CN105238737B - 诱导多能干细胞体外定向分化成晶状体小体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型诱导多能干细胞体外定向分化成晶状体小体的方法。目的是提供的方法应能形成形态良好且具备光学功能的晶状体小体；获得的晶状体小体可用于晶状体胚胎发育机制的研究、先天性白内障发病机制的研究以及白内障相关药物筛选。技术方案是：新型诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，包括以下步骤：(1)将多能干细胞定向诱导分化成初级神经外胚层细胞团；(2)分离挑选初级神经外胚层细胞团；(3)诱导神经外胚层细胞定向分化为初级晶状体小体；(4)诱导初级晶状体小体分化为成熟的晶状体小体。所述方法获得的晶状体小体，用于晶状体胚胎发育机制的研究、先天性白内障发病机制的研究以及白内障相关药物筛选。

Description

诱导多能干细胞体外定向分化成晶状体小体的方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体是一种体外诱导晶状体小体的制备方法。

背景技术

多能干细胞（pluripotent stem cells）包括胚胎干细胞（ESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）两类，是具有多分化潜能的细胞，理论上来说可以分化成任意一类细胞，将多能干细胞注射到免疫抑制的小鼠内可形成具有内中外三个胚层的畸胎瘤。

多能干细胞在药物研究、疾病机制研究及再生移植领域都有非常重要的作用。国内外已有学者利用多能干细胞定向诱导分化成特定的细胞或组织前体，作为药物毒性筛选原料，成为临床试验的第一步。在再生医学领域，国内外学者甚至已成功利用多能干细胞技术联合体外定向分化以及体内注射等手段在视网膜退行性病变、角膜病变、肝脏损害、心肌损害等多种疾病上实现了再生移植治疗。为疾病的机制研究和治疗提供了新的思路。

先天性白内障是造成儿童失明和视力损害的重要原因，任何直接或间接参与、影响晶状体发育的基因突变都可能导致先天性白内障的发生。因此，明确先天性白内障的发病机制对于治疗及预防先天性白内障的发生发展具有重要的意义。将多能干细胞中的iPSCs技术和体外晶状体诱导技术结合，可以获得先天性白内障患者特异性的多能干细胞及晶状体，国际上将体外形成的晶状体称之为晶状体小体，通过观察和检测晶状体小体发生发展过程中各类基因、蛋白的表达变化可以更直观的描述其发病过程，为发病机制的研究提供更有力的证据，同时也为基因治疗提供了理论基础。

年龄相关性白内障为全球首位致盲眼病之一，目前尚无预防及早期治疗的有效的药物，而相关有效研究模型的缺乏是药物研究面临的最大障碍，如现有细胞模型无法在药物释放、作用以及跟体内微环境互相作用等方面无法真实反映药物在体内的作用情况；而动物模型则与人体之间存在不可避免的种族差异，因此很难构建合适的药物筛选模型。白内障摘除联合人工晶体植入术是治疗白内障最常用且迄今为止效果较为理想的方法，但人工晶体存在的局限性以及术后后囊膜混浊的发生均在一定程度上影响了患者的视觉质量，限制了人工晶体的进一步发展。总结来言，白内障作为全球首位的致盲性眼病，其发病机制、疾病预防及早期治疗、再生晶体的研究及运用由于有效模型的缺乏而停滞不前。

目前国内外已有研究小组在动物实验中通过将晶状体囊袋放置在房水中培养获得有初步晶状体结构的小体，但由于材料来源的限制而无法过渡到人晶状体上。在人晶状体发育研究中，有研究团队实现了在体外诱导胚胎干细胞定向分化成晶状体上皮细胞及晶状体纤维细胞，这个定向分化的过程部分再现了晶状体的发育过程，但其应用都由于无法形成形态良好具备光学功能的晶状体小体而受到限制。

发明内容

本发明的目的是克服上述背景技术中的不足，提供一种诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法及应用，该方法应能形成形态良好且具备光学功能的晶状体小体；获得的晶状体小体可用于晶状体胚胎发育机制的研究、先天性白内障发病机制的研究以及白内障相关药物筛选。

本发明提供技术方案是：

诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，包括以下步骤：

（1）将多能干细胞定向诱导分化成初级神经外胚层细胞团

将多能干细胞接种到基质胶溶液包被的六孔板上，用含人生长因子noggin的mTesR培养液培养5-7天后形成初级神经外胚层细胞团；所述基质胶溶液由胚胎干细胞基质胶溶解在DMEM/F12培养液后形成, 胚胎干细胞基质胶的体积比例为0.8-1.2%；

