CN115369071A - 一种用于不同组织解离的普适性方法 - Google Patents

一种用于不同组织解离的普适性方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于不同组织解离的普适性方法，其包括以下步骤：将组织碎块与消化液I混合，进行第一消化反应后分层，取上清获得消化液A；取分层后剩余组织碎块，加入所述混合酶I进行第二消化反应，获得消化液B；合并消化液A和消化液B，加入分散酶进行第三消化反应，终止所述第三消化反应后获得消化液C；将所述消化液C进行过滤，离心后重悬。本发明提供的普适性方法获得的单细胞悬液活性可以达到85％以上，且不需要通过去死细胞的实验操作，细胞数目可达到106数量级以上；且可以同时操作多个样本，保留了细胞多样性，还保证了细胞悬液的质量，在提高解离效率的前提下还保证了解离的质量；具体良好的兼容性和普适性。

Description

一种用于不同组织解离的普适性方法
技术领域
本发明属于细胞领域，具体涉及一种用于不同组织解离的普适性方法。
背景技术
随着生物科技的不断进步和发展，近些年单细胞测序技术一跃成为了目前热门的话题之一。单细胞测序技术相比于传统测序技术，可以单个细胞的基因组、转录组以及免疫组水平进行测序结果的分析。
单细胞测序的主要流程包括：单细胞悬液的制备，单细胞的捕获，RT-PCR的扩增，文库的构建，上机测序以及下机数据的生信分析等步骤。其中，单细胞悬液的制备在该流程中占有重要的地位，单细胞悬液的质量主要包括细胞总量，细胞活性，细胞结团率以及细胞碎块率等方面。单细胞悬液的质量直接影响后续的实验操作，以及最终文库下机之后的数据分析质量。因此，找到合适的组织解离方法保证单细胞悬液质量极其重要。
目前，组织解离最常见的方法有机械法和酶解法。其中，利用机械法解离组织时，最终获得的单细胞活性较低且有大量组织块的剩余。因此，探索适用于大部分组织解离的酶解法迫在眉睫。
但是通常组织解离的时间长，并且操作复杂，最终导致解离效率较低；并且上述单细胞悬液的细胞总量，细胞活性，细胞结团率以及细胞碎块质量较差。
已经被报到过的解离方法(CN112574941A)获取的细胞总量能达到要求，但是细胞的活性和其他方面却不达标；或者虽然细胞的活性可以达到要求，但是细胞数量却达不到要求。
如今大部分的解离方法只针对于一种或者一类组织，缺乏普适性；由于大部分解离方法和解离酶只适用于一种或者一类组织样本，不能同时操作多个样本，这导致研究人员不能同时进行不同组织样本的解离操作；还需要去除死细胞操作，这一步骤降低了细胞多样性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种用于不同组织解离的普适性方法，该普适性方法可以同时操作多个样本，不需要去除死细胞，还保证了细胞悬液的质量，因此提高解离效率的前提下还保证了解离的质量。
具体地，本发明利用酶解的方法实现组织的解离，最终获得高质量的细胞悬液。本发明分别从解离酶的组合、解离酶的浓度、消化温度控制、消化时间的长短以及细胞保护剂等方面，对不同组织的解离做了大量测试并经过多次的重复验证。最终，实验证明本发明对组织或器官解离具有普适性。
经验证，本发明可适用于小鼠和胚胎鼠的大部分组织，主要包括：胚胎小鼠的脑、心脏、肺、肝、胃、肾、脾、小肠和皮肤等，以及成体小鼠的肺、脑、肝(核)、肾、脾、小肠和心脏等组织。本发明的优势在于：首先，本方案可以同时操作不同组织，大大提升多个样本解离的进度；另一方面，单细胞悬液的获取可以在1小时内完成(包括解离、碎块去除和活率测定等步骤)。最后，本发明所制备的单细胞活性可以达85％以上，不需要去除死细胞操作。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种组织解离的普适性方法，所述普适性方法包括以下步骤：
