CN102186969A

CN102186969A - 由人多能干细胞制备人皮肤替代品的方法

Info

Publication number: CN102186969A
Application number: CN2009801256559A
Authority: CN
Inventors: 欣德·盖农; 吉勒·勒迈特; 克里斯蒂娜·巴尔代斯基; 马克·佩先斯基
Original assignee: NATIONAL HEALTH AND MEDICINE INST
Current assignee: NATIONAL HEALTH AND MEDICINE INST; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2009-06-23
Publication date: 2011-09-14
Also published as: KR20110022713A; WO2009156398A1; EP2297299A1; JP2011525370A; AU2009264336A1; BRPI0914422A2; US20110165130A1

Abstract

本发明涉及用于获得由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞群的体外方法，该方法包括如下步骤：在刺激表皮诱导的物质和刺激角质形成细胞的终末分化的物质存在下共培养人多能干细胞和支持外胚层分化的细胞。本发明的另一目的涉及制备人皮肤替代品的方法，该方法包括以下步骤：提供由本发明方法得到的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群的器官型培养。

Description

由人多能干细胞制备人皮肤替代品的方法

技术领域

本发明涉及用于获得由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞群的体外方法和制备人皮肤替代品的方法。

背景技术

皮肤由形成分化细胞功能单元的自我更新层组成，所述分化细胞起源于增殖的角质形成细胞的单一基层。构成角质层的死细胞和垂死细胞在脱屑过程中连续脱落，并被由生发层中的表皮干细胞衍生的细胞替代。表皮功能的丧失导致热调节的丧失、微生物防御性降低、干燥的风险、伤口修复被抑制以及美容的问题。在缺少用于皮肤移植的充足自体同源供体的情况下，用培养的人角质形成细胞覆盖伤口代表着有希望的治疗选择。

而且，人皮肤的体外和体内模型可以作为用于研究表皮细胞系或用于测试美容和药物化合物的治疗或毒性效应的极佳工具。例如对于体外模型的需要通过以下事实得到加强：存在着提供替代使用动物测试化合物和制剂的替代方式的动机。

另外，许多疾病影响角质形成细胞的功能，或者细胞自发地发挥作用或通过改变其形成多分层表皮组织的能力。人皮肤的体内和体外模型可以作为揭示疾病的分子机制并因此识别具有治疗潜力的药学或生物学化合物的途径。

因此，需要一种获得人角质形成细胞群的方法，该细胞群随后可以用于皮肤治疗或用于获得人皮肤的体外和体内模型。

胚胎干细胞和遗传学上重编程以复制胚胎干细胞(例如，称为“iPS”细胞的那些，其代表“诱导的多能干”细胞)的全部特征的体细胞是具有广泛增殖能力并因此提供用于研究和医药上的巨大潜在用途的多能干细胞。因此现有技术中已记载有一些用于从多能干细胞获得人角质形成细胞的尝试。例如，文献WO 02/097068描述了一种用于诱导胚胎干细胞的角质形成细胞分化的方法。进一步的研究报告了利用胚胎干细胞获得人角质形成细胞群(Coraux C.等人，2003；Ji L.等人，2006；Metallo CM.等人，2007以及Aberdam E.等人，2008)。然而，迄今为止，现有技术的方法没有获得由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞，其在按照使用来自供体的成人基底角质形成细胞时显示出有效的技术(例如参见Green，2008)处理时表现出形成多分层表皮(在体外或在动物异种皮移植后)的能力。

发明内容

本发明涉及用于获得由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞群的体外方法，包括如下步骤：在刺激表皮诱导的物质和刺激角质形成细胞的终末分化的物质存在下共培养人多能干细胞和支持外胚层分化的细胞。

本发明也涉及用于获得由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞群的体外方法，所述方法包括如下步骤：在补充有BMP-4和抗坏血酸的角质形成细胞培养基的存在下，在涂有一层饲养层成纤维细胞的细胞培养表面上培养人多能干细胞。

本发明还涉及通过上述方法可获得的由人多能干细胞衍生的分离的基本上纯的同源人角质形成细胞群。

本发明还涉及含有本发明的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群和任选的药学可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

本发明也涉及制备人皮肤替代品的方法，所述方法包括以下步骤：提供本发明的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群的器官型培养。

本发明还涉及可由上述方法获得的人皮肤替代品。

本发明还涉及用上述人皮肤替代品移植动物的方法。

本发明还涉及可由上述方法获得的人皮肤的动物模型。

最后，本发明涉及用于治疗与皮肤损伤有关的病症的上述人皮肤替代品。

本发明的详细说明

定义：

如本文所使用的，术语“标志物”指的是在细胞表面或细胞内表达的蛋白质、糖蛋白或其他分子，且其可用于帮助识别细胞。标志物一般可由常规方法检测。可用于检测细胞表面标志物的方法的特定的非限制性例子是免疫组织化学、荧光激活的细胞分选(FACS)和酶学分析。

术语“人角质形成细胞群”指的是能够重建人表皮以及其特征在于能在将分化为角质层的死的和完全角质化细胞的过程中产生角蛋白的细胞群。基底角质形成细胞的标志物包括具有角蛋白5、14(K5/K14)和转录因子p63的基底层的标志物、具有角蛋白1和角蛋白10(K1/K10)的上基底层的标志物、外皮蛋白(involucrin)、抗角蛋白微丝聚集蛋白(filaggrin)和具有整联蛋白α6和β4、层粘连蛋白-5和胶原质VII的真皮-表皮联结的特异性标志物。

如本文所使用的，术语“人多能干细胞”指的是具有形成任何成体细胞的能力的任何人前体细胞。

如本文所使用的，术语“人胚胎干细胞”或“hES细胞”或“hESC”指的是具有形成任何成体细胞的能力的人前体细胞。hES细胞衍生自胎龄小于一周的授精胚胎。

如本文所使用的，术语“人诱导的多能干细胞”或“人iPS细胞”或“人iPSC”指的是由人非多能细胞(例如成体体细胞)人工衍生的人多能干细胞类型。人的诱导多能干细胞在形成任何成体细胞的能力方面与人胚胎干细胞相同，但不是来自胚胎。通常，人的诱导多能干细胞可通过Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因在任何成体体细胞(例如成纤维细胞)中的诱导表达获得。例如，人的诱导多能干细胞可以按照Takahashi K.等人(2007)、Yu等人(2007)描述的方案获得，或通过任何其中这些原始方案中用于重编程细胞的一种或其他试剂由作用于或转移到iPS细胞系起源的体细胞的任何基因或蛋白替代的其他方案获得。基本上，成体体细胞用包含Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的病毒载体例如逆转录病毒转染。