（2）分离挑选初级神经外胚层细胞团

用乙二胺四乙酸溶液消化初级神经外胚层细胞团，然后用机械法将初级神经外胚层细胞团周边的数层神经外胚层细胞挑出；

（3）诱导神经外胚层细胞定向分化为初级晶状体小体

将挑出的神经外胚层细胞团接种到新的基质胶溶液包被的六孔板中，用含人生长因子bFBF、BMP4、BMP7的mTesR培养液培养5-7天并且每日更换培养液，保留出现“荷包蛋样”细胞排列结构的神经外胚层细胞团，其余细胞团剔除，继续培养8-10天后即可获得初级晶状体小体；所述新的基质胶溶液由胚胎干细胞基质胶溶解在DMEM/F12培养液后形成，胚胎干细胞基质胶的体积比例为0.8-1.2%；

（4）诱导初级晶状体小体分化为成熟的晶状体小体

用含人生长因子bFBF、Wnt3a的mTesR培养液培养初级晶状体小体，并且每日更换mTesR培养液，9-11天后即可获得由囊膜、晶状体上皮细胞、晶状体初级纤维细胞及晶状体成熟纤维细胞构成的晶状体小体。

所述步骤（1）中， mTesR培养液中含有90-110ng/ml的人生长因子noggin。

所述步骤（2）中的乙二胺四乙酸溶液，是在PBS中加入乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸含量为0.4-0.6mM，并且加入氯化钠使乙二胺四乙酸溶液的渗透压为320-360mOsm。

所述步骤（2）中挑出的神经外胚层细胞团为5-10层的内层细胞、3-7层的中层细胞以及3-7层的外层细胞。

所述步骤（3）“荷包蛋样”细胞排列结构的神经外胚层细胞团，其结构为外层数十层分化的上皮样细胞，细胞体积较中央区细胞明显增大，胞质多，细胞排列相对疏松，中央区细胞体积小排列紧凑，胞质少，两类细胞相接形成类似荷包蛋的结构；该“荷包蛋样” 的中央区细胞团较厚、周边为相连的裙边状。

所述步骤（3）中，mTesR培养液中含有17-23ng/ml的BMP4、17-23ng/ml 的BMP7、80-120ng/ml的bFBF；所述步骤（4）中，mTesR培养液中含有17-23ng/ml的Wnt3a以及80-120ng/ml的bFBF。

所述的晶状体小体呈现透明的3D结构，为圆形或椭圆形，直径1-3mm，表达晶状体特异性蛋白包括α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP。

所述的α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白为晶状体纤维细胞的结构蛋白，水通道蛋白MIP为表达在晶状体上皮细胞以及晶状体纤维细胞细胞膜上的通道蛋白。

所述的囊膜为晶状体外层包绕的一层透明薄膜，晶状体上皮细胞为囊膜下的仅有的一层柱状或立方状上皮细胞，初级晶状体纤维细胞为部分细胞器细胞核开始退化的由晶状体上皮细胞分化而来的纤维细胞，成熟晶状体纤维细胞为胞内细胞器细胞核完全退化由初级晶状体纤维细胞分化而来的细胞。

所述方法获得的晶状体小体，用于晶状体胚胎发育机制的研究、先天性白内障发病机制的研究以及白内障相关药物筛选。

本发明的有益效果是：

本发明通过脱离饲养细胞利用不同生长因子组合配伍分化早期外胚层细胞团的分离挑选纯化来实现的，突破了既往晶状体小体结构上的限制，获得了具有3D立体结构的晶状体小体且其直径可达到1-3mm，并具有初步的光学功能、良好的透光性和一定放大比率，在结构和光学功能上更接近于人类晶状体的体外晶状体，在晶状体体外诱导上完成了质的飞跃，建立了一个更完善的稳定的晶状体体外发育模式；因此，本方法可以用于晶状体发育机制、白内障发病机制、白内障治疗药物以及再生晶体的研究，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为晶状体小体J的摄像图。