(1)将组织碎块与混合酶I混合，进行第一消化反应后分层，其中上层为上清，下层为剩余的组织碎块；混合酶I为0.05-0.2％胶原酶Ⅱ和0.05-0.2％胶原酶Ⅳ；
(2)取(1)中上清置于1℃-8℃的低温下例如冰水浴中，获得消化液A；
(3)取(1)中所述剩余的组织碎块与所述混合酶I混合，进行第二消化反应，获得消化液B；
(4)将消化液A、消化液B和分散酶混合，进行第三消化反应，反应终止后获得消化液C；
(5)将所述消化液C进行过滤，离心后使用缓冲液重悬。
本发明提供的普适性方法，保留了细胞多样性，可在短时间内获取足量细胞，还保证了细胞悬液的质量，最终获得的单细胞悬液活性可以达到85％以上，细胞数目可达到106数量级以上。因此提高解离效率的前提下还保证了解离的质量。
在某些技术方案中，步骤(1)中，所述混合酶I的体积为3-5ml，例如3ml，和/或，所述混合酶I为0.1％胶原酶Ⅱ和0.1％胶原酶Ⅳ；
和/或，步骤(1)中，所述组织碎块和混合酶I的重量体积比为(10-25):1，优选为20:1；所述重量体积比的单位为mg/ml；
和/或，步骤(3)中，所述混合酶I的体积为3-5ml，例如5ml；
和/或，步骤(4)中，所述分散酶为0.01-0.1％Dispase II，优选为0.06％DispaseII。
在某些技术方案中，步骤(5)中：所述离心后加入红细胞裂解液再进行重悬。
优选地，所述红细胞裂解液的体积为1-2ml，例如1ml；和/或，所述红细胞裂解液包括150mM NH4Cl，10mM KHCO3和0.1mM EDTA，pH 7.4。
在某些技术方案中，所述第一消化反应、第二消化反应以及第三消化反应均在震荡中进行，所述震荡的转速为50-100rpm，例如为80rpm；
和/或，所述第一消化反应、第二消化反应以及第三消化反应的温度为4-37℃，例如为37℃；
和/或，所述第一消化反应以及第三消化反应的时间为5-15min，例如为5min；所述第二消化反应的时间为15-30min，例如为15min。
在某些技术方案中，步骤(1)中，所述分层在静置下使剩余的组织碎块自然沉降下发生，例如静置1min；
和/或，步骤(4)中，所述终止的条件为降温孵育例如冰上孵育。
优选地，所述终止时还可以加入保护剂例如为胎牛血清。更优选地，所述胎牛血清的浓度为10％。
在某些技术方案中，步骤(5)中，所述过滤使用滤网进行，所述滤网的网眼尺寸优选为50-100μm，例如70μm；
和/或，所述离心的离心力为300-350g；
和/或，所述离心的时间为5-10min，优选为5min；
和/或，所述离心的温度为1-8℃，优选为4℃；
和/或，所述缓冲液为PBS或PBS+BSA，优选为PBS，更优选为预冷的PBS；
和/或，所述缓冲液的体积为1-5ml，所述重悬进行一至多次，优选为三次。
在某些技术方案中，还包括在步骤(1)前，用组织清洗液清洗组织碎块，分层后获得下层处理后的组织碎块的步骤；所述组织清洗液包括：137mM NaCl，5.4mM KCl，0.3mMNa2HPO4·2H2O，0.4mM KH2PO4，5.6mM葡萄糖，4.2mM NaHCO3，pH 7.4，溶剂为水；所述组织碎块的尺寸为0.3cm2。
优选地，所述分层在静置下使清洗后的组织碎块自然沉降下发生，例如静置1min；和/或，所述清洗重复一至三次，例如三次。
在某些技术方案中，所述组织碎块来自小鼠或胚胎鼠。
优选地，所述组织碎块来自胚胎小鼠的脑、心脏、肺、肝、胃、肾、脾、小肠和皮肤组织，和/或，成体小鼠的肺、脑、肝、肾、脾、小肠和心脏组织。
更优选地，所述组织碎块来自E18胚胎小鼠皮肤组织、成年小鼠肝组织和/或成年小鼠脾脏组织。