如本文所使用的，术语“基本上纯的同源群”指的是其中细胞总数的大部分(例如，至少约80％、优选至少约90％、更优选至少约95％)具有目标角质形成细胞的规定的特征的细胞群。

如本文所使用的，术语“分离的”指的是已经与其自然环境的至少一些组分分离的细胞或细胞群。

如本文所使用的，术语“角质形成细胞培养基”指的是含有支持人角质形成细胞的生长、增殖和存活所必需的营养物的培养基。因此，本发明的合适培养基可以是细胞可以在其中生长的最低培养基，例如补充有至少10％的胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle’s最低必需培养基(DMEM)。在另一种具体实施方式中，所述培养基是由2/3 DMEM、1/3 HAM:F12和10％的胎牛血清(FCII，Hyclone)组成的FAD培养基，其补充有5μg/ml胰岛素、0.5μg/ml氢化可的松、10^-10M霍乱毒素、1.37ng/ml三碘甲腺原氨酸(triodothyronin)、24μg/ml腺嘌呤和10ng/ml重组人表皮生长因子(EGF)。

术语“细胞培养表面”或“细胞培养基质”指的是适于细胞培养的每种类型的表面或基质。术语“细胞培养表面”包括但不限于组织培养平板、皿、孔或瓶。在一种具体的实施方式中，该培养表面是培养平板、皿、孔或瓶的塑料表面。细胞培养表面与真皮成纤维细胞的涂层相容。

如本文所使用的，术语“支持外胚层分化的细胞”指的是提供适当底物以及分泌适当因子以支持人多能干细胞的生长和分化的细胞。在一种具体的实施方式中，支持外胚层分化的细胞选自成纤维细胞，更特别地人成纤维细胞，且更特别地真皮成纤维细胞的组。在一种具体实施方式中，支持外胚层分化的细胞是丝裂霉素灭活的人真皮成纤维细胞。

如本文所使用的，术语“饲养层成纤维细胞”指的是用作多能干细胞的基底层并提供分泌的因子、细胞外基质和维持干细胞处于未分化状态而不丧失其多能性的细胞接触的细胞。饲养层细胞可以由γ照射或丝裂霉素灭活。根据本发明的一种实施方式，饲养层成纤维细胞可来自成纤维细胞，更特别是人成纤维细胞，且更特别是真皮成纤维细胞的组，包括真皮成纤维细胞系。真皮成纤维细胞系的例子包括但不限于CCD-1112SK(Hovatta O等人，2003)和3T3-J2(Rheinwald JG等人，1975)。在一种具体的实施方式中，预先处理真皮成纤维细胞以涂覆到培养表面之前停止其增殖。因此，真皮成纤维细胞可以被照射或用细胞周期阻滞剂例如丝裂霉素处理。

如本文所使用的，术语“真皮成纤维细胞”指的是合成并维持真皮的细胞外基质的细胞群。真皮成纤维细胞的具体标志物包括波形蛋白和FAP(成纤维细胞活化蛋白)。

如本文所使用的，术语“刺激表皮诱导的物质”指的是能够诱导表皮标志物例如角蛋白8、角蛋白18、角蛋白5和角蛋白14的表达的物质。通常刺激表皮诱导的物质抑制滋养层和中胚层的诱导。

在一种具体实施方式中，刺激表皮诱导的物质选自骨形成蛋白(例如BMP-2、BMP-4和BMP-7)、受体调节的Smad蛋白(例如Smad1、Smad5和Smad9)和TGF-β家族的配体(例如生长和分化因子6GFD-6)(Moreau等人，2004)。在优选的实施方式中，刺激表皮诱导的物质选自BMP-2、BMP-4、BMP-7、Smad1、Smad5、Smad7和GFD-6。在优选的实施方式中，刺激表皮诱导的物质是BMP-4。

术语“BMP-4”指的是骨形成蛋白4。BMP-4是属于蛋白TGF-β超家族的多肽。示例性的天然BMP-4氨基酸序列以登录号AAC72278提供于GenPept资料库中。

如本文所使用的，术语“刺激角质形成细胞的终末分化的物质”指的是刺激角蛋白5和角蛋白14的表达的物质。事实上，角蛋白5和角蛋白14是能够在3D培养中终末分化的基底角质形成细胞的标志物。在一个具体的实施方式中，刺激角质形成细胞终末分化的物质选自抗坏血酸和视黄酸。

术语“抗坏血酸”指的是具有下式的(R)-3，4-二羟基-5-((S)-1，2-二羟基乙基)呋喃-2(5H)-酮：

如本文所使用的，术语“器官型培养”指的是三维的组织培养，其中培养细胞用于在体外重建组织或器官。

如本文所使用的，术语“病症”指的是与皮肤损伤有关的任何疾病或状态。术语“与皮肤损伤有关的病症”指的是以皮肤损伤、受伤、机能障碍、缺陷或异常为特征的任何疾病或临床状态。因此，该术语包括例如受伤、退行性疾病和遗传性疾病。在某些实施方式中，目标病症是遗传性皮肤病，例如表皮分解性水泡症(Epidemolysis bullosa)、着色性干皮病、鱼鳞病、外胚层发育不良、kindler综合症及其他。

如本文所使用的，术语“受试者”指的是哺乳动物，优选人类，其可能患与皮肤损伤有关的病症，但可以有或没有该病症。

如本文所使用的，在本发明的环境中，术语“治疗”(动词)或“治疗”(名词)指的是意在延迟或预防病症发作的方法，意在逆转、减轻、抑制、减缓或停止病理症状的进展、加重或恶化的方法，意在导致病理症状改善的方法，和/或意在治愈该病症的方法。

本发明的方法：

本发明涉及用于获得由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞群的体外方法，该方法包括如下步骤：在刺激表皮诱导的物质和刺激角质形成细胞的终末分化的物质存在下共培养人多能干细胞和支持外胚层分化的细胞。

