CN109022420B - 一种基于磁珠的dna提取方法、裂解液及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁珠的DNA提取方法、裂解液及试剂盒。所述裂解液钠离子含量大于或等于140mmol的pH值在7至9的缓冲液中含有3mol/L至6mol/L离液剂、5mmol至20mmol的金属螯合剂、以及质量分数在5％至15％的聚乙二醇。所述提取方法包括以下步骤：(1)获得裂解反应体系；(2)裂解反应体系；(3)加入纳米磁珠；(4)获得结合有DNA的磁珠；(5)洗涤后进行DNA洗脱。所述试剂盒包括裂解液、蛋白酶K溶液、磁珠分散液、第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液、以及洗脱液。本发明试剂无毒，提高了实验安全性；只需要一部加液操作，人工成本大幅降低。
Description
技术领域
本发明属于核酸提取领域，更具体地，涉及一种基于磁珠的DNA提取方法及裂解液。
背景技术
DNA提取方法，是DNA监测的基础，有着重要的应用前景，目前DNA提取的生物样本采用毛发根部、口腔上皮细胞等等；口腔上皮细胞是由多层细胞组成，基底层细胞能不断分裂增生，以补充表层衰老或损伤脱落的细胞，具有较强的再生能力，代谢旺盛，且易脱落，上皮细胞与其他类型细胞一样具有完整的基因组DNA。提取口腔上皮细胞是一种简单，无创伤，无疼痛的取样方式，适用各个年龄阶段的人群。因此常成为疾病诊断，科研的实验材料
传统DNA提取方法，多采用酚氯仿等有机试剂进行抽提，该方法存在有机试剂污染，甚至毒害的危险，且有收获效率不高，纯度不够等缺点。而离心柱法(过柱法)通过离心柱上的某些基团与DNA进行结合，从而得到DNA的方法，该方法极大的提搞了口腔拭子提取DNA的浓度和纯度。但需要在EP管中操作，需要反复离心清理后方可获得DNA产物，操作过程繁琐，无法做到批量化生产。而利用磁珠的化学基团对DNA的提议性吸附和解吸附，在外加磁场的作用下，快速的与母液分离，这种方法快速简单，且易于商业化，但大多数试剂盒在操作过程中需要加入异丙醇作为结合液，因此没有办法做到完全机械化处理，需要较多人为参与，费时费力。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种基于磁珠的DNA提取方法、裂解液及试剂盒，其目的在于采用PEG取代异丙醇作为结合液，添加到裂解液中，优化DNA提取的实验步骤，并且设计了相应试剂盒，实现一次加液操作完成DNA提取全过程，实现全程机械化处理，适合现有的磁珠法DNA提取仪，由此解决现有的基于磁珠的DNA提取方法不能实现完全机械化处理、费时费力的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于基于磁珠的DNA提取方法的裂解液，其特征在于，钠离子含量大于或等于140mmol的pH值在7至9的缓冲液中含有3mol/L至6mol/L离液剂、5mmol至20mmol的金属螯合剂、以及质量分数在5％至15％的聚乙二醇。
优选地，所述裂解液，其所述聚乙二醇分子量大于等于2000，优选为6000至10000，更优选为8000。
优选地，所述裂解液，其所述离液剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或多种的组合。
按照本发明的另一个方面，提供了一种基于磁珠的DNA提取方法，包括以下步骤：
(1)将生物样本与预混有蛋白酶K的如权利要求1或2所述的裂解液按照体积比1:1～2混匀，获得裂解反应体系；
(2)将步骤(1)中获得的裂解反应体系加热至裂解温度处理30分钟至60分钟，进行裂解获得裂解后的裂解反应体系；