本发明第二方面提供一种用于解离组织细胞的解离液组合，所述解离液组合包括由0.05-0.2％胶原酶Ⅱ和0.05-0.2％胶原酶Ⅳ组成的混合酶I。
优选地，所述解离液组合还包括0.01-0.1％分散酶和/或红细胞裂解液。
更优选地，所述混合酶I为0.1％胶原酶Ⅱ和0.1％胶原酶Ⅳ，所述分散酶为0.06％Dispase II。
本发明第三方面提供如本发明第二方面所述的解离液组合在制备解离组织的试剂中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明操作获得的单细胞悬液活性可以达到85％以上，且不需要通过去死细胞的实验操作，细胞数目可达到106数量级以上。本发明提供的普适性方法，可以同时操作多个样本，由于不需要去除死细胞，保留了细胞多样性，可在短时间内获取足量细胞，还保证了细胞悬液的质量，因此提高解离效率的前提下还保证了解离的质量。并且具体良好的兼容性和普适性：解离好的单细胞悬液可直接用于不同的单细胞建库平台，无需反复清洗细胞；可完成常见的小鼠组织解离操作，活性高结团率低。
附图说明
图1A为E18胚胎小鼠皮肤组织细胞的明场视野图，图1B为E18胚胎小鼠皮肤组织细胞的荧光染色视野图，图1C为E18胚胎小鼠皮肤组织细胞的合并视野图；(绿色代表活细胞，红色代表死细胞)。
图2A为成年小鼠肝组织细胞的明场视野图，图2B为成年小鼠肝组织细胞的荧光染色视野图，图2C为成年小鼠肝组织细胞的合并视野图；(绿色代表活细胞，红色代表死细胞)。
图3A为成年小鼠脾脏组织细胞的明场视野图，图3B为成年小鼠脾脏组织细胞的荧光染色视野图，图3C为成年小鼠脾脏组织细胞的合并视野图；(绿色代表活细胞，红色代表死细胞)。
图4A为成年小鼠脑组织细胞的明场视野图，图4B为成年小鼠脑组织细胞的荧光染色视野图，图4C为成年小鼠脑组织细胞的合并视野图；(绿色代表活细胞，红色代表死细胞)。
图5A为成年小鼠小肠组织细胞的明场视野图，图5B为成年小鼠小肠组织细胞的荧光染色视野图，图5C为成年小鼠小肠组织细胞的合并视野图；(绿色代表活细胞，红色代表死细胞)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明所用试剂配方：
1.组织清洗液的配方为：137mM NaCl，5.4mM KCl，0.3mM Na2HPO4·2H2O，0.4mMKH2PO4，5.6mM葡萄糖，4.2mM NaHCO3，pH 7.4，溶剂为水。
2.红细胞裂解液的配方为:150mM NH4Cl，10mM KHCO3和0.1mM EDTA，pH 7.4，溶剂为水(分子生物学级别)。
3.分散酶的配方为：Dispase II，sigma，pH 7.5，溶剂为HEPES-KOH。
组织的获取：分别取成年小鼠和胚胎小鼠的不同组织(见下述实施例)器官，取适当的大小放入1.5ml的EP管中，加入少量的上述组织清洗液，用剪刀将组织剪成小碎块。然后加入1ml的上述组织清洗液进行清洗，静置1min，待组织自然沉降后弃掉上清，重复清洗3次，获得清洗后的组织碎块。
单细胞悬液的制备：
1.将上述清洗后的组织碎块转移至15ml的离心管内，加入3ml的混合酶Ⅰ(0.1％胶原酶(Collagenase)Ⅱ和0.1％CollagenaseⅣ)，在转速为80rpm，温度为37℃恒温摇床上消化5min；
2.将离心管静置1min，待剩余组织碎块自然沉降后，取出上清转移至新的15ml的离心管；
3.将上一步骤的剩余的组织碎块再加入3-5ml的上述混合酶Ⅰ，在转速为80rpm温度为37℃恒温摇床上消化15-30min(根据实施例中实际情况决定消化时间，15min时取少量消化液的上清在显微镜下观察)；
4.将2)和3)中的细胞上清液合并，并加入0.06％的上述分散酶后混匀，放入37℃水浴锅继续消化5min，加入1％FBS作为保护剂并置于冰上，用70μm的滤网进行过滤，转移至新的50ml离心管；