可由上述方法获得的由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞能够重演人基底角质形成细胞的所有形态和功能属性。事实上，本发明人证实所述细胞能够重建人表皮(在体外和在体内)，且其特征在于产生角蛋白的能力。更具体地，所述细胞表达基底角质形成细胞的标志物，包括具有角蛋白5、14(K5/K14)和转录因子p63的基底层的标记物、具有角蛋白1和角蛋白10(K1/K10)的上基底层的标志物、外皮蛋白、抗角蛋白微丝聚集蛋白以及具有整联蛋白α6和β4、层粘连蛋白-5和胶原蛋白VII的真皮-表皮联结的特异性标志物。它们也可以表达角蛋白19(其是皮肤干细胞的标志物)以及角蛋白3和12(其是角膜细胞的标志物)。

本发明的一种实施方式涉及用于获得由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞群的体外方法，所述方法包括如下步骤：在补充有BMP-4和抗坏血酸的角质形成细胞培养基的存在下，在涂覆一层饲养层成纤维细胞的细胞培养表面上培养人多能干细胞。

在具体的实施方式中，人多能干细胞包括但不限于胚胎干细胞(hES细胞)或人的诱导多能干细胞(人iPS细胞)。

根据本发明的一种实施方式，hES细胞可以选自任何hES细胞系。hES细胞系的例子包括但不限于SA-01、VUB-01、H1(Thomson JA等人，1998)和H9(Amit M等人，2000)。根据本发明，hES细胞不在如国际专利申请WO 2002/097068所描述的LIF存在的情况下预先培养。而且，根据本发明，应当理解hES细胞不在如Metallo CM.等人(2007)或Ji L等人(2006)所描述的胚状体中预先分化。

根据本发明的一种实施方式，人iPS细胞可以选自任何人iPS细胞系。人iPS细胞系的例子包括但不限于克隆201B(Takahashi等人，2007)和iPS(Foreskin或IMR90)-1-MCB-1(Yu等人，2007)。

或者，hES细胞或人iPS细胞可以选自构成治疗目的的主细胞库。在优选的方式中，可以选择hES细胞或人iPS以避免或限制大部分人口中的免疫排斥。通常hES细胞或人iPS细胞对于编码主要组织相容性抗原A、B和DR的基因是HLA-纯合型的，意思是它们在HLA库中具有单一的遗传特征。这些细胞可用来建立作为可更新的细胞源的干细胞库，这些细胞可适于制备用于与皮肤损伤有关病症(例如是伤口、烧伤、辐射、疾病相关的表皮异常...)的细胞治疗的人皮肤替代品。

在另一种具体实施方式中，人多能干细胞可以携带作为人皮肤遗传疾病病因的一个或多个突变。

根据本发明的一种实施方式，以真皮成纤维细胞可以自然地贴附在其上的方式选择细胞培养表面。可以选择各种材料的细胞培养表面。这类材料的例子包括但不限于组织培养皿或涂覆有明胶的皿。

在一种具体实施方式中，该角质形成细胞培养基可以补充一种或多种选自以下的物质：谷氨酰胺、表皮生长因子(EGF)、丙酮酸钠、腺嘌呤、胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素(choleric toxin)和三碘甲腺原氨酸。在一种具体实施方式中，该角质形成细胞培养基是Rheinwald JG.等人(1975)描述的培养基。

根据本发明的实施方式，角质形成细胞培养基中抗坏血酸的浓度可以是0.01mM到1mM。在一种具体实施方式中，抗坏血酸的浓度是0.3mM。

角质形成细胞培养基中BMP-4的浓度可以是0.02nM到77nM或0.3ng/ml到1000ng/ml。在一种具体实施方式中，BMP-4的浓度是0.5nM。

根据本发明，培养人多能干细胞(例如hES细胞或人iPS细胞)足以使所述细胞完全分化成重演人基底角质形成细胞的所有形态和功能属性的细胞群(“由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞”)的一段时间。根据一种具体的实施方式，该段时间可以为20天到60天，优选20天到40天。

本发明的另一个目的涉及可由上述方法获得的由人多能干细胞衍生的分离的人角质形成细胞群。

根据另一种实施方式，本发明方法还可以包括以下步骤：在不含抗坏血酸和BMP-4的角质形成细胞培养基的存在下，在涂有真皮成纤维细胞层的细胞培养表面上培养由如上所述方法获得的由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞群。该进一步的步骤可适于获得由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群。

真皮成纤维细胞、细胞培养表面和角质形成细胞培养基可以与如上所述的相同，条件是角质形成细胞培养基不补充抗坏血酸和BMP-4。

本发明的另一个目的涉及可由上述方法获得的人多能干细胞衍生的分离的基本上纯的同源人角质形成细胞群。

药物组合物：

根据本发明方法获得的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群随后可适用于皮肤治疗。

因此，本发明涉及药物组合物，其含有本发明的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群和任选的药学可接受的载体或赋形剂。在某些实施方式中，药物组合物还可含有至少一种生物活性物质或生物活性因子。

如本文所使用的，术语“药学可接受的载体或赋形剂”指的是不干扰祖细胞生物活性的效果的载体介质，且其在给药浓度下不对宿主产生过度毒性。合适的药学可接受的载体或赋形剂的例子包括但不限于水、盐溶液(例如林格氏溶液)、油、明胶、糖类(例如乳糖、淀粉酶或淀粉)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯六茜素(pyroline)。药物组合物可以配制成液体、半液体(例如凝胶)或固体(例如基质、网格、支架等)。

如本文所使用的，术语“生物活性物质或生物活性因子”指的是其在本发明药物组合物中的存在有益于受试者接受该组合物的任何分子或化合物。如本领域技术人员了解的，适合用于本发明实施的生物活性物质或生物活性因子可以在广泛的多个生物活性分子和化合物家族中找到。例如，可用于本发明环境中的生物活性物质或生物活性因子可以选自抗炎剂、抗凋亡剂、免疫抑制或免疫调节剂、抗氧化剂、生长因子和药物。

本发明的相关方面涉及治疗患有与皮肤损伤有关的病症的受试者的方法，所述方法包括将有效量的本发明由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群(或其药物组合物)施用于受试者的步骤。

如本文所使用的，术语“有效量”指的是足以达到其预定目的的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群(或其药物组合物)的任何量。