(3)将步骤(2)中获得的裂解后的反应体系，加入纳米磁珠，其中每毫升加入2mg至5mg的纳米磁珠获得结合反应体系；
(4)将步骤(3)中获得的结合反应体系结合处理10分钟以上，期间保持纳米磁珠均匀分散，磁力分离获得结合有DNA的磁珠；
(5)将步骤(4)中获得的结合有DNA的磁珠洗涤后进行DNA洗脱，获得生物样本DNA。
优选地，所述基于磁珠的DNA提取方法，其步骤(1)所述生物样本与所述裂解液按照体积比1:1混匀。
优选地，所述基于磁珠的DNA提取方法，其所述步骤(2)所述裂解温度为56℃至65℃，优选65℃。
优选地，所述基于磁珠的DNA提取方法，其所述步骤(3)每毫升加入3mg的纳米磁珠。
优选地，所述基于磁珠的DNA提取方法，其步骤(4)所述保持纳米磁珠均匀分散具体如下：
每3分钟至5分钟，将结合反应体系震荡混匀。
按照本发明的另一个方面，提供了一种配合磁棒法核酸自动化提取仪的试剂盒，按照体积份数包括，40份至60份本发明提供的裂解液、1份至3份浓度在10mg/ml至30mg/ml之间的蛋白酶K溶液、16份至20份浓度在80mg/ml至100mg/ml之间的磁珠分散液、60份至100份第一洗涤液、100份至140份第二洗涤液、100份至140份第三洗涤液、以及6份至20份洗脱液；
所述第一洗涤液pH值在7.8-8.5之间，含有100-250mmol/L NaCl、5-20mmol/lEDTA、10-30mmol/l Tris、质量分数1-4％Triton、以及质量分数0.4-2％的SDS；
所述第二洗涤液含有100-250mmol/L NaCl、以及质量分数70-85％的酒精；
所述第三洗涤液pH值在7.0-8.0之间，含有10-30mmol/L Tris、以及质量分数70-85％的酒精。
优选地，所述试剂盒，其包括本发明提供的裂解液200-300ul、浓度在10mg/ml至30mg/ml之间的蛋白酶K溶液5-15ul、浓度在4mg/ml至8mg/ml之间的磁珠分散液400-600ul、第一洗涤液300-500ul、第二洗涤液500-700ul、第三洗涤液500-700ul、以及洗脱液30-100ul；
所述第一洗涤液，pH值为8.0，含有200mmol/L NaCl、10mmol/l EDTA、25mmol/lTris，质量分数1％Triton，质量分数0.5％的SDS；
所述第二洗涤液含有200mmol/L NaCl、以及质量分数75％酒精；
所述第三洗涤液pH值为7.5，含有10mmol/L Tris、以及质量分数75％酒精。
所述洗脱液含有10mmol/L Tris-HCl、以及1mmol/L EDTA。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明提供的用于DNA核酸提取的裂解液，采用聚乙二醇替代异丙醇作为结合剂，可以加入到裂解液中，取代了原本裂解液和结合液两者的功能，减少了加液操作步骤。并且裂解液配方中试剂无毒，提高了实验安全性。
本发明提供的基于磁珠法的DNA提取方法，只需要一部加液操作，人工成本大幅降低，尤其是适用于核酸自动提取仪，能全流程机械化操作，无需人工看顾，适合批量提取。
本发明提供的试剂盒，可配合本发明提供的基于磁珠法的DNA提取方法，使用方便、安全性高。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的DNA提取结果图；
图2是本发明实施例2提供的DNA提取结果图；
