CN110295162B - 一种针对土壤铁锰结核微生物的dna提取试剂和提取方法 - Google Patents

一种针对土壤铁锰结核微生物的dna提取试剂和提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种针对土壤铁锰结核微生物的DNA提取试剂和提取方法，该试剂包括清洗液、裂解液、洗涤液和洗脱液；清洗液含有Tris和EDTA，pH值为6～7；裂解液含有NaCl、Tris、柠檬酸钠、CaCl2和EDTA，pH值6～7；洗涤液含有NaCl和Tris，pH值6～7；洗脱液是灭菌双蒸水，pH值6～7。本发明提供的试剂和方法可成功提取稻田及甘蔗地来源铁锰结核DNA，提取出的DNA完整度高，电泳条带主要在15000bp以上。对提取出的DNA可达到对16S rRNA等基因的PCR及测序要求。

Description

一种针对土壤铁锰结核微生物的DNA提取试剂和提取方法
技术领域
本发明属于基因组提取领域，具体涉及一种针对土壤铁锰结核微生物的DNA提取试剂和提取方法。
背景技术
土壤铁锰结核是指表生过程中铁(Fe)和锰(Mn)元素经过强烈迁移和积聚形成的以铁锰元素为主的矿物集合体。土壤处于淹水条件时，铁锰氧化物被还原成Fe2+和Mn2+。而当土壤变干时，Fe2+、Mn2+又被氧化沉积在铁锰氧化物表面，干湿交替及氧化还原不断反复进行，最终形成铁锰结核。
铁锰结核对土壤中化学反应的平衡有重要影响，对土壤中某些营养元素和污染元素的有效性和毒性有调节作用。土壤铁锰结核是土壤中重要的新生体，是在微生物作用下形成的一定时期的土壤产物。铁锰结核土壤中存在具有铁锰元素氧化还原活性的不同细菌类群，因而是研究土壤铁锰氧化细菌群落与多样性、并且是研究这些细菌在氧化铁、氧化锰矿物形成过程中所起作用的良好材料。因此，对土壤中铁锰结核内部环境中相关功能微生物的研究具有非常重要而深远的意义。
相较于土壤复杂环境，铁锰结核内部高金属及厌氧条件下的微生物元素循环过程更接近于原始地球环境。铁锰结核被认为是研究厌氧环境金属元素循环过程的重要模式系统，其保存了最原始的参与Fe-Mn元素循环的微生物信息。全面地了解土壤铁锰结核中各种细菌(特别是与金属离子转化关系密切的微生物)丰度、种类组成及它们在金属元素转化中所起的作用，将有助于探讨土壤多金属结核成因的机理，为土壤发生过程中微生物群落的演变，及铁锰结核微生物成因提供一定的科学依据。
目前针对锰结核中微生物的研究主要集中在结核内微生物的显微观察和富集培养等方面。然而可培养的微生物只占到自然界微生物总量的1％不到。需要全面了解铁锰结核相关微生物就需要利用基于现代分子生物学技术的非培养方法，此类方法需要提取到高质量的环境DNA。后续通过16S rRNA或其它标记基因的测序及定量方法，获得相关的物种组成及丰度信息，亦或是通过对相关特定功能基因进行测序及定量，获得关键过程的微生物物种及丰富信息。
但是由于铁锰结核对PO4 3-，CO3 2-等阴离子有很强的吸附能力，对提取过程中所用溶液的离子浓度产生影响；另外铁锰结核表面或者内部都含有大量的金属离子，影响着DNA提取过程中各反应液的离子平衡；同时铁锰结核对带负电荷的核酸DNA也具有很强的吸附能力，对细胞破碎后释放的DNA回收产生了挑战。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一组针对土壤铁锰结核微生物DNA的提取试剂，本申请从铁锰结核物质组成考虑，改组试剂可以降低高浓度铁锰氧化物及各种金属离子对细胞破裂、DNA回收的影响，从而获取高质量DNA用于后续的分子生物学实验。
本发明的另一目的在于提供上述的试剂在土壤铁锰结核微生物DNA提取中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一组针对土壤铁锰结核微生物DNA的提取试剂，包括清洗液(FPCB)、裂解液(FPLB)、洗涤液(FPWB)和洗脱液(FPEB)。
所述的清洗液(FPCB)含有30～50mM Tris和3～5mM EDTA(乙二胺四乙酸)，pH值为6～7；
所述的裂解液(FPLB)含有50～100mM NaCl、100～200mM Tris、10～20mM柠檬酸钠、20～50mM CaCl2和50～100mM EDTA，pH值6～7；
所述的洗涤液(FPWB)含有100～150mM NaCl和5～10mM Tris，pH值6～7；
