/cm2(最佳是90,000cm2-170,000cm2)铺板。通常，在细胞完全分散前终止酶解(例如，IV胶原酶处理约5分钟)。然后将约10-2000个细胞左右的细胞块直接平板培养在基质上，不再进一步分散。另外，在板达到汇合之前，可通过用0.5mM EDTA的PBS溶液温育5分钟，不用酶收集细胞。从培养容器中洗下后，将细胞铺在新的培养物中，不用进一步分散。
用含有支持细胞增殖但不分化的因子的营养培养基来支持无饲养细胞培养物。可通过在培养基中培养分泌此类因子的细胞，将这类因子引入培养基中，例如辐照过的(约4000rad)初级小鼠胚胎成纤维细胞、端粒化的小鼠成纤维细胞或衍生自pPS细胞的成纤维细胞样细胞。可调整培养基，例如在无血清培养基(例如补充了20％代血清和4ng/ml bFGF的KO DMEM)中以约5-6×104/cm2的密度平板培养饲养细胞。已调整1-2天的培养基进一步补充bFGF，然后用于支持1-2天的pPS细胞培养物。此外，还可加入其它因子，来帮助增殖而不分化，例如FGF-2或FGF-4受体的配体，c-kit(例如干细胞因子)的配体，与gp130结合的受体的配体、胰岛素、转铁蛋白、脂类、胆固醇、核苷、丙酮酸和还原剂如β-巯基乙醇。无饲养细胞培养法的其它特征可参见国际专利出版物WO01/51616和Xu等，Nat.Biotechnol.19：971，2001。
显微镜下，ES细胞呈高核/质比，核仁明显，形成的菌落致密，可察觉的细胞连接差。灵长动物ES细胞表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及可用抗体测知的标记Tra-1-60和Tra-1-81(Thomson等，Science 282：1145，1996)。小鼠ES细胞可用作SSEA-1的阳性对照和SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的阴性对照。SSEA-4也存在于人胚胎性癌(hEC)细胞上。pPS的体外分化不表达SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81表达的丧失，但提高了SSEA-1的表达，该抗原在未分化hEG细胞上发现。
多能细胞分化成软骨细胞
通过在富集具有所需表型(通过所需细胞的增生，或抑制或杀死其它细胞类型)的特殊生长环境中培养、分化或改造干细胞，获得本发明的软骨细胞。这些方法可用于许多类型的干细胞，包括前节所述的灵长类多能干细胞(pPS)。
当从已建立的pPS细胞系衍生时，本发明的细胞群和分离的细胞可与衍生出它们的谱系具有相同的基因组。这意味着除了任何核型异常，染色体DNA在pPS细胞和软骨细胞之间有90％以上是相同的，如果软骨细胞是通过正常有丝分裂过程从未分化的谱系获得的，这是不言而喻的。用重组方法处理过，以引入转基因或敲除一个内源基因的软骨细胞也还是被认为与衍生出它们的谱系具有相同的基因组，因为所有没有操作的基因元件都被保留了。
分化过程的引发
本发明的一个假设是，一种从pPS细胞衍生软骨细胞的有效方法是以非特异性方式引发pPS细胞的分化，同时或随后将引发的细胞与软骨细胞特异性分化因子混合。
另一种方法是导致pPS细胞形成胚状体或聚集体：例如，通过使供体pPS细胞培养物过度生长，或在具有低粘着性基质的培养容器中悬浮培养pPS细胞，从而形成胚状体。在一示范性方法中，在1mg/ml胶原酶中保温5-20分钟收集汇合的hES细胞单层培养物，使其分离成簇。然后将它们铺在非粘附细胞培养板(Costar)上，在含有80％敲除DMEM(Gibco)和20％非热灭活的胎牛血清(Hyclone)，并补充有1％非必需氨基酸、1mM谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇的培养基中培养。每隔一天，通过每孔加入2mL培养基饲养胚状体。