图3是本发明实施例3提供的DNA提取结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的用于基于磁珠的DNA提取方法的裂解液，为pH值在7至9的缓冲液，其中钠离子含量大于或等于140mmol，含有3mol/L至6mol/L离液剂、5mmol至20mmol的金属螯合剂、以及质量分数在5％至15％的聚乙二醇。所述聚乙二醇分子量大于等于2000，优选为6000至10000，更优选为8000。所述离液剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或多种的组合。优选还包括表面活性剂，例如Triton、SDS。
本发明采用聚乙二醇作为结合液，取代异丙醇，一方面用无毒试剂取代有毒试剂提高了实验安全性，另一方面聚乙二醇可以添加在裂解液中，将两次加液操作合并为一次完成，减少了实验操作，尤其是减少了人工加液操作，使得整个基于磁珠的DNA提取方法具备了完全机械化的可能。
同时为了配合聚乙二醇作为结合液选择，降低裂解液毒性，优化了裂解液配方，不使用苯酚、氯仿等有毒试剂，同时优化后的配方无需对生物样本进行预处理，取得了更好的效果。
采用本发明提供的裂解液机型基于磁珠的DNA提取方法，包括以下步骤：
(1)将生物样本与预混有蛋白酶K的如权利要求1或2所述的裂解液按照体积比1:1～2混匀，获得裂解反应体系；优选所述生物样本与所述裂解液按照体积比1:1混匀；裂解反应体系中蛋白酶K含量在100-300ug之间。具体可采用磁珠法核酸自动化提取仪进行操作，如下：
按照预设比例在添加有生物样本的样品孔中加入所述裂解液和蛋白酶K溶液，置于核酸自动化提取仪的工位上。
(2)将步骤(1)中获得的裂解反应体系加热至裂解温度处理30分钟至60分钟，进行裂解获得裂解后的裂解反应体系；优选所述裂解温度为56℃至65℃，优选65℃。
(3)将步骤(2)中获得的裂解后的反应体系，加入纳米磁珠，其中每毫升加入2mg至5mg的纳米磁珠获得结合反应体系；优选，每毫升加入3mg的纳米磁珠。
(4)将步骤(3)中获得的结合反应体系结合处理10分钟以上，期间保持纳米磁珠均匀分散，磁力分离获得结合有DNA的磁珠；优选，所述保持纳米磁珠均匀分散具体如下：
每3分钟至5分钟，将结合反应体系震荡混匀。
(5)将步骤(4)中获得的结合有DNA的磁珠洗涤后进行DNA洗脱，获得生物样本DNA。
当采用磁珠法核酸自动化提取仪时，步骤(2)至(5)均可由核酸提取仪设置参数自动完成。
本发明提供的配合磁棒法核酸自动化提取仪的试剂盒，按照体积份数包括，40份至60份本发明提供的裂解液、1份至3份浓度在10mg/ml至30mg/ml之间的蛋白酶K溶液、16份至20份浓度在4mg/ml至8mg/ml之间的磁珠分散液、60份至100份第一洗涤液、100份至140份第二洗涤液、100份至140份第三洗涤液、以及6份至20份洗脱液；
优选方案，包括本发明提供的裂解液200ul至300ul、浓度在10mg/ml至30mg/ml之间的蛋白酶K溶液5ul至15ul、浓度在4mg/ml至8mg/ml之间的磁珠分散液400ul至600ul、第一洗涤液300ul至500ul、第二洗涤液500ul至700ul、第三洗涤液500ul至700ul、以及洗脱液30ul至100ul；
所述第一洗涤液pH值在7.8-8.5之间，含有100mmol/L至250mmol/L NaCl、5mmol/L至20mmol/L EDTA、10mmol/L至30mmol/L Tris、质量分数1％至4％Triton、以及质量分数0.4％至2％的SDS；
所述第二洗涤液含有100mmol/L至250mmol/L NaCl、以及质量分数70-85％的酒精；
所述第三洗涤液pH值在7.8-8.5之间，含有10mmol/L至30mmol/L Tris、以及质量分数70％至85％的酒精。