6.300-350g离心机4℃离心3-4min，弃掉上清，沉淀用500μl的1×红细胞裂解液重悬，冰上放置2-5min，加入10倍体积的预冷PBS进行终止(红细胞裂解液的量和裂红的时间根据实施例中的实际情况来决定)；
7.300-350g离心机4℃离心3min，弃掉上清，加入5ml预冷的PBS重悬；
8.300-350g离心机4℃离心3min，弃掉上清，用一定量预冷的PBS对沉淀进行重悬，并通过40μm的滤网过滤到新的1.5ml的EP管或者15ml的离心管内；
9.利用AO/PI染色统计细胞的活性和浓度等数据。
实施例1E18胚胎小鼠皮肤组织的解离
1.取新鲜胚胎小鼠的皮肤组织放入1.5ml的EP管中，并加入少许的上述组织清洗液，剪刀剪成碎块6-9mm3，并加入1ml的上述组织清洗液进行清洗，静置1min待组织碎块自然沉降后弃去上清，重复3次，获得清洗后的皮肤组织碎块；
2.将上述清洗后的皮肤组织碎块转移至15ml的离心管内，加入3ml的上述混合酶Ⅰ，在转速为80rpm，温度为37℃恒温摇床上消化5min；
3.将离心管静置1min，待剩余组织碎块自然沉降后，取出上清转移至新的15ml的离心管，获得消化液A1，置于冰上；
4.将上一步骤的剩余的组织碎块再加入5ml的混合酶Ⅰ，在转速为80rpm温度为37℃恒温摇床上消化15min，获得消化液B1，置于冰上；
5.将步骤3和4中获得的消化液A1和消化液B1混合在一起，加入0.06％的上述分散酶后混匀，放入37℃水浴锅继续消化5min后，加入1％FBS作为保护剂并置于冰上，用70μm的滤网进行过滤，转移至新的50ml离心管；
6.350g离心机4℃离心3min，弃掉上清，沉淀用1ml的1×红细胞裂解液重悬，冰上放置2min，加入9ml的预冷PBS进行终止；
7.350g离心机4℃离心3min，弃掉上清，加入5ml预冷的PBS重悬；
8.350g离心机4℃离心3min，弃掉上清，用1ml预冷的PBS对沉淀进行重悬，并通过40μm的滤网过滤到新的1.5ml的EP管内；
9.利用AO/PI染色统计细胞的活性和浓度等数据。
结果如表1以及图1A、图1B和图1C所示。E18胚胎小鼠皮肤组织细胞的明场视野图如图1A所示，E18胚胎小鼠皮肤组织细胞的荧光染色视野图如图1B所示，E18胚胎小鼠皮肤组织细胞的合并视野图如图1C所示。
表1E18胚胎小鼠皮肤组织解离后的数据
组织类型 细胞浓度(个/μl) 重悬体积(μl) 细胞活性 结团率
皮肤 1070 1000 90.07％ 5.56％
实施例2成年小鼠肝组织的解离
1.取新鲜成年小鼠的肝组织放入1.5ml的EP管中，并加入少许的上述组织清洗液，剪刀适度剪碎6-9mm3，并加入1ml的上述组织清洗液进行清洗，静置1min待组织碎块自然沉降后弃去上清，重复3次，获得清洗后的肝组织碎块；
2.将上述清洗后的肝组织碎块转移至15ml的离心管内，加入3ml的上述混合酶Ⅰ，在转速为80rpm温度为37℃恒温摇床上消化5min；
3.将离心管静置1min，待剩余组织碎块自然沉降后，取出上清转移至新的15ml的离心管，获得消化液A2，置于冰上；
4.将上一步骤的剩余的组织碎块再加入5ml的混合酶Ⅰ，在转速为80rpm温度为37℃恒温摇床上消化30min，获得消化液B2，置于冰上；
5.将步骤3和4中获得的消化液A2和B2混合在一起，加入0.06％的上述分散酶后混匀，放入37℃水浴锅继续消化5min后，加入1％FBS作为保护剂并置于冰上，用70μm的滤网进行过滤，转移至新的50ml离心管；
6.300g离心机4℃离心4min，弃掉上清，沉淀用1ml的1×红细胞裂解液重悬，冰上放置4min，加入9ml的预冷PBS进行终止；