所述的洗脱液(FPEB)是灭菌双蒸水，pH值6～7；优选含有10～20mM Tris。
上述的一组试剂可用于土壤铁锰结核微生物DNA的提取，具体包括以下步骤：
(1)野外采集含有土壤的铁锰结核，用灭菌超纯水冲洗其表面土壤，然后放入容器中，加入清洗液冲洗若干次，直至将附着在铁锰结核表面的土壤完全去除；这一步也在EDTA的作用下清除吸附于铁锰结核表面的金属离子；冰上保存运回实验室；
(2)取经过清洗的铁锰结核，加入液氮，放置一段时间，使其脆化；然后研磨；
(3)往研磨后的铁锰结核中加入直径为0.7mm和0.15mm的石榴石(两种粒径石榴石的结合可以提高对微生物细胞壁的破碎效率)，并加入裂解液，再次研磨；然后加入溶菌酶，35～37℃水浴0.5～1.0个小时；然后再加入蛋白酶K和SDS，37℃摇床震荡0.5～1.0个小时，后放入60～65℃水浴锅中水浴1～2个小时；
步骤(3)中，铁锰结核与两种石榴石的重量比为1:(1-2):(1-2)；
(4)水浴后的溶液放入细胞破碎仪中进一步裂解细胞，然后离心，取上清液；加入与上清液相同体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，上下颠倒混匀，并震荡几十秒，再次离心，取上清液；
步骤(4)所述离心的具体参数是，4～8℃，10000～12000转/分钟，离心15～20分钟；
步骤(4)所述的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液中，苯酚、氯仿、异戊醇三者的体积比为25:24:1；
(5)加入与上清液相同体积的无水乙醇，混匀后转移至硅胶膜离心柱；加入2倍上清液体积的洗涤液，抽吸滤过，该加入清洗液和抽吸滤过的操作重复若干次；
(6)用乙醇溶液洗涤离心柱，然后将离心柱离心，甩干硅胶薄膜上的乙醇；往离心柱中加入预热的洗脱液，室温孵育几分钟，然后离心，沉淀即为水稻根表铁膜微生物的DNA；
步骤(6)所述的乙醇溶液，其体积百分比为70～75％；
步骤(6)所述离心的具体参数是，4～8℃，10000～12000转/分钟，离心2～10分钟；
步骤(6)所述的预热，优选65℃预热。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
目前仍未有针对土壤铁锰结核微生物DNA的提取方法，利用本发明提供的方法可成功提取稻田及甘蔗地来源铁锰结核DNA，提取出的DNA完整度高，电泳条带主要在15000bp以上。对提取出的DNA可达到对16S rRNA等基因的PCR及测序要求。
附图说明
图1是稻田土来源的铁锰结核实物图。
图2是稻田铁锰结核微生物DNA琼脂糖凝胶电泳结果。
图3是稻田铁锰结核微生物16S rRNA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。
图4是稻田铁锰结核微生物组成。
图5是甘蔗地来源的铁锰结核实物图。
图6是甘蔗地铁锰结核微生物DNA琼脂糖凝胶电泳结果。
图7是甘蔗地铁锰结核微生物16S rRNA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。
图8是甘蔗地铁锰结核微生物组成。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种土壤铁锰结核DNA的提取试剂，包括清洗液FMCB、裂解液FMLB、洗涤液FMWB、洗脱液FMEB。
清洗液FMCB制备：称取1.2g Tris，3g EDTA，并加入800ml去离子水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH值为7.5，加入纯化水定容至1L。
裂解液FMLB制备：称取11.7g NaCl，24.2g Tris，0.6g柠檬酸钠，1.1g CaCl2，14.6g EDTA，并加入800ml去离子水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH值为8.0，加入去离子水定容至1L。
洗涤液FMWB制备：称取9.84g NaCl粉末，并加入800ml去离子水，取10ml 1M Tris溶液，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH值为8.0，加入去离子水定容至1L。