作为另一种选择，还可通过以非特定分化模式培养，引发分化过程：例如，通过在培养基中加入视黄酸(RA)或二甲亚砜(DMSO)。另一种引发分化的方法是通过将未分化的pPS细胞铺在刺激分化过程的基质，例如聚鸟氨酸上。见国际专利出版号WO01/51616。
驱动向软骨细胞分化
为了将培养物引向软骨细胞途径，在软骨细胞分化因子混合物中培养上节引发的pPS细胞。各因子单独或联合可以指导细胞沿软骨细胞途径分化，导致生长出有软骨细胞表型的细胞，抑制其它细胞类型的生长，或以另一种形式富集软骨细胞：实施本发明不需要理解导致软骨细胞富集的机制。
软骨细胞分化混合物的候选成分包括：转化生长因子(尤其是TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)、成纤维细胞生长因子(尤其是碱性成纤维细胞生长因子FGF-2)、生长和分化因子(尤其是GDF-5、GDF-6和GDF-7)、骨形态发生蛋白(尤其是BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7)、刺猬蛋白(尤其是印度刺猬、IHH)、L-抗坏血酸和甲状旁腺激素-相关蛋白(PTHrP)。Gibco是碱性FGF的优选来源。大部分其它化合物可购自R&D Systems，Minneapolis MN。
本发明的一个假设是，信号传递因子及其受体的分布随着分化发生而变化，得到的细胞群也随着时间改变。为了筛选可能的软骨细胞分化因子，可将pPS细胞作为聚集体培养不同的时间(0-10天)，以得到方法第二步的许多分化阶段。在每个时间点，解聚引发的聚集体，并重新铺在含有候选因子混合物的培养基中。
本发明的还有一个假设是，如果细胞维持成簇，可增强pPS细胞分化成软骨细胞。簇中细胞之间的相互作用可能对于使细胞不会去分化，以及沿着途径通向所需的表型是重要的。
因此，用限量的蛋白酶，例如胰蛋白酶，或机械研磨温和分离聚集的细胞，然后将其重新铺在高密度培养物中，称作微团培养物。简单说，将细胞块以6×107细胞/ml悬浮在含有约10％血清的培养基中，以50微升/孔铺在96孔平板(注入每孔的底部1/4)，该平板预先用合适的基质，例如明胶包涂。2小时后，细胞彼此粘附，形成细胞塞。此时，加入额外的200微升培养基，培养细胞，由于高密度，如需要每天更换培养基。软骨细胞合成大量的基体，将细胞簇胶结在一起的基体。
然后将细胞簇与分化因子的混合物一起培养一段时间，以筛选或使得所需表型增生(可能1或2周)。作为预先研究，以功能组研究了因子-例如制备TGFβ、GDF和BMP的混合物，测试它们与其它组，IHH、PTHrP、bFGF和抗坏血酸的不同组合驱动软骨细胞分化的能力。引发测试的浓度范围是BMP、GDF和TGFβ10-100ng/ml；PTHrP 10-100nM；和IHH 0.1-1mM。根据表型标记分析细胞(如下一节所述)后，排除不需要分化的组，将重要的组分成其中单独的组分。在几次重复后，确定最少组分的混合物，含有一种特定的因子或2、3或多种能够产生所需表型的混合物。
其它与同一受体结合的配体或抗体可被视为相当于任何本发明公开内容中提到的受体配体。
转化生长因子β(TGFβ)调节胚胎发育的各个方面，并在交感肾上腺祖细胞环境中表达(Wall等，Curr.Opin.Genet.Dev.4：517，1994)。在一些系统中，TGFβ调节甲状旁腺激素-相关蛋白(PTHrP)的表达(Pateder等，J.CellPhysiol.188：343，2001)。据信BMP和生长和分化因子(GDF)在骨骼形成，包括关节形成中起中心作用(Francis-West等，Cell Tissue Res 1296：111，1999)。印度刺猬(IHH)是机械转导复合物的主要成分，以刺激软骨细胞增殖(Wu等，J.Biol.Chem.276：35290，2001)。在软骨内骨化中，据信两个分泌信号IHH和PTHrP形成负反馈环，调节软骨细胞肥大性分化的发生。据信骨形态发生蛋白(BMP)被认为是骨骼元件形成的信号传导途径以及软骨和骨骼形成诱导机制的介体(Hoffmann等，Crit.Rev.Eukaryot.Gene Expr.11：23，2001)。BMP被认为是IHH/PTHrP反馈环的可能的相互作用蛋白(interactor)(Minina等，Development 128i4523，2001)。BMP可以与IHH以及PTHrP很好相互作用，协调软骨细胞增殖和分化。