7.300g离心机4℃离心4min，弃掉上清，加入5ml预冷的PBS重悬；
8.300g离心机4℃离心4min，弃掉上清，用1ml预冷的PBS对沉淀进行重悬，并通过40μm的滤网过滤到新的1.5ml的EP管内；
9.利用AO/PI染色统计细胞的活性和浓度等数据。
结果如表2以及图2A、图2B和图2C所示。成年小鼠肝组织细胞的明场视野图如图2A所示，成年小鼠肝组织细胞的荧光染色视野图如图2B所示，成年小鼠肝组织细胞的合并视野图如图2C所示。
表2成年小鼠肝组织解离后的数据
组织类型 细胞浓度(个/μl) 重悬体积(μl) 细胞活性 结团率
肝 1290 1000 86.01％ 10.46％
实施例3成年小鼠脾脏组织的解离
1.取新鲜成年小鼠的脾脏组织放入1.5ml的EP管中，并加入少许的上述组织清洗液，将组织剪成碎块6-9mm3，并加入1ml的上述组织清洗液进行清洗，静置1min待组织碎块自然沉降后弃去上清，重复3次，获得清洗后的脾脏组织碎块；
2.将上述清洗后的脾脏组织碎块转移至15ml的离心管内，加入3ml的上述混合酶Ⅰ，在转速为80rpm温度为37℃恒温摇床上消化5min；
3.将离心管静置1min，待剩余组织碎块自然沉降后，取出上清转移至新的15ml的离心管，获得消化液A3，置于冰上；
4.将上一步骤的剩余的组织碎块再加入5ml的混合酶Ⅰ，在转速为80rpm温度为37℃恒温摇床上消化15min，获得消化液B3，置于冰上；
5.将步骤3和4中获得的消化液A3和B3混合在一起，加入0.06％的上述分散酶后混匀，放入37℃水浴锅继续消化5min后，加入1％FBS作为保护剂并置于冰上，用70μm的滤网进行过滤，转移至新的50ml离心管；
6.350g离心机4℃离心3min，弃掉上清，沉淀用1ml的1×红细胞裂解液重悬，冰上放置5min，加入9ml的预冷PBS进行终止；
7.350g离心机4℃离心3min，弃掉上清，加入5ml预冷的PBS重悬；
8.350g离心机4℃离心3min，弃掉上清，用3ml预冷的PBS对沉淀进行重悬，并通过40μm的滤网过滤到新的15ml的离心管内；
9.利用AO/PI染色统计细胞的活性和浓度等数据。
结果如表3以及图3A、图3B和图3C所示。成年小鼠脾脏组织细胞的明场视野图如图3A所示，成年小鼠脾脏组织细胞的荧光染色视野图如图3B所示，成年小鼠脾脏组织细胞的合并视野图如图3C所示。
表3成年小鼠脾脏组织解离后的数据
组织类型 细胞浓度(个/μl) 重悬体积(μl) 细胞活性 结团率
脾脏 1540 3000 91.99％ 3.51％
实施例4成年小鼠脑组织的解离
1.取新鲜成年小鼠的脑组织放入1.5ml的EP管中，并加入少许的上述组织清洗液，将组织剪成碎块6-9mm3，并加入1ml的上述组织清洗液进行清洗，静置1min待组织碎块自然沉降后弃去上清，重复3次，获得清洗后的脑组织碎块；
2.将上述清洗后的脑组织碎块转移至15ml的离心管内，加入3ml的上述混合酶Ⅰ，在转速为80rpm温度为37℃恒温摇床上消化5min；
3.将离心管静置1min，待剩余组织碎块自然沉降后，取出上清转移至新的15ml的离心管，获得消化液A4；
4.将上一步骤的剩余的组织碎块再加入5ml的混合酶Ⅰ，在转速为80rpm温度为37℃恒温摇床上消化30min，获得消化液B4；
5.将步骤3和4中获得的消化液A4和B4混合在一起，加入0.06％的上述分散酶后混匀，放入37℃水浴锅继续消化5min后，加入1％FBS终止反应并置于冰上，用70μm的滤网进行过滤，转移至新的50ml离心管；
6.300g离心机4℃离心4min，弃掉上清，沉淀用500μl的1×红细胞裂解液重悬，冰上放置2min，加入5ml的预冷PBS进行终；
7.300g离心机4℃离心4min，弃掉上清；
