CN107557329A

CN107557329A - 一种大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法

Info

Publication number: CN107557329A
Application number: CN201610556064.9A
Authority: CN
Inventors: 田瑞; 张亚洲; 蒋敏; 齐来俊
Original assignee: CHI SCIENTIFIC Inc
Current assignee: CHI SCIENTIFIC Inc
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2018-01-09

Abstract

本发明提供一种大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)大鼠颈椎脱臼处死，消毒并断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑；(b)在无菌条件下，剥离解剖去除小脑、间脑以及去除软脑膜和脑膜大血管等，保留大脑皮质；(c)通过机械酶消化法，并结合连续密度梯度离心法获得纯度较高的脑微血管片段；(d)将纯化的脑微血管片段铺置特制的细胞培养皿，并使用两种不同的培养基分离培养脑微血管内皮细胞。本发明提供的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法可获得产量高、纯度高且生存时间较长的大鼠脑微血管内皮细胞。

Description

一种大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法。

背景技术

脑微血管内皮细胞是研究血一脑屏障及脑多种疾病的一个重要模型，分离纯化脑微血管内皮细胞为研究脑内皮细胞的生理和病理特性提供了有效的技术支持。脑微血管内皮细胞具有很多自身特性，如细胞活性低，分离的细胞容易受到成纤维细胞、平滑肌等杂细胞污染等等问题，为此分离培养脑微血管内皮细胞的关键步骤之一就是获得纯度较高的微血管片段。常规方法多采用玻璃匀浆法及尼龙滤网过滤的方法来获得微血管片段。但这些方法存在着微血管活性损伤大及获得率低等问题；本实验采用机械酶消化法，并结合连续密度梯度离心法获得纯度较高的脑微血管片段，将其放置特制的细胞培养皿和培养基中，分离的内皮细胞活性好，纯度高，该实验具有稳定的可重复性。

发明内容

本发明的目的是建立一种可获得产量高、纯度高且生存时间较长的大鼠脑微血管内皮细胞。

为了解决解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法获得大鼠脑微血管内皮细胞：

大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)大鼠颈椎脱臼处死，消毒并断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑；(b)在无菌条件下，剥离解剖去除小脑、间脑以及去除软脑膜和脑膜大血管等，保留大脑皮质；(c)通过机械酶消化法，并结合连续密度梯度离心法获得纯度较高的脑微血管片段；(d)将纯化的脑微血管片段铺置特制的细胞培养皿，并使用两种不同的培养基分离培养脑微血管内皮细胞。

可选的大鼠为25-50g，2-3周龄的SD大鼠；

可选的分离大脑皮质是在预冷的PBS玻璃培养皿中，解剖去除小脑、间脑；将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以吸除软脑膜及脑膜大血管；置于新的盛有预冷的PBS玻璃培养皿中，用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜；

可选的机械酶消化法是将剥离干净的大脑皮质剪碎成约1mm³大小，加入混合酶液I，混匀，37℃水浴消化1-1.5h；1 000×g室温离心8min，去上清液；沉淀中加入一定浓度的BSA重悬浮，充分混匀，1 000×g 4℃离心20min，去上清；沉淀加入4ml混合酶液II重悬浮，混匀，37℃水浴消化0.5-1h；700×g室温离心6min，去上清液；所述的混合酶液I是0.05-0.1％II型胶原酶，0.025-0.05％IV型胶原酶，200-400U DNaseI，所述的BSA浓度为15-30％，所述的混合酶液II是0.05-0.1％的胶原酶/分散酶，0.05-0.1％I型胶原酶，100-300U DNaseI；

可选的连续密度梯度离心法获得纯度较高的脑微血管片段是通过将消化后离心的沉淀重悬浮，铺于经离心形成连续梯度的12ml 30-50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1 000×g，4℃离心10min，吸取中间白黄色的层面，用DMEM漂洗两次(离心1 000×rpm，6min，室温)，去上清液；

可选的特制细胞培养皿是用含5％的大鼠血清37℃孵育过夜所制备的；

可选的使用不同的培养基分离培养脑微血管内皮细胞为离心沉淀加入 DMEM完全培养液(10-20％FBS，2-6ug/mL嘌呤霉素)重悬浮，接种于特殊制备的细胞培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养24h后更换的混合培养基，随后隔天换液；

可选的混合培养基为5％-10％的大鼠血清，10-20％FBS，10-100μg/mL牛垂体和下丘脑提取物，1ng/mL bFGF以及RPMI1640、DMEM/F12(1∶1)的基础培养基。

本发明提供的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法中使用的机械法、两步酶消化法以及纯化方法，节省了消化所需时间，提高细胞的产率和存活率以及细胞的纯度；