根据该方法获得的pPS衍生的软骨细胞可含有高比例的祖细胞。如果是这种情况，可与软骨细胞成熟因子一起再培养一段时间，以驱动细胞进一步沿着分化途径。有效的成熟因子混合物的候选因子包括上面列出的分化因子，与生长因子联合，例如胰岛素样生长因子(IGF)和胰岛素。
分化细胞的特征
可根据许多表型标准来确定细胞的特征。这些标准包括但不限于形态特征的显微镜观察，表达的细胞标记的检测或定量，体外可测定的功能标准，和灌注入宿主动物时的行为。
表型标记
可通过是否表达软骨细胞的表型标记特征来确定本发明的细胞的特征。
可用II型胶原和聚集蛋白聚糖作为模拟关节软骨的细胞特异性标记。由于分别缺少弹性蛋白和I型胶原，弹性软骨和纤维软骨的标记，还筛选了培养物。由于分别缺少X型胶原和骨钙蛋白、肥大性软骨和骨的标记，还筛选了培养物，表明在软骨内骨形成的过程中产生瞬间软骨细胞表型。下表显示了这些人标记的市售抗体。
可用任何合适的免疫学技术，例如细胞表面标记的流式免疫细胞化学，或胞内或细胞表面标记的免疫组织化学(例如固定细胞的或组织切片的)，来检测组织特异性标记。Gallacher等，Blood 96：1740，2000提供了详细的流式细胞计数分析的方法。如果显著可检测量的抗体在标准免疫细胞化学或流式细胞计数中与抗原结合，任选在细胞固定后，任选使用标记的二抗或其它偶联物放大标记后，与抗原结合，定义细胞表面抗原的表达为阳性。表1显示了特异性抗体的可能来源。
表1结缔组织标记的抗体的市售来源
抗体 来源
I型胶原 Chemicon，目录号AB758
II型胶原 Chemicon，目录号AB761
X型胶原 RDI，目录号RDI-COLL10abr
弹性蛋白 Chemicon，目录号AB2043
骨钙蛋白 Biomed.Tech.Inc.，目录号BT593
聚集蛋白聚糖 BioTrend，目录号0195-8050
还可通过Northern印迹分析、斑点杂交分析或通过反转录酶引发的聚合酶链式反应(RT-PCR)，用序列特异性探针，以标准扩增方法在mRNA水平检测组织特异性基因产物的表达。见美国专利号5,843,780。该公开文献中列出的具体标记的序列数据可从公共数据库，例如GenBank中获得。
为了促进植活，有利的是通过提纯分化因子混合物、培养条件、以及计时和跟踪这些标记，使得群体中具有软骨细胞或其前体特征的细胞比例最大化。其中至少5％细胞合成II型胶原或聚集蛋白聚糖的群体是可以使用的，如果群体中的其它细胞是惰性的，或在结缔组织中起到其它作用(例如成纤维细胞或间充质细胞)。在许多情况下，富集到至少25％的细胞合成II型胶原或聚集蛋白聚糖更有效。
为了与软骨再生有关的治疗应用，通常需要使得细胞群形成弹性软骨、纤维软骨、肥大性软骨和骨的能力最小化。这意味着合成I型胶原、X型胶原或骨钙蛋白(单独或联合)的细胞比例要尽可能的低，优选要是对II型胶原或聚集蛋白聚糖阳性染色的细胞1/5以下，或小于1％。还理想的是具有低剩余比例的未分化pPS细胞的群体。优选群体是小于1％或0.2％SSEA-4+ve、Oct-4+ve，或内源端粒酶反转录酶的表达是阳性的。
动物模型实验
细胞群在宿主中模拟软骨和恢复关节功能的能力在临床应用的软骨开发中具有很大的兴趣。可用几种良好确定的动物模型测试软骨细胞功能的重建。
可用一模型，在家兔外耳中用6mm洞进行探索实验，而不伤害粘附的皮肤。然后移入接种了软骨细胞的基质，监测家兔的洞闭合(ten Koppel等，Biomaterials 22：1407，2201)。
