CN104789521A

CN104789521A - 一种晶状体上皮干细胞的分离培养方法

Info

Publication number: CN104789521A
Application number: CN201510032551.0A
Authority: CN
Inventors: 侯睿; 蔡惠民
Original assignee: GUANGZHOU KANGRUI BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU KANGRUI BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2014-01-22
Filing date: 2015-01-22
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2035-01-22
Also published as: CN104789521B

Abstract

本发明公开了一种晶状体上皮干细胞的分离培养方法，它包括以下步骤：(1)取晶状体前囊膜，剪成碎片，消化，将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、培养板或培养皿中；(2)加入添加有含有15～25％FBS、50～150μg/L人表皮生长因子(FGF)、5-10mg/L胰岛素、5-10mg/L氢化可的松、5-10mg/L霍乱弧菌毒素、0.01-0.05mg/L3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸、1-5mg/L腺嘌呤、5～10mg/L甘氨酸、6～12mg/L丙氨酸、10～16mg/L天冬酰胺、10～16mg/L天冬氨酸、12～18mg/L谷氨酸、8～15mg/L脯氨酸、7～14mg/L丝氨酸的MEM培养液，放入37℃孵箱中培养，2-3天形成克隆，10-14天可形成单层活性的晶体干细胞细胞。本发明还公开了一种晶状体上皮干细胞的分离培养液。本发明方法可以分离得到原代晶状体上皮干细胞，干细胞的活性高，本发明方法简便、易操作，应用前景良好。

Description

一种晶状体上皮干细胞的分离培养方法

技术领域

本发明涉及一种晶状体上皮干细胞的分离培养方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

晶状体是一个双凸透镜状的透明组织，由悬韧带悬挂在虹膜后方、玻璃体正前方，是眼内重要的屈光间质。人类晶状体前表面的曲率半径约10mm，后表面的曲率半径约6mm。晶状体表面包裹了一层无细胞的透明弹性薄膜，分布在晶状体前表面的叫做前囊膜，由位于其下的晶状体上皮细胞分泌的胶原纤维形成，晶状体上皮附着在前囊膜上。晶状体上皮细胞呈单层柱状，附着在晶状体前囊膜上，其可分为中央区(central region)和两侧对称的赤道区(equatorial region)。中央区上皮细胞(central anterior epithelium)单层排列在前囊膜下，代谢缓慢；赤道区上皮细胞(equatorial epithelial)分裂活跃，通过分裂产生子细胞逐步向晶状体内部移动并分化成为晶状体纤维。晶状体赤道部上皮细胞在整个生命活动中分裂活跃，其不断分裂产生子细胞的现象和干细胞的自我更新特性类似。

王潆，“小鼠晶状体干细胞的初步研究”，第四军医大学2013年硕士论文，利用干细胞的特性，通过BrdU标记滞留细胞实验，检测到晶状体上皮中存在表达干细胞标志物SOX2的细胞，确定晶状体上皮中存在干细胞。但是未分离得到晶状体上皮干细胞。

发明内容

本发明公开了一种晶状体上皮干细胞的分离培养方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(1)取晶状体前囊膜及附着的上皮，剪成碎片，消化，将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、培养板或培养皿中；

(2)加入添加有15～25％FBS、50～150μg/L FGF、5-10mg/L胰岛素、5-10mg/L氢化可的松、5-10mg/L霍乱弧菌毒素、0.01-0.05mg/L3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸、1-5mg/L腺嘌呤、5～10mg/L甘氨酸、6～12mg/L丙氨酸、10～16mg/L天冬酰胺、10～16mg/L天冬氨酸、12～18mg/L谷氨酸、8～15mg/L脯氨酸、7～14mg/L丝氨酸的MEM培养液，放入37℃孵箱中培养，2-3天形成克隆，10-14天可形成单层活性的晶体干细胞细胞。

所述消化的方法是：将碎片加0.2％的胶原酶IV溶液中，消化2h，去除胶原酶，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，混匀，过滤，即得细胞。

其中，步骤(1)中，所述基质为基质胶、明胶、胶原、多聚赖氨酸和/或层粘连蛋白中的一种或两种以上的组合。

进一步地，培养瓶、培养板或培养皿包被基质胶的方法为：加入含1％～3％基质胶的DMEM/F12培养液或无菌PBS溶液，完全覆盖底部即可，在37℃孵箱中孵育0.5～2小时，孵育完后吸弃培养液，用无菌PBS清洗3～5次。