图2-1为晶状体小体中晶状体蛋白α-A的mRNA表达的RT-qPCR结果图。

图2-2为晶状体小体中晶状体蛋白α-B的mRNA表达的RT-qPCR结果图。

图2-3为晶状体小体中晶状体蛋白β的mRNA表达的RT-qPCR结果图。

图2-4为晶状体小体中晶状体蛋白γ的mRNA表达的RT-qPCR结果图。

图2-5为晶状体小体中水通道蛋白MIP的mRNA表达的RT-qPCR结果图。

图3-1-1至图4-1-4为晶状体小体中晶状体蛋白α-A表达结果的免疫荧光染色图；其中：图3-1-1显示了细胞中的晶状体蛋白α-A的表达，图3-1-2显示了细胞核，图3-1-3为图3-1-1与图3-1-2的合并图，图3-1-4为图3-1-1在正常光下的晶状体小体形态。

图3-2-1至图3-2-4为晶状体小体中晶状体蛋白α-B表达结果的免疫荧光染色图；其中：图3-2-1显示了细胞中的晶状体蛋白α-B的表达，图3-2-2显示细胞核，图3-2-3为图3-2-1与图3-2-2的合并图，图3-2-4为图3-2-1在正常光下的晶状体小体形态。

图3-3-1至图3-3-4为晶状体小体中晶状体蛋白β表达结果的免疫荧光染色图；其中：图3-3-1显示了细胞中的晶状体蛋白β的表达，图3-3-2显示细胞核，图3-3-3为图3-3-1与图3-3-2的合并图，图3-3-4为图3-3-1在正常光下的晶状体小体形态。

图3-4-1至图3-4-4为晶状体小体中晶状体蛋白γ表达结果的免疫荧光染色图；其中：图3-4-1显示了细胞中的晶状体蛋白γ的表达，图3-4-2显示细胞核，图3-4-3为图3-4-1与图3-4-2的合并图，图3-4-4为图3-4-1在正常光下的晶状体小体形态图。

图3-5-1至图3-5-4为晶状体小体中水通道蛋白MIP表达结果的免疫荧光染色图；其中：图3-5-1显示了细胞中的水通道蛋白MIP的表达，图3-5-2显示细胞核，图3-5-3为图3-5-1与图3-5-2的合并图，图3-5-4为图3-5-1在正常光下的晶状体小体形态。

图4-1为显微镜4倍镜下晶状体小体亚甲蓝染色后的形态图。

图4-2为显微镜10倍镜下晶状体小体亚甲蓝染色后的形态图。

图4-3为显微镜20倍镜下晶状体小体亚甲蓝染色后的形态图。

图4-4为电子显微镜下晶状体小体外层上皮细胞的形态图。

图4-5为电子显微镜下晶状体小体初级纤维细胞形态及排列形态图。

图4-6为电子显微镜下晶状体小体成熟纤维细胞形态及排列形态图。

图4-7为电子显微镜下晶状体小体外层上皮细胞局部放大图。

图4-8和图5-9为电子显微镜下晶状体小体初级纤维细胞局部放大图。

图5-1为空白对照图（在只有培养液下“X”的形态和大小）。

图5-2为在晶状体小体（LB）下“X”的形态和大小形态图（说明晶状体小体具有透光性和放大性）。

图5-3为计算30个晶状体小体的放大率之后的获得的平均值和标准差图。

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实验，给出了详细的实施方法和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

一、实施例

实施例1

一种诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，包括以下步骤：

（1）定向诱导多能干细胞成初级神经外胚层细胞团

先用基质胶（matrigel）溶液包被六孔板，在37℃、5%CO₂及饱和湿度的培养箱内放置50分钟，随后将包被液吸走，用DMEM/F12培养液快速洗一次；再将多能干细胞接种在六孔板上用mTesR（人胚胎干细胞培养基）培养液培养5天，获得初级神经外胚层细胞团；

基质胶溶液为胚胎干细胞基质胶（BD matrigel^TM hESC-qualified Matrix）溶解在DMEM/F12培养液中形成，胚胎干细胞基质胶的体积比例为0.8%；mTesR培养液中含有的人生长因子为90ng/ml的noggin；

显微镜下可观察到获得的初级神经外胚层细胞团具有三类细胞，位于最外层的细胞体积最大、胞质最多、排列相对最疏松，位于内部的细胞排列紧密、细胞核大细胞质少、与多能干细胞形态一致，而中间的数层细胞形态介于两者之间；