另外，可在家兔股骨的股内侧脊索承重表面中建立全厚度缺陷(Grigolo等，Biomaterials 22：2417，2001)。用接种在生物材料上的软骨细胞，或来自微团培养物的多细胞聚集物修复损伤，可用膜，例如一片骨膜或筋膜在原位折叠移植物，或可通过手术针原位固定基质移植物。全厚度缺陷使得血液从髓腔渗入该位点，产生含有内源干细胞的凝块。该实验可以通过在滑车沟中建立的缺陷进行，而不是在股脊索。这是一个非承重位点，移植物不会象从股脊索中一样容易去除。
手术后1-6个月，检查了处理部位的组织学样品中具有移植的细胞和软骨沉积的数目。这包括对II型胶原和聚集蛋白聚糖进行免疫染色。移植的重要形态学特征包括软骨厚度、光滑关节表面、和移植物的整合以及在缺陷边界的内源软骨。可在12个月点证明移植物的长期稳定性。
作为另一种选择，可建立部分厚度缺陷，而不穿透下面的骨或髓腔(Hunziker等，Clin.Orthop.391 Supp：S171，2001)。这类缺陷作为骨关节炎的模型。另一种骨关节炎的模型涉及在切除卵巢的家兔的膝关节中注射雌二醇，导致骨节表面一致性的丧失，与在人类骨关节炎中观察到的缺陷相似(Tsai等，Clin.Orthoop.291：295，1993)。
分化的细胞的基因修饰
本发明的许多软骨细胞群具有显著的增殖能力。如需要，可通过提高细胞中的端粒酶反转录酶(TERT)水平，或提高内源基因的转录，或引入转基因进一步增强复制能力。特别合适的是国际专利申请WO98/14592中的人端粒酶(hTERT)的催化成分。Bodnar等，Science279：348，1998和Jiang等，Nat.Genet.21：111，1999描述了人细胞中端粒酶的转染和表达。可根据标准方法，通过RT-PCR、端粒酶活性(TRAP分析)、hTERT的免疫细胞化学染色、或复制能力评估基因改变的细胞的hTERT表达。还考虑了无限增殖细胞的其它方法，例如用编码myc、SV40大T抗原或MOT-2的DNA转化细胞(美国专利5,869,243，国际专利申请WO97/32972和WO01/23555)。
如需要，可体外制备本发明的细胞，或进一步处理以除去未分化的细胞，或保护体内回复体。从细胞群中耗竭未分化干细胞的一种方法是用一种载体转染细胞群，其中效应基因在一启动子控制下，该启动子导致在未分化细胞中优先表达-例如TERT启动子或OCT-4启动子。效应基因可以是指导细胞分拣的报道基因，例如绿色荧光蛋白。效应物可以直接裂解细胞，编码例如毒素或凋亡的介体，例如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Shinoura等，CancerGene Ther.7：739，2000)。效应基因可以使得细胞对外源药剂，例如抗体或前药的毒性效果敏感。一个例子是单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)基因，它导致表达它的细胞对更昔洛韦敏感(USSN60/253,443)。另外，效应物可以导致细胞表面表达一种外源决定簇，使得任何回复成未分化表型的细胞对体内天然存在的抗体敏感(USSN60/253,357)。
软骨细胞在研究和临床治疗中的用途
本发明提供了一种方法，以产生大量的软骨细胞，用于各种重要的研究、开发和商业目的。
本发明的细胞可用于制备一种cDNA文库，该文库相对不被在其它谱系的细胞中优势表达的cDNA污染。本发明的分化的细胞还可用于根据标准方法制备单克隆或多克隆的抗体，它们对于软骨细胞的标记及其衍生物具有特异性。
特别感兴趣的是用本发明的组合物开发药物和临床治疗。
药物筛选
本发明的细胞可用于筛选影响软骨细胞前体和成熟的软骨细胞的特性的因子(例如溶剂、小分子药物、肽、多核苷酸)或环境条件(例如培养条件或操作条件)。
在一个例子中，用pPS细胞(未分化或加入分化样式)筛选促使软骨细胞成熟，或促使软骨细胞在长期培养物中增殖或维持的因子。例如，可通过将其加入不同孔的细胞中，然后测定导致的任何表型改变，根据所需的进一步培养和细胞用途的标准来测试候选的成熟因子或生长因子。