更进一步地，基质胶的浓度为2％；孵育时间为1小时。

其中，步骤(2)中，FBS浓度为20％，FGF浓度为100μg/L，胰岛素浓度为10mg/L，氢化可的松浓度为10mg/L，霍乱弧菌毒素浓度为10mg/L，3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸浓度为0.01mg/L，腺嘌呤浓度为5mg/L，甘氨酸浓度为7.5mg/L、丙氨酸浓度为8.9mg/L、天冬酰胺浓度为13.2mg/L、天冬氨酸浓度为13.3mg/L、谷氨酸浓度为14.7mg/L、脯氨酸浓度为11.5mg/L、丝氨酸浓度为10.5mg/L。

其中，步骤(2)中，培养液中还含有抗生素。

进一步地，所述的抗生素为50～100U/mL的青霉素和50～100μg/mL的链霉素。

本发明还提供了晶状体上皮干细胞的分离培养液，它是添加有15～25％FBS、50～150μg/L FGF、5-10mg/L胰岛素、5-10mg/L氢化可的松、5-10mg/L霍乱弧菌毒素、0.01-0.05mg/L3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸、1-5mg/L腺嘌呤、5～10mg/L甘氨酸、6～12mg/L丙氨酸、10～16mg/L天冬酰胺、10～16mg/L天冬氨酸、12～18mg/L谷氨酸、8～15mg/L脯氨酸、7～14mg/L丝氨酸的MEM培养液。

其中，FBS浓度为20％，FGF浓度为100μg/L，胰岛素浓度为10mg/L，氢化可的松浓度为10mg/L，霍乱弧菌毒素浓度为10mg/L，3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸浓度为0.01mg/L，腺嘌呤浓度为5mg/L，甘氨酸浓度为7.5mg/L、丙氨酸浓度为8.9mg/L、天冬酰胺浓度为13.2mg/L、天冬氨酸浓度为13.3mg/L、谷氨酸浓度为14.7mg/L、脯氨酸浓度为11.5mg/L、丝氨酸浓度为10.5mg/L。

所述培养液中还含有抗生素。其中，所述的抗生素为50～100U/mL的青霉素和50～100μg/mL的链霉素。但人眼晶状体囊膜小，用消化法难以获得大量细胞，而直接用组织块培养如长时间不能贴壁，亦将导致细胞死亡，因此晶状体干细胞原代培养较难获得成功。

本发明通过对培养液的成分及用量的特定选择和配合，在本发明特定方法下，分离培养得到了原代晶状体上皮干细胞。

本发明方法可以分离得到原代晶状体上皮干细胞，干细胞的活性高，本发明方法简便、易操作，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

说明书附图

图1人晶状体上皮干细胞呈现其鹅卵石状细胞形状特征(100x)；

图2人晶状体上皮干细胞的免疫荧光组化染色A.Pax6(红色)，B.Sox2(红色)；

图3兔晶状体上皮干细胞：A：兔晶状体上皮干细胞相差显微照片(40x)；B-D：共聚焦显微观察干细胞标记物免疫荧光染色：增殖标记Ki67(B)；晶状体干细胞标记物Sox2(C)、Pax6(D)；E：成熟的晶体纤维细胞；F:兔晶状体上皮干细胞和成熟的晶体纤维细胞的基因表达比较。

具体实施方式

PBS 1X(Life Technologies,cat.no.14190-144)

·Penicillin Streptomycin(Life Technologies,cat.no.15140-122)

·Collagenase IV(Life Technologies,cat.no.17104019)

·0.25％Trypsin-EDTA 1X(Life Technologies,cat.no.25200-056)

·Matrigel Matrix Growth Factor Reduced(Corning,cat.no.354230)

·Sterile Cell Culture Grade Water(Corning,cat.no.25-055-CV)

·MEM 1X(Life Technologies,cat.no.11095-072)

Insulin from bovine pancreas(Sigma,cat.no.I5500-100MG)

·Hydrocortisone Chroma(VWR,cat.no.386698-25MG)

·Cholera Toxin Vibrio(Millipore,cat.no.227036-1MG)