（2）分离挑选纯初级神经外胚层细胞团

将步骤（1）中获得的初级神经外胚层细胞团用乙二胺四乙酸（Ethylene DiamineTetraacetic Acid，EDTA）溶液消化后放置在显微镜下，在超净台中用针头将细胞团周边数层细胞划割开后用移液器吸起，得神经外胚层细胞团；

乙二胺四乙酸溶液为：0.4mM的EDTA溶解在PBS（磷酸盐缓冲液）中，并加入0.16%（M/V）氯化钠使其渗透压为320mOsm；划割获得的神经外胚层细胞团包括5层的内层细胞、3层的中层细胞和3层的外层细胞；

（3）诱导神经外胚层细胞定向分化为初级晶状体小体

将步骤（2）中获得的神经外胚层细胞团接种到新的基质胶包被的六孔板中培养并且每日换液，5天后状态佳的细胞团可出现“荷包蛋样” （中间较厚、周边为相连的裙边状）的细胞排列结构，将培养皿中未出现“荷包蛋样”细胞排列结构的细胞团剔除，剩余细胞团继续培养，8天后即可获得有中央区出现透明状突起的初级晶状体小体；

mTesR培养液中含有以下生长因子：17ng/ml的BMP4（骨形态发生蛋白4）、17ng/ml的BMP7 （骨形态发生蛋白7）以及80ng/ml的bFBF（人成纤维细胞生长因子）；

（4） 诱导初级晶状体小体分化为更成熟的晶状体小体

继续培养步骤（3）中获得的初级晶状体小体，每日换液，9日后即可获得晶状体小体；mTesR培养液中含有以下生长因子：17ng/ml 的Wnt3a（Wnt通路信号分子之一）、80ng/ml的bFBF。

实施例2

一种诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，包括以下步骤：

（1）定向诱导多能干细胞成初级神经外胚层细胞团

先用基质胶（matrigel）溶液包被六孔板，在37℃、5%CO₂及饱和湿度的培养箱内放置1小时，随后将包被液吸走，用DMEM/F12培养液快速洗一次；再将多能干细胞接种在六孔板上用mTesR培养液培养6天，获得初级神经外胚层细胞团；

基质胶溶液为胚胎干细胞基质胶（BD matrigel^TM hESC-qualified Matrix）溶解在DMEM/F12培养液中形成，胚胎干细胞基质胶的体积比例为1.0%；mTesR培养液中含有的人生长因子为100ng/ml的noggin；

显微镜下可观察到获得的初级外胚层细胞团具有三类细胞，位于最外层的细胞体积最大、胞质最多、排列相对最疏松，位于内部的细胞排列紧密、细胞核大细胞质少、与多能干细胞形态一致，而中间的数层细胞形态介于两者之间；

（2）分离挑选纯化初级神经外胚层细胞团

将步骤（1）中获得的初级神经外胚层细胞团用乙二胺四乙酸（Ethylene DiamineTetraacetic Acid，EDTA）溶液消化后放置在显微镜下，在超净台中用针头将细胞团周边数层细胞划割开后用移液器吸起，得神经外胚层细胞团；

乙二胺四乙酸溶液为：0.5mM的EDTA溶解在PBS（磷酸盐缓冲液）中，并加入0.18%（M/V）氯化钠使其渗透压为340mOsm；划割获得的神经外胚层细胞团包括8层的内层细胞、5层的中层细胞和5层的外层细胞；

（3）诱导神经外胚层细胞定向分化为初级晶状体小体

将步骤（2）中获得的神经外胚层细胞团接种到新的基质胶包被的六孔板中培养并且每日换液，6天后状态佳的细胞团可出现“荷包蛋样” （中间较厚、周边为相连的裙边状）的细胞排列结构，将培养皿中未出现“荷包蛋样”细胞排列结构的细胞团剔除，剩余细胞团继续培养，9天后即可获得有中央区出现透明状突起的初级晶状体小体；

mTesR培养液中含有以下生长因子：20ng/ml的BMP4、20ng/ml 的BMP7 以及100ng/ml的bFBF；

（4） 诱导初级晶状体小体分化为更成熟的晶状体小体

继续培养步骤（3）中获得的初级晶状体小体，每日换液，10日后即可获得晶状体小体；mTesR培养液中含有以下生长因子：20ng/ml 的Wnt3a、100ng/ml的bFBF。