所述洗脱液含有8mmol/L至30mmol/L Tris-HCl、以及0.5mmol/L至2mmol/L EDTA。
以下为实施例：
实施例1
一种配合磁棒法核酸自动化提取仪的试剂盒，包括裂解液200ul、浓度10mg/ml的蛋白酶K溶液15ul、浓度4mg/ml之间的磁珠分散液600ul、第一洗涤液400ul、第二洗涤液500ul、第三洗涤液500ul、以及洗脱液30ul；
所述裂解液pH值为7的缓冲液，含有NaCl140mmol、3mol/L离液剂、5mmol的EDTA、以及质量分数5％的聚乙二醇6000、质量分数2％Triton。所述离液剂为盐酸胍。
所述磁珠分散液中磁珠粒径400mm。
所述第一洗涤液pH值为7.8，含有100mmol/L NaCl、5mmol/l EDTA、10mmol/lTris、质量分数0.5％Triton、以及质量分数0.4％的SDS；
所述第二洗涤液含有100mmol/L NaCl、以及质量分数70％的酒精；
所述第三洗涤液pH值为7.0，含有8mmol/L Tris、以及质量分数70％的酒精。
所述洗脱液含有8mmol/L Tris-HCl、以及0.5mmol/L EDTA。
应用所述试剂盒、采用磁珠法核酸自动提取仪，进行口腔上皮细胞、唾液DNA自动提取，具体方法如下：
口腔上皮细胞生物样本采集及处理：
将采集有口腔上皮细胞的口腔拭子保存于保护液中，充分震荡混匀，得到生物样本；吸取100μL至深孔板对应的空孔位中
(1)将生物样本与预混有蛋白酶K的所述裂解液按照体积比1:2混匀，获得裂解反应体系。具体可采用磁珠法核酸自动化提取仪进行操作，如下：
每个样品孔中加入200μL裂解液，15μL蛋白酶K，然后将深孔板置于S-96核酸自动化提取仪工位1上。为保证裂解质量，可提前将裂解液置于80℃提前预热。
(2)将步骤(1)中获得的裂解反应体系加热至裂解温度处理30分钟，进行裂解获得裂解后的裂解反应体系；优选所述裂解温度为56℃。
(3)将步骤(2)中获得的裂解后的反应体系，加入纳米磁珠，其中每毫升加入2.4mg的纳米磁珠获得结合反应体系。
(4)将步骤(3)中获得的结合反应体系结合处理10分钟，期间保持纳米磁珠均匀分散，每3分钟至5分钟，将结合反应体系震荡混匀，磁力分离获得结合有DNA的磁珠。
(5)将步骤(4)中获得的结合有DNA的磁珠洗涤后进行DNA洗脱，获得生物样本DNA。
(6)抛弃磁珠。
采用磁珠法核酸自动化提取仪时，步骤(2)至(5)均可由核酸提取仪设置参数自动完成，具体如下：
打开仪器电源，待仪器完成自检后，按如下表所示，设置仪器参数。运行程序，待第一步裂解完成后，仪器会自动暂停。用8道或12道移液器将磁珠(600μL/孔)、第一洗涤液(400μL/孔)、第二和第三洗涤液(500μL/孔)以及洗脱液(30μL/孔)分别分装至5个新的深孔板中，然后置于工位2～6上，开始运行程序。
具体参数设置如下表：
裂解温度：80℃，洗脱温度：65℃，4℃保存：30min
本实施例提取结果，如图1所示，跑样结果条带清晰，亮度一致性高，说明提取过程DNA几乎没有降解，且纯度较高。
实施例2
一种配合磁棒法核酸自动化提取仪的试剂盒，包括裂解液300ul、浓度20mg/ml的蛋白酶K溶液10ul、浓度6mg/mL之间的磁珠分散液500ul、第一洗涤液500ul、第二洗涤液600ul、第三洗涤液600ul、以及洗脱液50ul；
所述裂解液pH值为8的缓冲液，含有NaCl140mmol、5mol/L离液剂、10mmol的EDTA、以及质量分数10％的聚乙二醇8000、质量分数2％Triton。所述离液剂为异硫氰酸胍。
所述磁珠分散液中磁珠粒径400mm。