本发明提供一种特制细胞培养皿和混合培养基培养大鼠微血管内皮细胞的方法，增加了微血管内皮细胞的生存期，提高细胞活性；

本发明解决了细胞损伤大、获得率低、纯度不高等问题，分离的微血管内皮细胞，产率高，活性好，纯度高，该实验具有稳定的可重复性。

附图说明

图1：大鼠微血管内皮细胞(×100)

图2：鉴定大鼠微血管内皮细胞免疫荧光电镜(×100)

具体实施方式

为了使本发明的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述，此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。

本发明选择2-3周龄的SD大鼠，分离脑微血管内皮细胞。具体操作如下：

1.取10只2-3周龄雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死后浸泡于75％乙醇中消毒 3-5min。

2.在超净工作台中，将大鼠断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑置于盛有预冷的PBS玻璃培养皿中，解剖去除小脑、间脑。

3.将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以吸除软脑膜及脑膜大血管，再置于新的盛有预冷的PBS玻璃培养皿中，用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质。

4.大脑皮质放于DMEM中(含庆大霉素和谷氨酰胺)，剪碎成约1mm³大小，放入50ml的离心管中，加入混合酶液I(0.05-0.1％II型胶原酶，0.025-0.05％IV型胶原酶，200-400U DNaseI)，混匀后37℃水浴消化1-1.5h。

5.室温1 000×g离心8min，去上清液。

6.沉淀中加入20％BSA重悬浮，充分混匀，1 000×g，20min，4℃离心，去上清。

7.沉淀加入4ml混合酶液II(0.05-0.1％的胶原酶/分散酶，0.05-0.1％I型胶原酶，100-300U DNaseI)重悬浮，混匀，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室温离心6min，去上清液。

8.沉淀加入2ml DMEM(含庆大霉素和谷氨酰胺)培养液悬浮混匀，铺于经离心形成连续梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃离心10min。

9.靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗两次(离心1000×rpm，6min，室温)，去上清液。

10.加入DMEM完全培养液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素)重悬浮，接种于含5％的大鼠血清37℃孵育过夜所制备的细胞培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养24h后更换不含嘌呤霉素的混合培养基，随后隔天换液。

11.免疫荧光电镜检测：(1)待细胞生长5d后，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4％多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；(2)PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；(3)PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4％BSA封闭细胞30min；(4)按1∶100的比例稀释单克隆vWF一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育过夜；(5)PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1∶100的比例稀释二抗，37℃条件下放置1h；(6)用PBS冲洗3次，每次10min，最后DAPI染细胞核并用荧光显微镜拍照。

以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，包括步骤：(a)大鼠颈椎脱臼处死，消毒并断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑；(b)在无菌条件下，剥离解剖去除小脑、间脑以及去除软脑膜和脑膜大血管等，保留大脑皮质；(c)通过机械酶消化法，并结合连续密度梯度离心法获得纯度较高的脑微血管片段；(d)将纯化的脑微血管片段铺置特制的细胞培养皿，并使用两种不同的培养基分离培养脑微血管内皮细胞。

2.根据权利要求1所述的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述的大鼠为25-50g，2-3周龄的SD大鼠。

3.根据权利要求1所述的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c中机械酶消化法是将剥离干净的大脑皮质剪碎成约1mm³大小，加入混合酶液I，混匀，37℃水浴消化1-1.5h；1000×g室温离心8min，去上清液；沉淀中加入一定浓度的BSA重悬浮，充分混匀，1000×g 4℃离心20min，去上清；沉淀加入4ml混合酶液II重悬浮，混匀，37℃水浴消化0.5-1h；700×g室温离心6min，去上清液；所述的混合酶液I是0.05-0.1％II型胶原酶，0.025-0.05％IV型胶原酶，200-400U DNaseI，所述的BSA浓度为15-30％，所述的混合酶液II是0.05-0.1％的胶原酶/分散酶，0.05-0.1％I型胶原酶，100-300UDNaseI。

4.根据权利要求1所述的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c中连续密度梯度离心法获得纯度较高的脑微血管片段是通过将消化后离心的沉淀重悬浮，铺于经离心形成连续梯度的12ml 30-50％Percoll(25000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃离心10min，吸取中间白黄色的层面，用DMEM漂洗两次(离心1000×rpm，6min，室温)，去上清液。

5.根据权利要求1所述的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤d中将纯化的脑微血管片段铺置特制的细胞培养皿，所述细胞培养皿是用含5％的大鼠血清37℃孵育过夜所制备的。

6.根据权利要求1所述的大鼠脑微血管内皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤d中使用两种不同的培养基分离培养脑微血管内皮细胞为离心沉淀加入DMEM完全培养液(10-20％FBS，2-6ug/mL嘌呤霉素)重悬浮，接种于特殊制备的细胞培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养24h后更换混合培养基，随后隔天换液；所述混合培养基为含5％-10％的大鼠血清，10-20％FBS，10-100μg/mL牛垂体和下丘脑提取物，1ng/mL bFGF以及RPMI1640、DMEM/F12(1∶1)的基础培养基。