a)若无碎片，则加入5ml细胞悬浮液重悬细胞，300g离心机4℃离心4min；
b)若碎片较多。
i.加入3.1ml预冷PBS，并加入900μl碎片去除缓冲液(美天旎),颠倒混合四次，最后在液面上层轻轻补加4ml细胞悬浮液，3000g离心，4℃，10min。
ii.弃掉顶部两层含碎片的上清液，原管用细胞悬浮液补足至15ml，1000g离心，4℃，10min，弃掉上清。
8.用500μl预冷的PBS对沉淀进行重悬，并通过40μm的滤网过滤到1.5ml EP管内；
9.利用AO/PI染色统计细胞的活性和浓度等数据。
结果如表4以及图4A、图4B和图4C所示。成年小鼠脑组织细胞的明场视野图如图4A所示，成年小鼠脑组织细胞的荧光染色视野图如图4B所示，成年小鼠脑组织细胞的合并视野图如图4C所示。
表4成年小鼠脑组织解离后的数据
组织类型 细胞浓度(个/μl) 重悬体积(μl) 细胞活性 结团率
脑 1230 500 90.25％ 2.15％
实施例5成年小鼠小肠组织的解离
1.将清洗好的小肠组织放入1.5ml的EP管中，并加入少许的上述组织清洗液，将组织剪成碎块4-6mm3，并加入1ml的上述组织清洗液进行清洗，静置1min待组织碎块自然沉降后弃去上清，重复3次，获得清洗后的脑组织碎块；
2.将上述清洗后的小肠组织碎块转移至15ml的离心管内，加入3ml的上述混合酶Ⅰ，在转速为80rpm温度为37℃恒温摇床上消化5min；
3.将离心管静置1min，待剩余组织碎块自然沉降后，取出上清转移至新的15ml的离心管，获得消化液A5；
4.将上一步骤的剩余的组织碎块再加入5ml的混合酶Ⅰ，在转速为80rpm温度为37℃恒温摇床上消化30min，获得消化液B5；
5.将步骤3和4中获得的消化液A5和B5混合在一起，加入0.06％的上述分散酶后混匀，放入37℃水浴锅继续消化5min后，加入1％FBS作为保护剂并置于冰上，用70μm的滤网进行过滤，转移至新的50ml离心管；
6.350g离心机4℃离心3min，弃掉上清，沉淀用500μl的1×红细胞裂解液重悬，冰上放置3min，加入5ml的预冷PBS进行终止；
7.350g离心机4℃离心3min，弃掉上清，加入5ml预冷的PBS重悬；
8.350g离心机4℃离心3min，弃掉上清，用1ml预冷的PBS对沉淀进行重悬，并通过40μm的滤网过滤到1.5ml EP管内；
9.利用AO/PI染色统计细胞的活性和浓度等数据。
结果如表5以及图5A、图5B和图5C所示。成年小鼠小肠组织细胞的明场视野图如图5A所示，成年小鼠小肠组织细胞的荧光染色视野图如图5B所示，成年小鼠小肠组织细胞的合并视野图如图5C所示。
表5成年小鼠小肠组织解离后的数据
组织类型 细胞浓度(个/μl) 重悬体积(μl) 细胞活性 结团率
小肠 1650 1000 94.6％ 5.17％
实施例6解离条件的普适性探究
取E18小鼠的组织或器官(包括脑，小肠，肾脏，肝脏，肺，皮肤和脾脏)，用本发明的条件和通用条件分别对以上组织进行解离，如表6中的结果显示：1本发明的方法具有普适性，并且细胞活率高；2酶液的浓度和组织预处理对结果的影响很大。
表6E18小鼠组织解离统计
Figure BDA0003859551350000131

Claims (10)

1.一种组织解离的普适性方法，其特征在于，所述普适性方法包括以下步骤：
(1)将组织碎块与混合酶I混合，进行第一消化反应后分层，其中上层为上清，下层为剩余的组织碎块；所述混合酶I为0.05-0.2％胶原酶Ⅱ和0.05-0.2％胶原酶Ⅳ；
(2)取(1)中上清置于1℃-8℃的低温下例如冰水浴中，获得消化液A；
(3)取(1)中所述剩余的组织碎块与所述混合酶I混合，进行第二消化反应，获得消化液B；
(4)将消化液A、消化液B和分散酶混合，进行第三消化反应，反应终止后获得消化液C；