另一个例子是用软骨细胞来测定在形成或重塑软骨的作用中能影响软骨细胞活性的小分子药物的效果。对此，体外将细胞与测试化合物混合，可测定化合物对基因表达或蛋白质合成的影响。筛选还可以在体内通过测定化合物对动物模型中细胞行为的影响进行。
本发明的其它筛选方法涉及测试药物组合物对软骨细胞生长、发育或毒性的潜在影响。这类筛选不仅适用于该化合物是设计成对软骨细胞本身具有药效，还适合于测试设计具有其它的主要药物学作用化合物的与软骨细胞有关的副作用。
读者可一般参考标准教科书“In vitro Methods in PharmaceuticalResearch”，Academic Press，1997，和美国专利5,030,015。候选药物化合物活性的评估一般涉及将本发明的分化的细胞与候选化合物单独混合或与其它药物混合。研究者确定由于化合物引起的细胞形态、标记表型、或功能活性的任何改变(与未处理的细胞或用惰性化合物处理的细胞相比)，然后将化合物的效果与观察到的改变关联。
可首先通过对细胞生存力、存活、形态和某些标记和受体的表达的影响来测定细胞毒性。可通过测定DNA合成或修复来确定药物对染色体DNA的作用。[3H]-胸腺嘧啶或BrdU掺入，尤其是在细胞周期中不定时间的掺入，或高于细胞复制所需的水平是与药效一致的。不良影响还包括用中期涂布法确定的姐妹染色单体交换的异常速率。读者可参考A.Vickers(“In vitro Methodsin Pharmaceutical Research”，Academic Press，1997”pp.375-410)的进一步详述。
临床治疗中的软骨细胞
本发明还提供了用软骨细胞前体细胞及其衍生物在需要治疗的病人体内，维持或恢复含软骨的肌骨骼结构。可以考虑任何导致关节运动性受损的病况。包括由冲击创伤导致的损伤，以及运动伤害。本发明的细胞还可被用于治疗变性的病况，例如骨关节炎和类风湿性关节炎，以恢复丧失的功能，条件是基本病理学使该变性足以受到很好的控制。还考虑本发明的细胞用于美容手术，包括但不限于鼻部手术。参见G.C.Burget&F.J.Menick，AestheticReconstruction of the Nose，Mosby Year Book 1994；Nikolay Gogol等，The Nose，David R.Godline publisher，1993；和Yoo等，J.Urol.162：119，1999。
可制备本发明的软骨细胞，以细胞悬液形式给药(如需要，使用胰蛋白酶或胶原酶)，可使用生理学上相容的赋形剂：例如，一种等渗介质，每300毫升中含有1.25mL硫酸庆大霉素(70μmol/L)、2.0ml两性霉素(2.2μmol/l)、7.5ml L-抗坏血酸(300μmol/l)、25ml血清或其等价物(至10％v/v)。在软骨细胞移植过程中，用通过机械或粘合保留装置，例如生物相容的纤维蛋白胶固定的帽覆盖损伤的软骨。用约23号针在覆盖的帽下注射在移植赋形剂中的培养的软骨细胞(约0.6ml，含有约10×106软骨细胞)。
另外，可通过在形成的基质上生长，制备软骨细胞。例如，使用胶原膜(市售胶原基质贴片购自Ed.Geistlich Sohne，Switzerland)。在移植前几天，用移植赋形剂更换生长培养基。在手术中，将载有软骨细胞的基质用生物学上相容的粘合剂粘到受损的软骨区域中。保留覆盖帽或基质一段时间，足以让软骨修复，然后被身体吸收或再吸收，例如，在移植后的2-3个月内。可在国际专利出版物WO01/08610中发现对可再吸收的帽和基质的设计和使用的更详细描述。
一般，病人选择、给药模式和支持结构选择的最终责任是管理临床医师的责任。