洗脱液FMEB：取10ml 1MTris溶液至于容器中，并加入800ml去离子水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH值为8.0，加纯化水定容至1L。
溶菌酶反应液(50mg/m L)的制备：称取5g溶菌酶加入溶菌酶缓冲液(成分为Tris-HCl缓冲液(pH值8.0)定容至10ml，制成50mg/ml溶液。
蛋白酶反应液的制备：称取20g蛋白酶K粉加入蛋白酶K缓冲液(成分为Tris-HCl缓冲液(pH值8.0)定容至100ml，制成20mg/ml溶液。
实施例2
提取稻田土铁锰结核基因组DNA，PCR扩增16S rRNA基因，高通量测序鉴定微生物群落组成。采用实施例1提供的提取试剂进行提取，共15个稻田来源的铁锰结核样品，步骤如下：
(1)从水稻田中采集铁锰结核，用灭菌超纯水冲洗表面土壤后，FMCB清洗液多次冲洗铁锰结核，直至将附着在铁锰结核表面的土壤完全去除。这一步也在EDTA的作用下清除吸附于铁锰结核表面的金属离子。稻田土来源的铁锰结核见图1。
(2)将铁锰结核保存于50ml离心管中，冰上运输回实验室后，后将铁锰结核保存于-70度冰箱长期保存。
(3)DNA提取前，称取10g铁锰结核冻于液氮中30分钟，使其脆化。
(4)将铁锰结核用研钵磨碎，期间多次加入液氮，保持冷冻状态，进行多次磨碎。
(5)加入5g直径0.7mm以及5g直径0.15mm的石榴石以及10ml FMLB裂解，再次充分研磨5分钟。
(6)以上溶液转移到50ml离心管中，加入2mL溶菌酶反应液(50mg/mL)，37℃水浴2小时，加入1mL蛋白酶K(20mg/mL)和10mL 1.16mol/L SDS(十二烷基硫酸钠)继续37℃摇床震荡1小时后放入65℃水浴锅中，每隔10分钟拿出震荡一次，持续1小时。
(7)以上含有反应液的50ml离心管放入Fastprep-24破碎仪(美国MP公司)(5挡，破碎1分钟)进一步裂解细胞。
(8)50ml离心管4℃，10000转/分钟，离心15分钟后，上清转入新的50ml离心管中。
(9)按1:1的体积比加入苯酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)，上下颠倒，并震荡30秒后，4℃，10000转/分钟，离心15分钟后，上清转入新的50ml离心管中。
(10)按1:1的体积比加入100％乙醇，用真空泵结合PowerVacTMManifold MiniSystem系统(MOBIO公司)进行抽吸滤过，将以上混合液过滤到2ml硅胶膜离心柱(Omega公司)。
(11)加入750μl FMWB清洗液后，进行抽吸滤过。此步反复进行三次。
(12)用75％的乙醇清洗一次后，将离心柱置于4℃，10000转/分钟，离心5分钟，甩干硅胶薄膜上的酒精。
(13)加入100μl 65℃预热的洗脱液FMEB，室温孵育离心柱滤膜5分钟后，4℃，10000转/分钟，离心2分钟，收集DNA。
(14)DNA用水平电泳及Nanodrop检测DNA的质量及浓度。稻田铁锰结核DNA提取浓度及总量见表1。稻田铁锰结核DNA琼脂糖凝胶电泳结果见图2。DNA保存于-70度。
表1.稻田铁锰结核微生物DNA提取浓度及总量。
Figure BDA0002096187600000061
(15)取1μl DNA为模板，扩增16S rRNA基因的V4区。515F(5’-GTG CCA GCM GCCGCG GTA A-3’)+806R(5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’)为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系总体积为50μl，反应体系的组成为：各1μl上下游引物(浓度10M),2μl 10×ExTag反应液(上海大连宝生物公司),1μl(0.5U)的ExTag酶(上海大连宝生物公司),2μl dNTPs(2.5mM),以及5μl灭菌水。PCR程序为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，重复变性、退火、延伸步骤共28个循环，然后72℃继续延伸8min。稻田铁锰结核16S rRNA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图3。