可以使用任何适当的方法将本发明的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群(或其药物组合物)施用于受试者。

本发明的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群可以单独植入，或与其他细胞结合，和/或与其他生物活性因子或试剂和/或药物结合。如本领域技术人员所理解的，这些其他细胞、生物活性因子、试剂和药物可以与本发明细胞同时或顺序施用。

在某些实施方式中，本发明的治疗还包括在开始基于细胞的治疗之前对该受试者进行药物免疫抑制。用于受试者的全身或局部免疫抑制的方法是本领域所熟知的。

有效剂量和给药方案可以很容易通过基于受试者的病理特性的良好医学实践确定，并依赖于多种因素，包括但不限于：病理症状的程度和目标组织或器官损伤或退化的程度，以及受试者的特征(例如年龄、体重、性别、总体健康等)。

本发明的人皮肤替代品和动物模型：

本发明的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群也可以适于制备人皮肤替代品。

通常，本发明的人皮肤替代品包括多分层表皮，其来自已经层化为鳞状上皮细胞的上述由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群的体外衍生的培养物。在一种具体的实施方式中，本发明的人皮肤替代品可包含上述多分层表皮和真皮。

因此本发明的另一方面涉及制备人皮肤替代品的方法，该方法包括如下步骤：提供本发明的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群的器官型培养。

本发明的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群的完全层化和组织分化可以通过利用三维器官型培养法(Doucet O等人，1998；Poumay y.等人，2004；Gache Y.等人，2004)来实现。例如，当本发明的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群的体外培养物在气-液界面生长时，形成高度有序的角质层。

在一种具体实施方式中，本发明的人皮肤替代品可以如Poumay，Y等人，2004所述产生。本发明的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群的培养可以在聚碳酸酯培养插入物(culture insert)上进行。这些细胞可以在补充有1.5mM CaCl₂和50μg/ml抗坏血酸的Epilife培养基中培养11天。通过去除培养基使细胞暴露于气-液界面10天。

在一种具体的实施方式中，由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群预先接种在移植有人真皮成纤维细胞的细胞培养基质上，然后提供如上所述的其器官型培养。该具体实施方式使得能够获得包括真皮和表皮的人皮肤替代品。这种方法可以通过如Del Rio M.等人(2002)或Larcher F.等人(2007)描述的方法来进行。例如，本发明的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群可以接种在移植有活的真皮成纤维细胞的纤维蛋白基质上。然后器官型培养覆盖生长以达到角质形成细胞汇合，并最终在气-液界面保持7天以增强上皮的层化和分化。

本发明的另一目的涉及可由上述方法获得的人皮肤替代品。

本发明的另一目的涉及用上述人皮肤替代品移植动物，优选哺乳动物，更优选小鼠的方法。在一种具体实施方式中，所述动物是免疫缺陷动物(例如NOD/SCID小鼠)。所述方法可用于提供人皮肤的动物模型。

在一种具体实施方式中，用本发明的人皮肤替代品移植的动物可如Del Rio M.等人(2002)所述产生。简言之，将动物剃净并在无菌条件下净化。然后在小鼠的背部形成全层(full-thickness)伤口，最后在无菌条件下用本发明的人皮肤替代品进行移植。10-12个星期可能足以在所述动物上获得人皮肤。

本发明的另一目的涉及可由上述方法获得的人皮肤的动物模型。

本发明的人皮肤替代品和动物模型可具有各种用途。这些用途包括但不限于，用于筛选化合物、培养肿瘤的底物和病理学试剂(例如人乳头状瘤病毒)，以及用于模拟人身与皮肤损伤有关的损伤或病症。

例如本发明的人皮肤替代品和动物模型可用于多种体外或体内测试。特别地但非限制性地，本发明的人皮肤替代品和动物模型在皮肤护理产品、药物代谢、对测试化合物的细胞反应、伤口愈合、光毒性、皮肤刺激、皮肤炎症、皮肤腐蚀性和细胞损伤的评价方面具有用途。通常，对于本发明的动物模型，该产品可以局部施用于人皮肤上，或可以通过口、舌下、皮下、肌内、静脉内和透皮途径施用。

本发明包括各种筛选试验。在一些实施方式中，筛选方法包括提供本发明的人皮肤替代品或动物模型和至少一种测试化合物或产品(例如，皮肤护理产品例如保湿剂、化妆品、染料或香料；这些产品可以是任何形式，包括但不限于霜剂、洗剂、液体和喷剂)，将该产品或测试化合物施用于所述人皮肤替代品或动物模型上，并分析该产品或测试化合物在人皮肤替代品或动物模型上的效果。通常，对于本发明的动物模型，该测试化合物或产品可以局部施用于人皮肤上，或可以通过口、舌下、皮下、肌内、静脉内和透皮途径施用。各种各样试验可用来确定该产品或测试化合物在人皮肤替代品或动物模型上的效果。这些试验可以涉及该化合物或产品的毒性、效力或效应。另外，可以测试该化合物或产品对生长、屏障功能或组织强度的效果。

在其他优选实施方式中，本发明的人皮肤替代品或动物模型用于筛选药物透过皮肤引入的效力。

在具体的实施方式中，本发明的人皮肤替代品或动物模型也可用于培养和研究天然形成在皮肤中的肿瘤，以及用于培养和研究影响皮肤的病原体。因此，在一些实施方式中，可以预期本发明的人皮肤替代品或动物模型用恶性细胞接种。然后这些重建的人皮肤替代品或动物模型可用于筛选化合物或其他治疗策略(例如放射治疗或断层放射治疗)对抗其自然环境中的肿瘤的效果。本发明的一些实施方式提供包括提供用目标病原体感染的重建人皮肤替代品或动物模型及至少一种测试化合物或治疗法，并用该测试化合物或治疗法治疗该皮肤替代品或动物模型的方法。