为了商业销售，本发明的软骨细胞一般以药物组合物的形式提供，其中含有在用于人给药的足够无菌的条件下制备的等渗赋形剂。对于细胞组合物的药物制剂的基本原则，读者可以参考G.Morstyn&W.Sheridan编，CellTherapy：Stem Cell Transplantation，Gene Therapy，and CellularImmunotherapy，Cambridge University Press，1996。该组合物还可以含有一种基质，以在治疗后的最初几个月原位保持软骨细胞。可吸收的生物材料省去了随后手术去除的必要性。除了WO01/086101所述的胶原基质贴片，其它可能的基质包括生物可再吸收的聚合物羊毛基质(Rudert等，CellsTissues Organs 167：95，2000)；类透明质酸衍生物(Grigolo等，Biomaterials22：2417，2001)；聚(L-丙交酯-ε-己内酯)制备的海绵(Honda等，J.OralMaxillofac.Surg.58：767，2000)和胶原-纤维蛋白基质(Clin.Exp.Rheumatol.18：13，2000)。
本发明还包括在制备、销售或使用过程中的任何时间存在的细胞组和其它成分。细胞组包含本文所述的两种或多种细胞群的任意组合，例如但不限于一类分化的pPS衍生的细胞(软骨细胞，其前体、亚型等)联合未分化的pPS细胞或其它分化的细胞类型，有时具有相同的基因组。该组中的各细胞类型可包装在一起，或装在同一设备的不同容器中，或在不同位置，处于同一企业，或有商业关系的不同企业控制下。本发明的产品可任选的包装在合适的容器或药盒中，配有用于所需目的，例如关节软骨重建或美容手术的方法说明书。
阅读本文的本领域技术人员应理解，可根据常规优化改变本发明，而不违背本发明的精神或权利要求的范围。
在法律允许包括以下多重引用权利要求的情况下本发明的实施方案：
1.通过分化灵长类多能干细胞获得的细胞群，其特征在于，至少5％细胞从内源基因合成II型胶原或聚集蛋白聚糖。
2.如权利要求1所述的细胞群，其特征在于，少于1％细胞合成弹性蛋白、I型胶原、X型胶原或骨钙蛋白。
3.通过分化灵长类多能干细胞获得的细胞群，其特征在于，该细胞导致Koppel等，Biomaterials 22：1407，2001所述的动物模型中6mm孔在2个月内闭合。
4.在体外培养物中增殖的一群软骨细胞祖细胞，其特征在于，该细胞是通过分化灵长类多能干细胞得到的，能形成具有权利要求1-3所述的细胞特征的子代。
5.如权利要求1-3所述的细胞群，其特征在于，含有少于1％的未分化的灵长类多能干细胞。
6.如权利要求1-5所述的细胞群，其特征在于，含有基因改变过，以提高的水平表达端粒酶反转录酶的细胞。
7.如前任一所述的细胞群，其特征在于，所述细胞与灵长类胚胎干细胞的确定谱系具有相同的基因组。
8.两个群细胞，其特征在于，该细胞群含有来自任一上述权利要求的分化的细胞群，和从其获得的未分化的灵长类多能干细胞。
9.一种获得权利要求1-7任一所述的细胞群的方法，其特征在于，该方法包括分化灵长类多能干细胞，然后将分化的细胞与软骨细胞分化因子混合物一起培养。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该方法包括分化灵长类多能干细胞形成胚状体。
11.如权利要求9-10所述的方法，其特征在于，所述软骨细胞分化因子混合物含有一种或多种因子，选自转化生长因子、成纤维细胞生长因子、生长和分化因子、骨形态发生蛋白、刺猬蛋白、L-抗坏血酸、和甲状旁腺激素相关蛋白。
12.一种产生软骨的方法，其特征在于，在细胞群合成II型胶原或聚集蛋白聚糖的条件下培养权利要求1-7所述的细胞群。
13.一种用于在体内产生、修复或维持软骨的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-7所述的细胞群和生理学上相容的赋形剂。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，还含有体内重吸收的基质。
15.一种筛选化合物的方法，该化合物具有调节软骨细胞生长、分化、或软骨成分合成的能力，其特征在于，该方法包括将该化合物与权利要求1-7所述的细胞群混合，测定细胞群中任何表型或代谢改变，所述改变是由于与化合物混合引起的，并将改变与化合物调节软骨细胞生长、分化或软骨成分合成的能力相关联。