(16)16S rRNA基因的PCR产物经Cycle Pure Kit试剂盒(Omega公司)纯化后，送到深圳易科吉生物有限公司进行高通量测序，所用仪器为Ilumina公司的HiSeq2500测序仪。
(17)获取的16S rRNA序列进行原始的质量控制后，在QIIME中分析微生物的物种组成信息。稻田铁锰结核微生物组成见图4。
利用本发明提供的方法获取的稻田铁锰结核微生物DNA，完成度较高，电泳条带在15000bp以上，能成功用于16S rRNA的PCR及后续的高通量测序。PCR条带主带明显，大小在500bp左右，表明DNA杂质少。对16S rRNA的高通量测序结果显示了稻田铁锰结核微生物组成多样性高，表明发明提供的方法广泛适用于稻田来源的铁锰结核微生物DNA提取
实施例3
提取甘蔗地铁锰结核微生物基因组DNA，PCR扩增16S rRNA基因，高通量测序鉴定微生物群落组成。采用实施例1提供的提取试剂进行提取，共15个甘蔗地来源的铁锰结核样品，步骤如下：
(1)从甘蔗地中采集铁锰结核，用灭菌超纯水冲洗表面土壤后，FMCB清洗液多次冲洗铁锰结核，直至将附着在铁锰结核表面的土壤完全去除。这一步也在EDTA的作用下清除吸附于铁锰结核表面的金属离子。甘蔗地来源的铁锰结核见图5。
(2)将铁锰结核保存于50ml离心管中，冰上运输回实验室后，后将铁锰结核保存于-70度冰箱长期保存。
(3)DNA提取前，称取10g铁锰结核冻于液氮中30分钟，使其脆化。
(4)将铁锰结核用研钵磨碎，期间多次加入液氮，保持冷冻状态，进行多次磨碎。
(5)加入5g直径0.7mm以及5g直径0.15mm的石榴石以及10ml FMLB裂解，再次充分研磨5分钟。
(6)以上溶液转移到50ml离心管中，加入2mL溶菌酶反应液(50mg/mL)，37℃水浴2小时，加入1mL蛋白酶K(20mg/mL)和10mL 1.16mol/L SDS继续37℃摇床震荡1小时后放入65℃水浴锅中，每隔10分钟拿出震荡一次，持续1小时。
(7)以上含有反应液的50ml离心管放入Fastprep-24破碎仪(美国MP公司)(5挡，破碎1分钟)进一步裂解细胞。
(8)50ml离心管4℃，10000转/分钟，离心15分钟后，上清转入新的50ml离心管中。
(9)按1:1的体积比加入苯酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)，上下颠倒，并震荡30秒后，4℃，10000转/分钟，离心15分钟后，上清转入新的50ml离心管中。
(10)按1:1的体积比加入100％乙醇，用真空泵结合PowerVacTMManifold MiniSystem系统(MOBIO公司)进行抽吸滤过，将以上混合液过滤到2ml硅胶膜离心柱(Omega公司)。
(11)加入750μl FMWB清洗液后，进行抽吸滤过。此步反复进行三次。
(12)用75％的乙醇清洗一次后，将离心柱置于4℃，10000转/分钟，离心5分钟，甩干硅胶薄膜上的酒精。
(13)加入100μl 65℃预热的洗脱液FMEB，室温孵育离心柱滤膜5分钟后，4℃，10000转/分钟，离心2分钟，收集DNA。
(14)DNA用水平电泳及Nanodrop检测DNA的质量及浓度。甘蔗地铁锰结核微生物DNA提取浓度及总量见表2。甘蔗地铁锰结核微生物DNA琼脂糖凝胶电泳结果见图6。
表2.甘蔗地铁锰结核微生物DNA提取浓度及总量。
Figure BDA0002096187600000091
(15)DNA保存于-70度。
(16)取1μl DNA为模板，扩增16S rRNA基因的V4区。515F(5’-GTG CCA GCM GCCGCG GTA A-3’)+806R(5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’)为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系总体积为50μl，反应体系的组成为：各1μl上下游引物(浓度10μM),2μl 10×Extag反应液(上海大连宝生物公司),1μl(0.5U)的ExTag酶(上海大连宝生物公司),2μl dNTPs(2.5mM),以及5μl灭菌水。PCR程序为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，重复变性、退火、延伸步骤共28个循环，然后72℃继续延伸5min。