实施例3

一种诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，包括以下步骤：

（1）定向诱导多能干细胞成初级神经外胚层细胞团

先用基质胶（matrigel）溶液包被六孔板，在37℃、5%CO₂及饱和湿度的培养箱内放置分钟，随后将包被液吸走，用DMEM/F12培养液快速洗一次；再将多能干细胞接种在六孔板上用mTesR培养液培养7天，获得初级神经外胚层细胞团；

基质胶溶液为胚胎干细胞基质胶（BD matrigel^TM hESC-qualified Matrix）溶解在DMEM/F12培养液中形成，胚胎干细胞基质胶的体积比例为1.2%；mTesR培养液中含有的人生长因子为110ng/ml的noggin；

显微镜下可观察到获得的初级外胚层细胞团具有三类细胞，位于最外层的细胞体积最大、胞质最多、排列相对最疏松，位于内部的细胞排列紧密、细胞核大细胞质少、与多能干细胞形态一致，而中间的数层细胞形态介于两者之间；

（2）分离挑选纯化神经外胚层细胞团

将步骤（1）中获得的初级神经外胚层细胞团用乙二胺四乙酸（Ethylene DiamineTetraacetic Acid，EDTA）溶液消化后放置在显微镜下，在超净台中用针头将细胞团周边数层细胞划割开后用移液器吸起，得神经外胚层细胞团；

乙二胺四乙酸溶液为：0.6mM的EDTA溶解在PBS（磷酸盐缓冲液）中，并加入0.20%（M/V）氯化钠使其渗透压为360mOsm；划割获得的神经外胚层细胞团包括10层的内层细胞、7层的中层细胞和7层的外层细胞；

（3）诱导神经外胚层细胞定向分化为初级晶状体小体

将步骤（2）中获得的神经外胚层细胞团接种到新的基质胶包被的六孔板中培养并且每日换液，7天后状态佳的细胞团可出现“荷包蛋样” （中间较厚、周边为相连的裙边状）的细胞排列结构，将培养皿中未出现“荷包蛋样”细胞排列结构的细胞团剔除，剩余细胞团继续培养，10天后即可获得有中央区出现透明状突起的初级晶状体小体；

mTesR培养液中含有以下生长因子：23ng/ml的BMP4、23ng/ml 的BMP7 以及120ng/ml的bFBF；

（4） 诱导初级晶状体小体分化为更成熟的晶状体小体

继续培养步骤（3）中获得的初级晶状体小体，每日换液，11日后即可获得晶状体小体；mTesR培养液中含有以下生长因子：23ng/ml 的Wnt3a、120ng/ml的bFBF。

二、获得的晶状体小体

获得的晶状体小体呈现透明的3D结构如图1所示，为圆形或椭圆形，直径约1-3mm，表达晶状体特异性蛋白包括α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP；在电镜下可以观察到晶状体小体具有囊膜、晶状体上皮细胞、初级晶状体纤维细胞、成熟晶状体纤维细胞等结构，与正常的人晶状体结构类似。

所述的α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP为特异性表达在晶状体的蛋白。α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白为晶状体纤维细胞的结构蛋白，水通道蛋白MIP为表达在晶状体上皮细胞以及晶状体纤维细胞细胞膜上的通道蛋白。

囊膜为晶状体外层包绕的一层透明薄膜，晶状体体上皮细胞为囊膜下的仅有的一层柱状或立方状上皮细胞，初级晶状体纤维细胞为部分细胞器细胞核开始退化的由晶状体上皮细胞分化而来的纤维细胞，成熟晶状体纤维细胞为胞内细胞器细胞核完全退化由初级晶状体纤维细胞分化而来的细胞。

三、晶状体小体mRNA（信使核糖核酸）水平上α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP的表达检测

通过Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction（RT-qPCR）（试剂购自TaKaRa公司）技术来检测，将获得的晶状体小体用PBS冲洗2遍后，加入Trizol（购自invitrogen公司）1ml，置于冰上用匀浆器反复研磨5分钟，充分裂解细胞。收集裂解产物转移到1.5ml的EP管中，加入氯仿200ml，用力震荡15秒，室温下静置2-3分钟后离心（4度，12000g，15分钟）。