·3,3′,5-Triiodo-L-Thyronine(Sigma,cat.no.T25752)

·Adenine(EMD Millipore,cat.no.1152-25GM)

实施例1人眼晶状体上皮干细胞的分离培养与鉴定

1、方法

1.1分离培养

(1)六孔板在使用前先用含2％Matrigel(Matrigel是基质胶)的DMEM/F12培养液包被1小时，吸弃培养液，无菌PBS清洗5次；

(2)用含青霉素/链霉素的PBS冲洗眼组织3遍，在超净台中环形剪除角膜，放射状剪开并撕除虹膜，充分暴露晶状体赤道部，用眼科镊尽量靠近赤道部撕下晶状体前囊膜及附着的上皮，将其剪成1×1mm²的碎片，碎片加入放有5ml 0.2％的胶原酶IV的离心管中，获得细胞团。再将离心管放入37℃培养箱中轻轻摇动2小时进行消化。2小时后，离心细胞，在1000rpm离心5分钟，在室温下真空抽吸的胶原酶。添加0.25％胰蛋白酶-EDTA 5毫升，并通过100um的细胞过滤网。滤过细胞铺于包被有2％Matrigel的六孔板中；

(3)加入添加有20％FBS、100μg/L FGF、10mg/L胰岛素、10mg/L氢化可的松10mg/L霍乱弧菌毒素、0.01mg/L3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸、5mg/L腺嘌呤、7.5mg/L甘氨酸、8.9mg/L丙氨酸、13.2mg/L天冬酰胺、13.3mg/L天冬氨酸、14.7mg/L谷氨酸、11.5mg/L脯氨酸、10.5mg/L丝氨酸、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的MEM培养液(Gibco,USA)中，放入37℃孵箱中培养，2-3天形成克隆，10-14天可形成单层活性的晶体干细胞细胞。

1.2鉴定：对分离培养得到的细胞进行鉴定：包括形态学(光学显微镜下)观察和免疫荧光观察：

(1)形态学观察

在倒置相差显微镜(OLYMPUS IX81)下观察细胞的形态结构。

(2)免疫荧光和激光共聚焦显微镜观察

细胞制备细胞爬片，长至70％～80％汇合时取出，用4％多聚甲醛固定20分钟，然后用含0.3％Triton X-100的PBS透化10分钟，并用含有5％牛血清白蛋白的PBS溶液中止反应，然后在4℃下过夜孵育初级抗体，在PBS中洗涤3次后，细胞与二次抗体在室温下孵育1小时。细胞核经DAPI染色。

实验中使用的抗体如下：山羊抗SOX2多克隆抗体(Santa Cruz公司)，兔抗PAX6多克隆抗体(PRB-278P，Covance公司)，二次抗体为Alexa Fluor488或568标记的抗小鼠或兔免疫球蛋白(IgG)(Invitrogen公司)，使用的稀释度为1:500。用奥林巴斯FV1000共聚焦显微镜观察、拍照。

2.实验结果

(1)细胞形态：

如图1所示，倒置相差显微镜下，贴壁细胞呈鹅卵石状，即典型的上皮细胞形态。

(2)免疫荧光和激光共聚焦显微镜观察

如图2所示，本发明分离得到的细胞表达上皮干细胞的标志物Pax6和Sox2。

实验结果说明，本发明方法可以分离培养得到的晶状体上皮干细胞。

实施例2兔眼晶状体上皮干细胞的分离培养与鉴定

1.细胞分离培养

所有的动物研究完全按照眼科和视觉研究用动物ARVO声明及相关批准执行。从新西兰白兔取出眼球，含有抗生素的PBS冲洗3次。角膜和虹膜被移除后，在晶状体囊后切一个小切口，取下晶状体前囊膜及附着的上皮并切成1×1mm²，碎片放于离心管中先放有5ml 0.2％的胶原酶IV获得细胞团。再将离心管放入37℃培养箱中，轻轻摇动2小时进行消化。2小时后，离心细胞，在1000rpm离心5分钟，在室温下真空抽吸的胶原酶。添加0.25％胰蛋白酶-EDTA 5毫升，并通过100um的细胞过滤网。滤过细胞培养在补充有20％胎牛血清，100μg/L FGF、5-10mg/L胰岛素、5-10mg/L氢化可的松、5-10mg/L霍乱弧菌毒素、0.01-0.05mg/L3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸、1-5mg/L腺嘌呤、7.5mg/L甘氨酸、8.9mg/L丙氨酸、13.2mg/L天冬酰胺、13.3mg/L天冬氨酸、14.7mg/L谷氨酸、11.5mg/L脯氨酸、10.5mg/L丝氨酸和50μg/L庆大霉素的最低必需培养基(最低必需培养基即MEM培养液)中培养，并在2％Matrigel铺板后的六孔板中培养，放入37℃孵箱中培养，2-3天形成克隆，10-14天可形成单层活性的晶体干细胞细胞。