所述第一洗涤液pH值为8.0，含有200mmol/L NaCl、10mmol/l EDTA、25mmol/lTris、质量分数1％Triton、以及质量分数0.5％的SDS；
所述第二洗涤液含有200mmol/L NaCl、以及质量分数75％的酒精；
所述第三洗涤液pH值为7.5，含有10mmol/L Tris、以及质量分数75％的酒精。
所述洗脱液含有10mmol/L Tris-HCl、以及1mmol/L EDTA。
应用所述试剂盒、采用磁珠法核酸自动提取仪，进行口腔上皮细胞DNA自动提取，具体方法如下：
口腔上皮细胞生物样本采集及处理：
将采集有口腔上皮细胞的口腔拭子保存于保护液中，充分震荡混匀，得到生物样本；吸取300μL至深孔板对应的空孔位中
(1)将生物样本与预混有蛋白酶K的所述裂解液按照体积比1:1混匀，获得裂解反应体系。具体可采用磁珠法核酸自动化提取仪进行操作，如下：
每个样品孔中加入300μL裂解液，10μL蛋白酶K，然后将深孔板置于S-96核酸自动化提取仪工位1上。为保证裂解质量，可提前将裂解液置于80℃提前预热。
(2)将步骤(1)中获得的裂解反应体系加热至裂解温度处理45分钟，进行裂解获得裂解后的裂解反应体系；优选所述裂解温度为65℃。
(3)将步骤(2)中获得的裂解后的反应体系，加入纳米磁珠，其中每毫升加入3mg的纳米磁珠获得结合反应体系。
(4)将步骤(3)中获得的结合反应体系结合处理15分钟，期间保持纳米磁珠均匀分散，每3分钟至5分钟，将结合反应体系震荡混匀，磁力分离获得结合有DNA的磁珠。
(5)将步骤(4)中获得的结合有DNA的磁珠洗涤后进行DNA洗脱，获得生物样本DNA。
(6)抛弃磁珠。
采用磁珠法核酸自动化提取仪时，步骤(2)至(5)均可由核酸提取仪设置参数自动完成，具体如下：
打开仪器电源，待仪器完成自检后，按如下表所示，设置仪器参数。运行程序，待第一步裂解完成后，仪器会自动暂停。用8道或12道移液器将磁珠(500μL/孔)、第一洗涤液(500μL/孔)、第二和第三洗涤液(700μL/孔)以及洗脱液(50μL/孔)分别分装至5个新的深孔板中，然后置于工位2～6上，开始运行程序。
具体参数设置如下表：
裂解温度：80℃；洗脱温度：65℃；4℃保存：30min
本实施例提取结果，如图2所示，跑样结果条带清晰，亮度一致性高，说明提取过程DNA几乎没有降解，且纯度较高。
实施例3
一种配合磁棒法核酸自动化提取仪的试剂盒，包括裂解液250ul、浓度30mg/ml的蛋白酶K溶液5ul、浓度8mg/ml之间的磁珠分散液400ul、第一洗涤液600ul、第二洗涤液700ul、第三洗涤液700ul、以及洗脱液100ul；
所述裂解液pH值为9的缓冲液，含有NaCl200mmol、6mol/L离液剂、20mmol的EDTA、以及质量分数15％的聚乙二醇10000、质量分数4％Triton。所述离液剂为盐酸胍。
所述磁珠分散液中磁珠粒径400mm。
所述第一洗涤液pH值为8.5，含有250mmol/L NaCl、20mmol/l EDTA、30mmol/lTris、质量分数4％Triton、以及质量分数2％的SDS；
所述第二洗涤液含有250mmol/L NaCl、以及质量分数85％的酒精；
所述第三洗涤液pH值为8.0，含有30mmol/L Tris、以及质量分数85％的酒精。
所述洗脱液含有30mmol/L Tris-HCl、以及2mmol/L EDTA。
应用所述试剂盒、采用磁珠法核酸自动提取仪，进行唾液DNA自动提取，具体方法如下：
口腔上皮细胞生物样本采集及处理：
吸取200μL唾液样本至深孔板对应的空孔位中
(1)将生物样本与预混有蛋白酶K的所述裂解液按照体积比1:1.25混匀，获得裂解反应体系。具体可采用磁珠法核酸自动化提取仪进行操作，如下：