离心后液体分为三层，上层澄清层为RNA，中间白色层为DNA，底下红色层为蛋白。小心吸取上清液，勿吸入中间蛋白层，加入等体积异丙醇，混匀，室温下静置20分钟后离心（4度，12000g，10分钟），弃上清液体。加入1ml75%乙醇洗杂质，震荡30秒后再次离心（4度，7500g，5分钟）。弃无水乙醇，室温放置3～5分钟，待其挥发至干燥时，加入20ul DEPC水溶解RNA。准备一个0.2ml的EP管，加入RNA500ng，用DEPC水补足至8ul，再加入2ul oligo DT，将三者混匀后70度水浴5分钟，立即放置于冰上退火。再加入3ul 5×Buffer、0.3ul DEPC水、0.7ul dNTP、0.5ulRNA酶抑制剂、0.5ul逆转录酶，混匀。将上诉混合物置于PCR仪中，42度 1小时、70度 15分钟后，取出后置于-20度保存。由此获得cDNA混合物。取一块RT-PCR反应板，各孔中分别加入SYBR 10ul、ROX 0.4ul、DEPC水1ul、cDNA 0.6ul，再加入引物8ul，混匀，贴膜。室温下3000rpm 离心2分钟将孔壁上的液体甩下。放入RT-PCR仪中，调整参数：95度30分钟、95度5秒、60度34分钟、95度15分钟、60度1小时、95度15秒。以iPSCs为对照，计算晶状体小体中α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP的表达变化。

如图2-1至图2-5所示：RT-qPCR结果显示晶状体小体中α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP的表达明显升高，而iPSCs中这五类蛋白基本没有表达。

四、晶状体小体表达α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP的免疫荧光染色（参见图3-1-1至图3-5-4）

将晶状体小体的培养液吸干，用PBS洗3次，吸干。用4%（M/V）PFA（购自sigma公司）溶液室温固定15分钟，将PFA吸干，用PBS洗三次，每次10分钟，吸干。用0.3%（V/V）Triton X(in PBS)处理15分钟穿透细胞膜，用0.1％Triton X (in PBS)洗三次，每次10分钟。用20％（V/V）驴血清（in 0.1%Triton X）室温下封闭1小时，低速震荡。将0.1%Triton X稀释的相应一抗（均购自Santa Cruz Biotechnology公司）加在细胞样品上，放置在湿盒中4℃过夜。过夜后用0.1%Triton X洗三次，每次10分钟，吸干。将0.1%Triton X稀释的二抗（购自）加在细胞样品上，避光低速震荡1.5小时。用0.1%Triton X洗三次，每次10分钟，吸干；加入5ug/ml的DAPI（购自sigma公司）避光低速震荡染色10分钟。用PBS洗三次，每次10分钟，吸干后再加入PBS避免细胞干燥。倒置荧光显微镜下观察。

免疫荧光结果显示晶状体小体表达α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP这五种晶状体特异性蛋白。

五、晶状体小体电镜观察（参见图4-1至图4-8）

晶状体小体在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；小心取出锇酸废液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用梯度浓度（包括30%，50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理20min；最后过度到纯丙酮处理20min。用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h；用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h；纯包埋剂处理样品过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在LEICA EM UC7型超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色5-10min，即可在Hitachi H-7650型透射电镜中观察。其中戊二醛、缓冲液、乙醇、丙酮、柠檬酸铅、亚甲基蓝均购自国药集团化学试剂公司。锇酸、Spurr包埋剂、醋酸双氧铀均购自SPI-CHEM公司。

电镜结果显示晶状体小体具有囊膜、晶状体上皮细胞、初级晶状体纤维细胞、成熟晶状体纤维细胞等结构，与正常的人晶状体结构类似。囊膜为晶状体外层包绕的一层透明薄膜，晶状体体上皮细胞为囊膜下的仅有的一层柱状或立方状上皮细胞，初级晶状体纤维细胞为部分细胞器细胞核开始退化的由晶状体上皮细胞分化而来的纤维细胞，成熟晶状体纤维细胞为胞内细胞器细胞核完全退化由初级晶状体纤维细胞分化而来的细胞。

六、晶状体小体光学特性检验

在白色的A4纸正中打印出大写的小六号“X”，放置在晶状体小体下方，利用解剖显微镜观察晶状体小体的透光度。同时测量在有晶状体小体时以及无晶状体小体时“X”中心区的长度，两者相比即可获得晶状体小体放大倍数。