2、检测

2.1免疫荧光和激光共聚焦显微镜

用4％多聚甲醛固定细胞20分钟，然后用含0.3％Triton X-100的PBS透化10分钟，并用含5％牛血清白蛋白的PBS溶液中止反应，然后在4℃下过夜温育初级抗体，在PBS中洗涤3次后，细胞与二次抗体在室温下孵育1小时。细胞核都经DAPI染色。

实验中使用的抗体如下：山羊抗Sox2多克隆抗体(Santa Cruz公司)，兔抗Pax6多克隆抗体(PRB-278P，Covance公司)，鼠抗Ki67单克隆抗体(550609，BD公司)，二次抗体为Alexa Fluor 488或568标记的抗小鼠或兔免疫球蛋白(IgG)(Invitrogen公司)，使用的稀释度为1:500。用奥林巴斯FV1000共聚焦显微镜观察纪录。

2.2与成熟的晶体纤维细胞的比较(实时荧光定量PCR)

为了进一步证实培养的晶状体上皮细胞的干细胞状态，对本发明分离培养的细胞与成年兔晶状体纤维细胞(无囊膜)之间基因的表达水平进行了检测。

使用RNeasy试剂盒(Qiagen公司)提取RNA，并进行上柱，DNA酶消化。按照制造商的说明书(Invitrogen公司)使用Superscript III逆转录酶试剂盒，合成cDNA。定量PCR使用7500实时定量PCR系统(AppliedBiosystems，Inc.)。基因特异性引物(见表1)和SYBR Green PCR扩增试剂预混，40次循环扩增。每个测试重复3次，并用内源性GAPDH水平归一化数据。使用ΔΔCT法(CT值<30)计算相对表达倍数变化。

表1实时定量PCR引物

Gene	Forward Primer	Reverse Primer
			c-Maf	GCCCAACCTGGTGGCTGTGTGCCT	AGACACCAGGTCCGGGCTGGGGTGC
CP49	GCTTGGAGCAAGGCTCCTGCTT	ACGTGAAGGTGCTGTACACAC
			E-cadherin	GACTTCGAGGCGAAGCAGCAGT	ATCTTCTGCTGCATGAATGTGTC
filensin	GACCCTGGAACAAGCTAT	ATCCGATGGTACCGGTCCAGC
			GAPDH	GCGAGATCCCGCCAACATCAAGT	AGGATGCGTTGCTGACAATC
Pax6	GTATTCTTGCTTCAGGTAGAT	GAGGCTCAAATGCGACTTCAGCT
			Prox1	GCTTTGCTTTTTTCAAGTGATT	AGGCTTCACCACGTCCACCTTCCGC
Sox2	GAACGCCTTCATGGTGTGGT	AGCGTCTTGGTTTTCCGC
			ɑA-crystallin	GCCCGAGGACCTCACCGTGAAGGT	ACGTTGGAAGGCAGGCGGTAGC
βB2-crystallin	GCGAGTACCCTCGCTGGGACT	ACGACACCTTCTCCTGGTAGC

3、结果：

本发明分离培养的细胞呈现典型的鹅卵石状上皮细胞形态(图3A)，这些细胞传代可以超过12次，并且细胞高度阳性表达上皮干细胞的标志物，包括转录因子Sox2(图3C)、Pax6(图3D)以及细胞周期标记物Ki67(图3B)。