在另一种具体实施方式中，本发明的人皮肤替代品或动物模型也可用于模拟人身损伤或与皮肤损伤有关的病症。例如，本发明的人皮肤替代品和动物模型可提供用于模拟伤口、烧伤(例如火烧伤、晒伤...)、或由辐射、病原体...引起的损伤，由化学产品或环境条件引起的刺激、退行性疾病和遗传性疾病的体外和体内模型。在某些实施方式中，所关注的病症是遗传性皮肤病，例如表皮分解性水泡症、着色性干皮病、鱼鳞病、外胚层发育不良、kindler综合症及其他。通常，本发明的人皮肤替代品或动物模型可由多能干细胞生成，所述多能干细胞可以携带作为人皮肤遗传疾病病因的一个或多个突变。上述的体外和体内模型可能对于医学研究有着特别的意义，或可用于筛选治疗或预防所述伤害和病症的化合物。特别是，本发明包括使用例如高通量或高含量技术将本发明的人皮肤替代品和动物模型用于从文库，特别是组合文库中筛选化合物。通常，对于本发明的动物模型，测试化合物或产品可以局部施用于人皮肤上，或可以通过口、舌下、皮下、肌内、静脉内和透皮途径施用。

在本发明的另一方面，本发明的人皮肤替代品可用于治疗与皮肤损伤有关的病症。

因此本发明涉及治疗与皮肤损伤有关的病症的方法，该方法包括用本发明的人皮肤替代品移植需要的病人的步骤。

例如，本发明的人皮肤替代品具有在伤口愈合和烧伤治疗中的用途。用于治疗烧伤和伤口愈合的移植物的用途记载在美国专利5,693,332、5,658,331和6,039,760中。因此，本发明提供用于伤口(包括由烧伤引起的伤口)愈合的方法，包括提供本发明的人皮肤替代品和带有伤口的病人，并在使伤口愈合的条件下用人皮肤替代品移植病人。

本发明将通过以下附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不以任何方式解释为对本发明范围的限制。

附图说明

图1：角质形成细胞系的建立：hES细胞在分化的不同阶段(0-10-25-40天)的形态显微分析。最初，典型的hES细胞集落是圆的。在第10天，来自集落边缘的衍生hES细胞开始迁移并扩散到饲养层中。从第二十天起，这些细胞的体积增大、变平且获得上皮形态。在分化末尾，这些细胞变成为具有底(pavimentous)上皮形态，紧密包装的集落、粘性细胞的成形集落、表现出角质形成细胞形态的特征。

图2：角质形成细胞系的建立：在40天的分化期间定量PCR分析由hES细胞衍生的细胞。多能性基因标志物OCT4和NANOG，从第5天起迅速减少到最后在第20天变成不可检测的。角蛋白18和角蛋白8(KRT18和KRT8)，简单上皮细胞的第一特异性标志物，的转录显著提高直到第10天，随后降低并稳定在基础水平直到分化结束时。编码角蛋白5和角蛋白14(KRT5和KRT14)，表皮的分化基底层特异性的，的转录物在第10到第40天之间稳定提高。

图3：角质形成细胞系的建立：在40天的分化过程中对hES细胞的FACS分析证实未分化状态SSEA3(阶段特异性胚胎抗原)的标志物从运动开始时的约60％降低为在第40天的约1％。当角蛋白18(K18)表达的采集升高到63％时，在第10天观察到表皮系的定型。25天后，K18连续减少直到在第40天到达基础水平(9％)。从25天起，发生简单上皮细胞K8/K18的标志物和分层上皮细胞的K5/K14标志物之间的转换，以对K14阳性的59％的衍生hES细胞产生，从而证实基础增殖表皮细胞中培养物的富集。

图4：由hES细胞衍生的同源和纯的角质形成细胞群的表征：随后的培养后，人原代成体角质形成细胞(HK)和由hES细胞衍生的角质形成细胞(K-hES细胞)的形态显微分析。在40天的分化后，由hES细胞衍生的角质形成细胞的随后培养在接种在丝裂霉素处理的3T3饲养层细胞上的FAD培养基中在不存在BMP4和抗坏血酸的情况下进行。在这些条件下，由hES细胞衍生的角质形成细胞(K-hES细胞)显示和成体原代人角质形成细胞(HK)相同的集落形态。K-hES细胞形成紧密包装的、粘性细胞的集落，表现角质形成细胞的形态特征。

图5：由hES细胞衍生的同源和纯的角质形成细胞群的表征：HK和K-hES细胞的FACS分析显示K18损失和K-hES细胞的同源细胞群，其中超过95％的细胞表达K5和K14。

图6：由hES细胞衍生的同源和纯的角质形成细胞群的表征：进行具有角质形成细胞粘附的OCT4/NANOG、KRT8/KRT18、KRT5/KRT14、整联蛋白α6和β4(ITGA6/ITGB4)、层粘连蛋白-5和胶原蛋白VII(LAMB3/Col7A1)基因标志物的K-hES细胞和HK定量PCR分析。基因表达水平与具有基底角质形成细胞特征的所有这些测试基因类似。

图7：由hES细胞衍生的功能性角质形成细胞的建立。HK和K-hES细胞的集落形成分析。人角质形成细胞的体外生长能力可以通过生长的粘附克隆的数目估计。K-hES细胞的集落形成分析显示这些细胞与HK相比，克隆生成能力提高了40％。

图8：由hES细胞衍生的功能性角质形成细胞的建立。HK和K-hES细胞的器官型上皮细胞培养。气液分化10天后苏木精/曙红组织学染色。表皮结构表现为由良好形成的具有底细胞形状的基底层和上基底层组成，包括含有透明角质颗粒的颗粒层和角质层，视为死的鳞状无核细胞的悬浮层。

图9：器官型HK和K-hESC表皮的PCR阵列。在从衍生自器官型表皮的HK和K-hES细胞提取的cDNA上测试一大组表皮基因。使用国产角质形成细胞-集中引物的定量PCR阵列收集数据，并在阵列辅助软件上进行热图分析。该两种器官型表皮显示出非常相似的表达模式。

图12：异种皮肤移植到免疫缺陷小鼠后长期的体内人表皮再生。a.用K-hESC移植的人造皮肤植入物的苏木精-曙红染色。比例尺是50μm。b.使用mAb SY-5针对用K-hESC移植的人造皮肤植入物上的人外皮蛋白的免疫过氧化酶染色适当地位于刺层和颗粒层中。由于抗鼠二级抗体，注意到可以观察到真皮背景。比例尺是50μm。