实验结果显示晶状体小体具有良好的透光性，且具有约1.7倍的放大率，证实了用本方法获得的晶状体小体具有初步的晶状体光学特性（参见图5-1至图5-3）。

本文所述试剂的生产公司及货号如下：

Noggin：由R&D（R&D Systems 美国）公司生产，货号为6057-NG。

bFBF：由PeproTech （美国）公司生产，货号为100-18B。

BMP4：由R&D（R&D Systems 美国）公司生产，货号为314-BP-010。

BMP7：由R&D（R&D Systems 美国）公司生产，货号为354-BP-010。

Wnt3a：由PeproTech （美国）公司生产，货号为315-20。

Claims (7)

1.一种诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，包括以下步骤：

（1）将多能干细胞定向诱导分化成初级神经外胚层细胞团

将多能干细胞接种到基质胶溶液包被的六孔板上，用含人生长因子noggin的mTesR培养液培养5-7天后形成初级神经外胚层细胞团；所述基质胶溶液由胚胎干细胞基质胶溶解在DMEM/F12培养液后形成, 胚胎干细胞基质胶的体积比例为0.8-1.2%；

（2）分离挑选初级神经外胚层细胞团

用乙二胺四乙酸溶液消化初级神经外胚层细胞团，然后用机械法将初级神经外胚层细胞团周边的数层神经外胚层细胞挑出；

（3）诱导神经外胚层细胞定向分化为初级晶状体小体

将挑出的神经外胚层细胞团接种到新的基质胶溶液包被的六孔板中，用含人生长因子bFGF、BMP4、BMP7的mTesR培养液培养5-7天并且每日更换培养液，保留出现“荷包蛋样”细胞排列结构的神经外胚层细胞团，其余细胞团剔除，继续培养8-10天后即可获得初级晶状体小体；所述新的基质胶溶液由胚胎干细胞基质胶溶解在DMEM/F12培养液后形成，胚胎干细胞基质胶的体积比例为0.8-1.2%；

（4）诱导初级晶状体小体分化为成熟的晶状体小体

用含人生长因子bFGF、Wnt3a的mTesR培养液培养初级晶状体小体，并且每日更换mTesR培养液，9-11天后即可获得由囊膜、晶状体上皮细胞、晶状体初级纤维细胞及晶状体成熟纤维细胞构成的晶状体小体；

所述步骤（1）中，mTesR培养液中含有90-110ng/ml的人生长因子noggin；

所述步骤（2）中挑出的神经外胚层细胞团为5-10层的内层细胞、3-7层的中层细胞以及3-7层的外层细胞；

所述步骤（3）“荷包蛋样”细胞排列结构的神经外胚层细胞团，其结构为外层数十层分化的上皮样细胞，细胞体积较中央区细胞明显增大，胞质多，细胞排列相对疏松，中央区细胞体积小排列紧凑，胞质少，两类细胞相接形成类似荷包蛋的结构；该“荷包蛋样” 的中央区细胞团较厚、周边为相连的裙边状。

2.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的乙二胺四乙酸溶液，是在PBS中加入乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸含量为0.4-0.6mM，并且加入氯化钠使乙二胺四乙酸溶液的渗透压为320-360mOsm。

3.根据权利要求2所述的诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，mTesR培养液中含有17-23ng/ml的BMP4、17-23ng/ml 的BMP7、80-120ng/ml的bFGF；所述步骤（4）中，mTesR培养液中含有17-23ng/ml的Wnt3a以及80-120ng/ml的bFGF。

4.根据权利要求3所述的诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，其特征在于所述的晶状体小体呈现透明的3D结构，为圆形或椭圆形，直径1-3mm，表达晶状体特异性蛋白包括α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP。

5.根据权利要求4所述的诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，其特征在于所述的α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白为晶状体纤维细胞的结构蛋白，水通道蛋白MIP为表达在晶状体上皮细胞以及晶状体纤维细胞细胞膜上的通道蛋白。

6.根据权利要求5所述的诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，其特征在于所述的囊膜为晶状体外层包绕的一层透明薄膜，晶状体上皮细胞为囊膜下的仅有的一层柱状或立方状上皮细胞，初级晶状体纤维细胞为部分细胞器细胞核开始退化的由晶状体上皮细胞分化而来的纤维细胞，成熟晶状体纤维细胞为胞内细胞器细胞核完全退化由初级晶状体纤维细胞分化而来的细胞。

7.权利要求1所述方法获得的晶状体小体，用于晶状体胚胎发育机制的研究、先天性白内障发病机制的研究以及白内障相关药物筛选。