每个样品孔中加入250μL裂解液，5μL蛋白酶K，然后将深孔板置于S-96核酸自动化提取仪工位1上。为保证裂解质量，可提前将裂解液置于80℃提前预热。
(2)将步骤(1)中获得的裂解反应体系加热至裂解温度处理30分钟，进行裂解获得裂解后的裂解反应体系；优选所述裂解温度为65℃。
(3)将步骤(2)中获得的裂解后的反应体系，加入纳米磁珠，其中每毫升加入3.2mg的纳米磁珠获得结合反应体系。
(4)将步骤(3)中获得的结合反应体系结合处理10分钟，期间保持纳米磁珠均匀分散，每3分钟至5分钟，将结合反应体系震荡混匀，磁力分离获得结合有DNA的磁珠。
(5)将步骤(4)中获得的结合有DNA的磁珠洗涤后进行DNA洗脱，获得生物样本DNA。
(6)抛弃磁珠。
采用磁珠法核酸自动化提取仪时，步骤(2)至(5)均可由核酸提取仪设置参数自动完成，具体如下：
打开仪器电源，待仪器完成自检后，按如下表所示，设置仪器参数。运行程序，待第一步裂解完成后，仪器会自动暂停。用8道或12道移液器将磁珠(400μL/孔)、第一洗涤液(600μL/孔)、第二和第三洗涤液(700μL/孔)以及洗脱液(100μL/孔)分别分装至5个新的深孔板中，然后置于工位2～6上，开始运行程序。
具体参数设置如下表：
裂解温度：80℃；洗脱温度：65℃；4℃保存：30min
本实施例提取结果，如图3所示，跑样结果条带清晰，亮度一致性高，说明提取过程DNA几乎没有降解，且纯度较高。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于磁珠的口腔上皮细胞DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将生物样本与预混有蛋白酶K的裂解液按照体积比1:1～2混匀，获得裂解反应体系；所述裂解液钠离子含量大于或等于140mmol的pH值在7至9的缓冲液中含有3mol/L至6mol/L离液剂、5mmol至20mmol的金属螯合剂、以及质量分数在5％的聚乙二醇6000；
(2)将步骤(1)中获得的裂解反应体系加热至裂解温度处理30分钟至60分钟，进行裂解获得裂解后的裂解反应体系；
(3)将步骤(2)中获得的裂解后的反应体系，加入纳米磁珠，其中每毫升加入2mg至5mg的纳米磁珠获得结合反应体系；
(4)将步骤(3)中获得的结合反应体系结合处理10分钟以上，期间保持纳米磁珠均匀分散，磁力分离获得结合有DNA的磁珠；
(5)将步骤(4)中获得的结合有DNA的磁珠洗涤后进行DNA洗脱，获得生物样本DNA。
2.如权利要求1所述的基于磁珠的口腔上皮细胞DNA提取方法，其特征在于，所述离液剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或多种的组合。
3.如权利要求1所述的基于磁珠的口腔上皮细胞DNA提取方法，其特征在于，步骤(1)所述生物样本与所述裂解液按照体积比1:1混匀。
4.如权利要求1所述的基于磁珠的口腔上皮细胞DNA提取方法，其特征在于，所述步骤(2)所述裂解温度为56℃至65℃。
5.如权利要求1所述的基于磁珠的口腔上皮细胞DNA提取方法，磁珠的口腔上皮细胞DNA提取方法，其特征在于，步骤(2)所述裂解温度为65℃。
6.如权利要求1所述的基于磁珠的口腔上皮细胞DNA提取方法，其特征在于，所述步骤(3)每毫升加入3mg的纳米磁珠。
7.如权利要求1所述的基于磁珠的口腔上皮细胞DNA提取方法，其特征在于，步骤(4)所述保持纳米磁珠均匀分散具体如下：
每3分钟至5分钟，将结合反应体系震荡混匀。
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