16.一种重建个体中软骨的方法，其特征在于，该方法包括对个体施用权利要求1-7所述的细胞群。
17.权利要求1-7所述的细胞群在制备用于在个体内重建软骨的药物的用途。
18.权利要求1-7所述的细胞群在制备用于治疗关节创伤、关节炎或骨关节炎或美容手术的药物中的用途。
19.如前任一权利要求所述的细胞群体、组合物、方法或用途，其特征在于，所述灵长类多能干细胞是人成纤维细胞获得的细胞子代。
20.如前任一权利要求所述的细胞群体、组合物、方法或用途，其特征在于，所述灵长类多能干细胞是人胚胎干细胞。

Claims (20)

1.通过分化灵长类多能干细胞获得的细胞群，其特征在于，至少5％细胞从内源基因合成II型胶原或聚集蛋白聚糖。
2.如权利要求1所述的细胞群，其特征在于，少于1％细胞合成弹性蛋白、I型胶原、X型胶原或骨钙蛋白。
3.通过分化灵长类多能干细胞获得的细胞群，其特征在于，该细胞导致Koppel等，Biomaterials 22：1407，2001所述的动物模型中6mm孔在2个月内闭合。
4.在体外培养物中增殖的一群软骨细胞祖细胞，其特征在于，该细胞是通过分化灵长类多能干细胞得到的，能形成具有权利要求1-3所述的细胞特征的子代。
5.如权利要求1-3所述的细胞群，其特征在于，含有少于1％的未分化的灵长类多能干细胞。
6.如权利要求1-3所述的细胞群，其特征在于，含有基因改变过，以提高的水平表达端粒酶反转录酶的细胞。
7.如权利要求1-3所述的细胞群，其特征在于，所述细胞与灵长类胚胎干细胞的确定谱系具有相同的基因组。
8.两个细胞群，其特征在于，该细胞群含有权利要求1-3的分化的细胞群，和从其获得的未分化的灵长类多能干细胞。
9.一种获得权利要求1-3任一所述的细胞群的方法，其特征在于，该方法包括分化灵长类多能干细胞，然后将分化的细胞与软骨细胞分化因子混合物一起培养。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该方法包括分化灵长类多能干细胞形成胚状体。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述软骨细胞分化因子混合物含有一种或多种因子，选自转化生长因子、成纤维细胞生长因子、生长和分化因子、骨形态发生蛋白、刺猬蛋白、L-抗坏血酸、和甲状旁腺激素相关蛋白。
12.一种产生软骨的方法，其特征在于，在细胞群合成II型胶原或聚集蛋白聚糖的条件下培养权利要求1-3所述的细胞群。
13.一种用于在体内产生、修复或维持软骨的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-3所述的细胞群和生理学上相容的赋形剂。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，还含有体内重吸收的基质。
15.一种筛选化合物的方法，该化合物具有调节软骨细胞生长、分化、或软骨成分合成的能力，其特征在于，该方法包括将化合物与权利要求1-3所述的细胞群混合，测定细胞群中任何表型或代谢改变，所述改变是由于与化合物混合引起的，并将改变与化合物调节软骨细胞生长、分化或软骨成分合成的能力相关联。
16.一种重建个体中软骨的方法，其特征在于，该方法包括对个体施用权利要求1-3所述的细胞群。
17.权利要求1-3所述的细胞群在制备用于在个体内重建软骨的药物的用途。
18.权利要求1-3所述的细胞群在制备用于治疗关节创伤、关节炎或骨关节炎或美容手术的药物中的用途。
19.如权利要求1-3所述的细胞群，其特征在于，所述灵长类多能干细胞是人成纤维细胞获得的细胞子代。
20.如权利要求1-3所述的细胞群，其特征在于，所述灵长类多能干细胞是人胚胎干细胞。
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