对本发明分离培养的细胞与成年兔晶状体纤维细胞(无囊膜)之间基因的表达水平检测结果如图3F所示：

成年兔晶状体纤维细胞相比，上皮干细胞标记物Sox2、Pax6、C-Maf和E-cadherin在本发明分离培养的细胞中高表达，Sox2为前者的3.3倍，Pax6为前者的10.0倍，C-Maf为前者的4.2倍，E-cadherin为前者的66.0倍，所有P<0.05；而成年兔晶状体纤维细胞中则高表达晶状体纤维标记物，如Prox1为本发明分离培养的细胞的11.7倍，CP49为1789.9倍，Fliensin为7024.7倍，ɑA-crystallin为1057.9倍，βB2-crystallin为4826.5倍，所有P<0.05(图3F)。

免疫染色和基因表达水平结果说明，本发明分离培养的细胞具有上皮细胞形态，其分化程度低，表达干细胞标记物，证实名本发明分离得到的细胞为晶状体上皮干细胞。

综上，本发明方法简便、易操作，分离培养的晶状体上皮干细胞活性高，应用前景良好。

Claims

1.一种晶状体上皮干细胞的分离培养方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(2)加入添加有15～25％FBS、50～150μg/L FGF、5-10mg/L胰岛素、5-10mg/L氢化可的松、5-10mg/L霍乱弧菌毒素、0.01-0.05mg/L3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸、1-5mg/L腺嘌呤、5～10mg/L甘氨酸、6～12mg/L丙氨酸、10～16mg/L天冬酰胺、10～16mg/L天冬氨酸、12～18mg/L谷氨酸、8～15mg/L脯氨酸、7～14mg/L丝氨酸的MEM培养液，放入37℃孵箱中培养，得有活性的细胞，即得晶状体上皮干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述消化的方法是：将碎片加0.2％的胶原酶IV溶液中，消化2h，去除胶原酶，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，混匀，过滤，即得细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述基质为基质胶、明胶、胶原、多聚赖氨酸和/或层粘连蛋白中的一种或两种以上的组合。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：培养瓶、培养板或培养皿包被基质胶的方法为：加入含1％～3％基质胶的DMEM/F12培养液或无菌PBS溶液，完全覆盖底部即可，在37℃孵箱中孵育0.5～2小时，孵育完后吸弃培养液，用无菌PBS清洗3～5次。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述基质胶的浓度为2％；孵育的时间为1小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，FBS浓度为20％，FGF浓度为100μg/L，胰岛素浓度为10mg/L，氢化可的松浓度为10mg/L，霍乱弧菌毒素浓度为10mg/L，3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸浓度为0.01mg/L，腺嘌呤浓度为5mg/L，甘氨酸浓度为7.5mg/L、丙氨酸浓度为8.9mg/L、天冬酰胺浓度为13.2mg/L、天冬氨酸浓度为13.3mg/L、谷氨酸浓度为14.7mg/L、脯氨酸浓度为11.5mg/L、丝氨酸浓度为10.5mg/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，培养液中还含有抗生素；所述的抗生素为50～100U/mL的青霉素和50～100μg/mL的链霉素。

8.一种晶状体上皮干细胞的分离培养液，其特征在于：它是添加有15～25％FBS、50～150μg/L FGF、5-10mg/L胰岛素、5-10mg/L氢化可的松、5-10mg/L霍乱弧菌毒素、0.01-0.05mg/L3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸、1-5mg/L腺嘌呤、5～10mg/L甘氨酸、6～12mg/L丙氨酸、10～16mg/L天冬酰胺、10～16mg/L天冬氨酸、12～18mg/L谷氨酸、8～15mg/L脯氨酸、7～14mg/L丝氨酸的MEM培养液。

9.根据权利要求8所述的培养液，其特征在于：FBS浓度为20％，FGF浓度为100μg/L，胰岛素浓度为10mg/L，氢化可的松浓度为10mg/L，霍乱弧菌毒素浓度为10mg/L，3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸浓度为0.01mg/L，腺嘌呤浓度为5mg/L，甘氨酸浓度为7.5mg/L、丙氨酸浓度为8.9mg/L、天冬酰胺浓度为13.2mg/L、天冬氨酸浓度为13.3mg/L、谷氨酸浓度为14.7mg/L、脯氨酸浓度为11.5mg/L、丝氨酸浓度为10.5mg/L。

10.根据权利要求8所述的培养液，其特征在于：所述培养液中还含有抗生素；所述的抗生素为50～100U/mL的青霉素和50～100μg/mL的链霉素。