(17)16S rRNA基因的PCR产物经Cycle Pure Kit试剂盒(Omega公司)纯化后，送到深圳易科吉生物有限公司进行高通量测序，所用仪器为Ilumina公司的HiSeq2500测序仪。甘蔗地铁锰结核微生物16S rRNA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图7。获取的16S rRNA序列进行原始的质量控制后，在QIIME中分析微生物的物种组成信息。甘蔗地铁锰结核微生物组成见图8。
利用本发明提供的方法获取的甘蔗地铁锰结核微生物DNA，完成度较高，电泳条带在15000bp以上，能成功用于16S rRNA的PCR及后续的高通量测序。PCR条带主带明显，大小在500bp左右，表明DNA杂质少。对16S rRNA的高通量测序结果显示了甘蔗地铁锰结核微生物组成多样性高，表明发明提供的方法广泛适用于甘蔗地来源的铁锰结核微生物DNA提取
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一组试剂在土壤铁锰结核微生物DNA提取中的应用，其特征在于包括以下步骤：
（1）野外采集含有土壤的铁锰结核，用灭菌超纯水冲洗其表面土壤，然后放入容器中，加入清洗液冲洗若干次，直至将附着在铁锰结核表面的土壤完全去除；冰上保存运回实验室；
（2）取经过清洗的铁锰结核，加入液氮，放置一段时间，使其脆化；然后研磨；
（3）往研磨后的铁锰结核中加入直径为0.7 mm和0.15mm的石榴石，并加入裂解液，再次研磨；然后加入溶菌酶，35~37oC水浴0.5~1.0个小时；然后再加入蛋白酶 K和SDS，37oC摇床震荡0.5~1.0个小时， 后放入60~65oC水浴锅中水浴1~2个小时；
（4）水浴后的溶液放入细胞破碎仪中进一步裂解细胞，然后离心，取上清液；加入与上清液相同体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，上下颠倒混匀，并震荡几十秒，再次离心，取上清液；
（5）加入与上清液相同体积的无水乙醇，混匀后转移至硅胶膜离心柱；加入2倍上清液体积的洗涤液，抽吸滤过，加入洗涤液和抽吸滤过的操作重复若干次；
（6）用乙醇溶液洗涤离心柱，然后将离心柱离心，甩干硅胶薄膜上的乙醇；往离心柱中加入预热的洗脱液，室温孵育几分钟，然后离心，沉淀即为水稻根表铁膜微生物的DNA；
所述的试剂包括清洗液、裂解液、洗涤液和洗脱液；
所述的清洗液含有30~50mM Tris和3~5 mM EDTA，pH值为6~7；
所述的裂解液含有50~100mM NaCl、100~200mM Tris、10~20mM柠檬酸钠、20~50mM CaCl2和50~100mM EDTA，pH值6~7；
所述的洗涤液含有100~150mM NaCl和5~10mM Tris，pH值6~7；
所述的洗脱液是灭菌双蒸水，含有10~20mM Tris，pH值6~7。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（3）中，铁锰结核与两种石榴石的重量比为1:(1-2) : (1-2)。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（4）所述离心的具体参数是，4~8oC，10000~12000转/分钟，离心15~20分钟。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（4）所述的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液中，苯酚、氯仿、异戊醇三者的体积比为 25:24:1。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（6）所述的乙醇溶液，其体积百分比为70~75%。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（6）所述离心的具体参数是，4~8oC，10000~12000转/分钟，离心2~10分钟。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（6）所述的预热，是65 oC预热。
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