图13：异种皮肤移植到4个免疫缺陷小鼠后的长期体内人表皮再生。用K-hESC移植的人造皮肤植入物的苏木精-曙红染色。比例尺是100μm。

图10：半限定的无血清培养基中K-hES细胞的同源特征：培养在半限定的无血清培养基和含有饲养层细胞的FAD培养基中的K-hES细胞的定量PCR分析显示角蛋白5和角蛋白14(KRT5和KRT14)转录物的相似表达。

图11：K-hESC直到九代的稳定表型：K-hES细胞在连续传代直到9代的定量PCR分析显示与角质形成细胞表型有关的基因的稳定表达，包括KRT5、KRT14、ITGA6和ITGB4。

图14：角质形成细胞系的建立：定量PCR分析：K-hES细胞和HK的PCR分析显示K19、K3和K12基因的不同表达水平。

图15：MHC I类(HLA-ABC)蛋白和MHC II类(HLA-DR)蛋白在hESC、K-hESC和HK中的表达：MHC I类(HLA-ABC)和MHC II类(HLA-DR)在hESC、HK和由H9衍生的K-hESC中的表达的典型FACS分析。

图16：使用诱导的多能干细胞的角质形成细胞系的建立

(A)诱导的多能干细胞(iPS)和衍生的iPS在分化40天时的形态学分析

(B)衍生的诱导多能干细胞(iPS)在分化40天的过程中OCT4/NANOG、KRT8/KRT18、KRT5/KRT14的定量PCR分析。

图17：由iPS衍生的角质形成细胞的表征。

(A)由iPS和hESC衍生的角质形成细胞(K-iPS和K-hESC)和随后培养后的人原代角质形成细胞(HK)的显微分析。

(B)K-iPS、K-hESC和HK中OCT4/NANOG、KRT8/KRT18、KRT5/KRT14和P63的定量PCR分析。

(C)K-iPS、K-hESC和HK中的角蛋白5和角蛋白14的免疫荧光分析。

具体实施方式

实施例1：由hES制备角质形成细胞群和人皮肤替代品的方法

材料和方法

hES细胞的维持培养

hESC(SA-01和H9)在37℃，5％CO₂下在小鼠成纤维细胞的饲养层上生长，该小鼠成纤维细胞为在补充有20％(体积/体积)Knockout血清替代品(KSR，Invitrogen)、1mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)、4ng/ml重组人bFGF(PeProTech)和0.1mM的2-巯基乙醇的DMEM/F12(Sigma)中的STO(用10mg/ml丝裂霉素C灭活并以30000/cm²接种)。为传代，切割hESC集落，且每5天进行传代。

角质形成细胞中hES细胞的衍生。

为衍生，将集落在FAD培养基中接种在丝裂霉素C-处理的3T3成纤维细胞上，所述培养基由2/3DMEM、1/3 HAM:F12和10％的胎牛血清(FCII，Hyclone)组成，补充有5μg/ml胰岛素、0.5μg/ml氢化可的松、10^-10M霍乱毒素、1.37ng/ml T3、24μg/ml腺嘌呤和10ng/ml重组人EGF。当加入人重组BMP-4(R&D Systems Europe，UK)和0.3mM抗坏血酸(Sigma)时，进行外胚层分化的诱导。细胞在相同培养基中生长直到分离上皮细胞集落。然后将细胞在不含BMP4和抗坏血酸的FAD培养基中接种在相同饲养层中。作为对照，原代人角质形成细胞(HK)在FAD培养基中在丝裂霉素C处理的3T3成纤维细胞上培养。

为在半限定无血清培养基中培养，将HK和k-hES细胞接种在KGM-2培养基(Lonza)中BioCoat胶原蛋白I塑料(BD Biosciences)上。

定量PCR。

根据厂商的方案，使用RNeasy微型提取试剂盒(Qiagen)从hES细胞、HK和K-hES细胞中分离总RNA。进行柱上脱氧核糖核酸酶I的消化，以避免基因组DNA扩增。使用微量核酸蛋白检测(Nanodrop)技术检测RNA水平和质量。使用Superscript III反转录试剂盒(Invitrogen)，总共500ng的RNA用于反转录。为定量mRNA表达，使用LightCycler 480系统(Roche diagnostics)和SYBR Green PCR Master Mix(Roche diagnostics)根据厂商的指示进行实时RT-PCR分析。基因表达的定量基于DeltaCt方法并基于18s表达标准化。进行熔融曲线和电泳分析以控制PCR产物特异性并排除非特异性扩增。

FACS分析

在室温下使用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)使细胞从培养平板上分离并固定在2％仲甲醛中15分钟。PBS洗涤后，用0.1％皂甙(Sigma)渗透细胞。以1∶100稀释的初级抗体在室温下在含0.1％FCS的PBS中孵育一小时。使用同型特异性的或非初级抗体制备对照样品。在室温下在1小时内添加种类特异性二级抗体，并使用CellQuest软件(BD Biosciences)在FACScalibur流氏血细胞计数器上分析染色的细胞。

免疫细胞化学

在室温下将细胞固定在4％仲甲醛中15分钟，然后在补充有0.4％Triton X-100和5％BSA(Sigma)的PBS中渗透和封闭。初级抗体在4℃下在封闭缓冲液中孵育过夜。小鼠抗-K14、兔抗-K14、小鼠抗-K5从Novacastra购得，小鼠抗-ColVII、小鼠抗-整联蛋白α6和小鼠抗-层粘连蛋白5从Santa-Cruz Biotechnology购得，且小鼠抗-整联蛋白β4从BDbiosciences购得。在室温下用种类特异性荧光团-偶联的二级抗体(Invitrogen)染色细胞1小时，并用DAPI染色细胞核。使用Axiovision图像软件在Zeiss Z1显微镜上获得免疫荧光图像。

集落形成试验。

原代角质形成细胞和K-hES细胞被胰蛋白酶化并在10-cm平板中以14细胞/cm²接种在FAD培养基中丝裂霉素C处理的3T3成纤维细胞饲养层上。细胞培养2星期，然后用70％乙醇固定并用Blue-RAL555(Sigma)染色。用自来水洗涤后，干燥平板并计数集落。各实验重复三次。

器官型培养。

如其它文献所详述的产生人皮肤替代品(Poumay Y等人，2004)。在聚碳酸酯培养插入物(NUNC)上进行角质形成细胞培养。这些细胞在补充有1.5mM CaCl₂和50μg/ml抗坏血酸的Epilife培养基中培养11天。通过去除培养基使细胞暴露于气-液界面10天。