(5)将所述消化液C进行过滤，离心后使用缓冲液重悬。
2.如权利要求1所述的普适性方法，其特征在于，步骤(1)中，所述混合酶I的体积为3-5ml，例如3ml，和/或，所述混合酶I为0.1％胶原酶Ⅱ和0.1％胶原酶Ⅳ；
和/或，步骤(1)中，所述组织碎块和混合酶I的重量体积比为(10-25):1，优选为20:1；所述重量体积比的单位为mg/ml；
和/或，步骤(3)中，所述混合酶I的体积为3-5ml，例如5ml；
和/或，步骤(4)中，所述分散酶为0.01-0.1％DispaseII，优选为0.06％Dispase II。
3.如权利要求1或2所述的普适性方法，其特征在于，步骤(5)中，所述离心后加入红细胞裂解液再进行重悬；
优选地，所述红细胞裂解液的体积为1-2ml，例如1ml；和/或，所述红细胞裂解液包括150mM NH4Cl，10mM KHCO3和0.1mM EDTA，pH 7.4。
4.如权利要求1所述的普适性方法，其特征在于，
所述第一消化反应、第二消化反应以及第三消化反应均在震荡中进行，所述震荡的转速为50-100rpm，例如为80rpm；
和/或，所述第一消化反应、第二消化反应以及第三消化反应的温度为4-37℃，例如为37℃；
和/或，所述第一消化反应以及第三消化反应的时间为5-15min，例如为5min；所述第二消化反应的时间为15-30min，例如为15min。
5.如权利要求1所述的普适性方法，其特征在于，
步骤(1)中，所述分层在静置下使剩余的组织碎块自然沉降下发生，例如静置1min；
和/或，步骤(4)中，所述终止的条件为降温孵育例如冰上孵育；
优选地，所述终止时还可以加入保护剂例如为胎牛血清；更优选地，所述胎牛血清的浓度为10％。
6.如权利要求1所述的普适性方法，其特征在于，步骤(5)中：
所述过滤使用滤网进行，所述滤网的网眼尺寸优选为50-100μm，例如70μm；
和/或，所述离心的离心力为300-350g；
和/或，所述离心的时间为5-10min，优选为5min；
和/或，所述离心的温度为1-8℃，优选为4℃；
和/或，所述缓冲液为PBS或PBS+BSA，优选为PBS，更优选为预冷的PBS；
和/或，所述缓冲液的体积为1-5ml，所述重悬进行一至多次，优选为三次。
7.如权利要求1所述的普适性方法，其特征在于，还包括在步骤(1)前，用组织清洗液清洗组织碎块，分层后获得下层处理后的组织碎块的步骤；所述组织清洗液包括：137mMNaCl，5.4mM KCl，0.3mM Na2HPO4·2H2O，0.4mM KH2PO4，5.6mM葡萄糖，4.2mM NaHCO3，pH7.4，溶剂为水；所述组织碎块的尺寸为6-9mm3；
优选地，所述分层在静置下使清洗后的组织碎块自然沉降下发生，例如静置1min；和/或，所述清洗重复一至三次，例如三次。
8.如权利要求1所述的普适性方法，其特征在于，所述组织碎块来自小鼠或胚胎鼠；
优选地，所述组织碎块来自胚胎小鼠的脑、心脏、肺、肝、胃、肾、脾、小肠和皮肤组织，和/或，成体小鼠的肺、脑、肝、肾、脾、小肠和心脏组织；
更优选地，所述组织碎块来自E18胚胎小鼠皮肤组织、成年小鼠肝组织和/或成年小鼠脾脏组织。
9.一种用于解离组织细胞的解离液组合，其特征在于，所述解离液组合包括由0.05-0.2％胶原酶Ⅱ和0.05-0.2％胶原酶Ⅳ组成的混合酶I；
优选地，所述解离液组合还包括0.01-0.1％分散酶和/或红细胞裂解液；
更优选地，所述混合酶I为0.1％胶原酶Ⅱ和0.1％胶原酶Ⅳ，所述分散酶为0.06％Dispase II。
10.如权利要求9所述的解离液组合在制备解离组织的试剂中的应用。
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