移植到免疫缺陷小鼠上。

使用移植有人成纤维细胞的纤维蛋白基质产生生物工程化的皮肤等价物。将K-hESC接种在纤维蛋白基质上，浸没生长达到汇合，然后如所述的(Del Rio等人2002)移植在6周龄雌性nu/nu小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)的背上。移植后10-12周收获植入物，且组织样本在10％缓冲福尔马林中固定以用于石蜡包埋。

基于阵列的比较基因组杂交

使用Integragen Chip基因组范围的5245BAC集落的BAC阵列(526kb中间间隔)进行基于阵列的比较基因组杂交(a-CGH)分析。

结果：

将hES细胞(SA-01或H9)在补充有BMP4(0.5nM)和抗坏血酸(0.3mM)的FAD培养基中接种于预先用丝裂霉素C处理的3T3饲养层细胞中，并在不同的时间点10、25和40天收获。

在分化的动态过程中，我们通过显微镜观察到上皮形态的逐渐增加。最初，未分化的hES细胞在培养中形成单细胞层集落。在第10天，衍生的hES细胞从集落边缘开始迁移并扩散到饲养层中。从第二十天起，这些细胞体积增大，变平且获得上皮形态。在分化结束时，这些细胞变成具有底上皮形态，紧密包装的粘性细胞的成形集落，角质形成细胞形态的特征(图1)。hES细胞分化的分子表征通过定量PCR和FACS分析在整个动态过程中进行。时间过程q-PCR分析显示多能性基因标志物OCT4和NANOG(Amit M.等人，2000)从第5天迅速减少到最后在第20天不可检测(图2)。特别是，FACS分析证实未分化状态SSEA3(阶段特异性胚胎抗原)的标记物从动态过程开始时的约60％降低为在40天的约1％(图3)。

表皮体内发育的特征在于胚胎发育过程中结构分子的时间表达模式(Mack JA.等人，2005)。所述表皮由产生表达角蛋白8和角蛋白18(K8和K18)的单层外胚层细胞的外胚层衍生。使用定量Q-PCR，编码沿着角质形成细胞系的较早期标志物，角蛋白18和8(KRT8/KRT18)的基因的表达在培养的第10天到达峰值，然后在随后几周内逐渐降低。编码角蛋白5和角蛋白14(KRT5/KRT14)的基因的表达(其是整个生存期间表皮的增殖基底层特异性的)从第10天起逐渐增加(图1B)。FACS分析证实K18的短时间表达，表达选择在10到25天之间(63％到59％)，然后降低，直到第40天达到基础水平(9％)。在40天分化的末尾，我们证实角蛋白14中培养基的富集(59％)(图3)。最后，hES细胞衍生为角质形成细胞与表皮体内发育相当(Byrne C.等人，1994)。总而言之，所得数据清楚地表明，该分化过程的方案在体外重现了表皮发育的所有步骤，给予更好地理解对40天的分化中负责K8/K18急剧转变成K5/K14的分子事件的可能。我们认为诱导周期结束了，因此通过将BMP4和抗坏血酸从培养基中去除来停止诱导。在FAD培养基中在丝裂霉素C处理的3T3饲养层细胞上传代后，显示出典型的底上皮形态的细胞自发形成生长集落；我们将他们命名为“由人胚胎干细胞衍生的角质形成细胞”(K-hES细胞)(图4)。四代后的FACS分析显示不再有角蛋白18，以及相当同源的细胞群，其中如在HK中一样，超过95％的细胞表达角蛋白5和角蛋白14(图5)。K-hES细胞和HK的比较显示出相似的表型。通过Q-PCR评估的基因表达水平对于所有测试基因(基底角质形成细胞的特征)相似，包括编码角蛋白14、角蛋白5、整联蛋白α6和β4、胶原蛋白VII和层粘连蛋白-5的那些(图6)。角蛋白5和角蛋白14的定位由和HK中观察到的相同的K-hES细胞的细胞小室中的免疫荧光测定。如所期望的那样，观察到Oct4的任何染色和一些剩余的K18染色。不存在角蛋白10(上基底层的更加分化的角质形成细胞的标志物)，这证实了基作为底角质形成细胞的K-hESC的表型特征。这些细胞的粘连性能通过整联蛋白α6和β4定位在膜上和层粘连蛋白-5和胶原蛋白VII定位在细胞外基质中来表明。

在我们的条件下得到的K-hES细胞的表征表明细胞和培养中的HK几乎相同。另外，hES细胞的衍生提供了一种生成具有相同遗传背景的基本上纯的同源角质形成细胞群的有效方法。

然而，除了人成体原代角质形成细胞的典型标志物之外，K-hES细胞表达显著水平的角蛋白19(皮肤干细胞体内和体外的标志物，其仅在一些滤泡间上皮的角质形成细胞和毛囊的角质形成细胞中表达)及角蛋白3和角蛋白12(角膜细胞标志物)(见图14)。

用于体外形成角质形成细胞的通常可接受的标准是它们在细胞培养体系中形成集落的能力。人角质形成细胞在体外的生长潜能可以由它们能产生的克隆数目估计(Barrandon Y.等人，1985)。有意思的是，K-hES细胞的集落形成分析显示克隆形成潜能增加至少40％(图7)。

为测试其生理关联性，评估K-hES细胞产生多分层表皮的能力(图8)。使用K-hES细胞在体外产生重建的表皮。气-液分化10天后，K-hES细胞的器官型培养的低温切片(cryosection)组织学染色显示分层表皮的重组(Poumay Y.等人，2004)。表皮结构表明由良好形成的基底层与底细胞形状和上基底层组成，包括含有透明角质颗粒的颗粒层和角质层，视为死的鳞状无核细胞的悬浮层。K-hES细胞衍生表皮的正常形态组织也反映在分化标志物的常规表达和定位中，如通过间接免疫荧光染色所分析的。如期望的那样，在重建表皮的基底小室中观察到K14染色，但在其他上基底层中为阴性的。K10存在于整个分化层中，正好在K14阳性单基底层上面。最后，在表皮的最上面的层中唯一地检测到抗角蛋白微丝聚集蛋白和外皮蛋白，角质形成细胞分化的晚期标记物。晚标记物存在于预期位点表明我们的器官型K-hES细胞培养物遵循朝向分化的生理学途径。

为评估是否能在所使用培养条件下发现基底膜区域，在重建皮肤中检查粘性分子的表达。由基底细胞膜的整联蛋白α6和β4的良好定位证实这些细胞的粘连能力。另外，观察到层粘连蛋白-5和胶原蛋白VII，使得表皮和真皮之间粘连的细胞外基质蛋白，的分泌。

而且，使用一组表皮基因的PCR阵列表明，HK和K-hES细胞器官型表皮显示出很相似的表达模式(图9)。

作为最后的说明，通过严格的体内试验评估K-hESC产生自我更新的上皮细胞的能力。用K-hESC接种含成体人成纤维细胞的纤维蛋白基质以体外获得汇合的表皮层。然后通过原位移植将这些器官型培养移植到免疫缺陷nu/nu小鼠的背部区域上(Del Rio M.等人，2002；Larcher F.等人，2007)。10-12周后，来自5只鼠中的4只的K-hESC衍生表皮显示形态上正常的多分层结构，与成熟的原始人皮肤一致(图12a和图13)。对于人外皮蛋白的免疫反应性适当地位于刺层和颗粒层中(由于二级抗体的真皮背景)(图12b)。这一长期的体内再生特征清楚地显示K-hESC具有表皮干细胞的功能性能力。

为临床应用，必须使用不含动物或人产物的体外培养方案。用于促进角质形成细胞祖先的增殖或终末分化的理想培养基应该是化学限定的，且应当是无血清的或合成的血清替代物。有意思的是，我们在KGM2(一种无饲养层的无血清培养基)中培养K-hES细胞。在KGM2中生长的K-hESC的免疫荧光分析显示角蛋白5、角蛋白14和整联蛋白α-6和β-4的同源表达。在半限定的无血清培养基以及在具有饲养层细胞的FAD培养基中维持的K-hES细胞的定量PCR分析显示角蛋白5和角蛋白14的转录产物的相似表达(图10)。

目前研究的主要结果是表明，由hESC衍生的细胞能重演体外和体内成体人角质形成细胞的所有形态和功能属性。这通过使用基于与支持外胚层分化的细胞共培养的方案处理未分化ES细胞获得，优选结合能刺激表皮诱导并抑制滋养层和中胚层诱导的长期和低浓度BMP4处理。添加抗坏血酸以在不存在其他作者使用的视黄酸的情况下刺激角质形成细胞的终末分化(Bamberger C.等人，2002)。我们的方案的成功结果也可以源于以下事实：连续地应用处理，直到角质形成细胞完全分化，这要求培养40天。在该阶段，该培养物富含非常接近成体滤泡间角质形成细胞的细胞。由于这些细胞可以保持直到9代(图11)，任意冷冻和解冻，它们可以作为大规模生产人角质形成细胞和多分层表皮的实用的中间步骤。

通过FACS分析K-hESC的免疫原性。与成体基底角质形成细胞不同，K-hESC仅显示极低水平的HLA-ABC抗原，并且没有HLA-DR(图15)。K-hESC表达很少的主要组织相容性复合体抗原(如果有的话)，这证实了皮肤替代品的低免疫原性。

实施例2：由iPS制备角质形成细胞群和人皮肤替代品的方法

用人的诱导多能干细胞(iPS)进行如实施例1描写的相同分化方案。简而言之，将iPS接种在FAD培养基中丝裂霉素C-处理的3T3成纤维细胞上，所述FAD培养基由2/3 DMEM、1/3 HAM:F12和10％的胎牛血清(FCII，Hyclone)组成，补充有5μg/ml胰岛素、0.5μg/ml氢化可的松、10^-10M霍乱毒素、1.37ng/ml三碘甲状腺原氨酸、24μg/ml腺嘌呤和10ng/ml重组人EGF。当加入0.5nM人重组BMP-4(R&D Systems Europe，UK)和0.3mM抗坏血酸(Sigma)时，进行外胚层分化的诱导。细胞在相同培养基中生长直到分离上皮细胞的克隆。然后将细胞接种在不含BMP4和抗坏血酸的FAD培养基中的相同饲养层中。作为对照，在FAD培养基中的丝裂霉素C处理的3T3成纤维细胞上培养原代人角质形成细胞(HK)。

如图16和17所示，本发明人证明，分离的基本上纯的同源人角质形成细胞群也可以由诱导的多能干细胞(K-iPS)衍生。

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Claims

1.用于获得由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞群的体外方法，包括如下步骤：在刺激表皮诱导的物质和刺激角质形成细胞的终末分化的物质存在下共培养人多能干细胞和支持外胚层分化的细胞。

2.用于获得由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞群的体外方法，所述方法包括如下步骤：在补充有BMP-4和抗坏血酸的角质形成细胞培养基的存在下，在涂有一层饲养层成纤维细胞的细胞培养表面上培养人多能干细胞。

3.根据权利要求1或2所述的体外方法，其中所述人多能干细胞是胚胎干细胞(hES细胞)或人的诱导多能干细胞(人iPS细胞)。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其还包括以下步骤：在不含抗坏血酸和BMP-4的角质形成细胞培养基的存在下，在涂有真皮成纤维细胞层的细胞培养表面上培养由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞。

5.能够通过权利要求4所述方法获得的由人多能干细胞衍生的分离的基本上纯的同源人角质形成细胞群。

6.药物组合物，含有权利要求5所述的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群和任选的药学可接受的载体或赋形剂。

7.权利要求5所述的由人多能干细胞衍生的分离的基本上纯的同源人角质形成细胞群，其用于治疗与皮肤损伤有关的病症。

8.制备人皮肤替代品的方法，包括以下步骤：提供权利要求5所述的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群的器官型培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其中权利要求5所述的基本上纯的同源人角质形成细胞群预先接种在移植有人真皮成纤维细胞的细胞培养基质上。

10.能够由权利要求8或9的方法获得的人皮肤替代品。

11.权利要求10所述的人皮肤替代品在筛选化合物中的用途。

12.权利要求10所述的人皮肤替代品在培养肿瘤和病理试剂中的用途。

13.权利要求10所述的人皮肤替代品，其用于治疗与皮肤损伤有关的病症。

14.权利要求10所述的人皮肤替代品，其用于伤口愈合和烧伤治疗。