CN103642798A - 一种矿区环境样品微生物基因组dna与总rna同时提取的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法，步骤S1：环境样品的预处理，通过离心的方法收集液体样品中的微生物或通过过滤的方法剔除固体样品中的杂质；步骤S2：细胞的破碎，将步骤S1中预处理好的样品与石英砂混合后加入液氮研磨三次，再加入pH值为7.0的PIPES抽提缓冲液和十二烷基磺酸钠溶液在65℃下裂解细胞1小时；步骤S3：核酸纯化与沉淀，裂解细胞完毕后通过离心的方法收集上清液，并向上清液中加入萃取剂离心萃取蛋白与脂类，待萃取后，上清液用异丙醇沉淀并离心获取总核酸，总核酸经过分离即可得到宏基因组DNA与总RNA。本发明具有低成本、能够同时从矿区环境样品中提取高纯度、完整性好的宏基因组DNA与总RNA的优点。
Description
技术领域
本发明涉及DNA和RNA分离技术领域，更具体的说，特别涉及一种矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法。
背景技术
对环境中微生物资源的认识、开发和利用的一个很大障碍就是难以获得纯培养。据报道，目前约99％的环境微生物因生长所需的理化条件不明确尚未被纯培养(Pace，N.R.A molecular view of microbial diversity and the biosphere.Science.276(5313)，1997：734-740)，所以环境中存在大量未知的微生物资源亟待研究与开发利用。而生物冶金的关键技术之一，就是从矿区获得耐受极端环境的高效浸矿菌种，因此，为了研究、开发和利用矿区各类微生物资源，有大量基于分子生物学的研究，如：限制性片段长度多态性分析(Yin，H.et al.Molecular diversity of16S rRNA and gyrB genes in copper mines.Arch Microbiol.189(2)，2008：101-110)、实时定量PCR技术(Han，J.S.&Kim，C.G.Microbiological monitoring of acid mine drainage treatment systems and aquatic surroundings using real-time PCR.Water Sci Technol.59(11)，2009：2083-2091)、基因芯片(Guo，X.et al.RubisCO gene clusters found in a metagenome microarray from acid mine drainage.Appl Environ Microbiol.79(6)，2013：2019-2026和Xie，J.et al.GeoChip-based analysis of the functional gene diversity and metabolic potential of microbial communities in acid mine drainage.Appl Environ Microbiol.77(3)，2011：991-999)和宏基因组测序技术(Auld，R.R.，Myre，M.，Mykytczuk，N.C.，Leduc，L.G.&Merritt，T.J.Characterization ofthe microbial acid mine drainage microbial community using culturing and direct sequencing techniques.J Microbiol Methods.93(2)，2013：108-115)等，近年相继展开，这些研究主要集中在研究有关微生物的代谢方式、基因或酶的功能、微生物群落组成及动态变化及其对环境因子的响应等方面，这些研究对认识生物冶金过程和加速其工业化起到了非常大的作用。由于这些研究手段均基于基因组DNA或mRNA的分析，且核酸质量和数量会影响数据分析的可靠性(Demeke，T.&Jenkins，G.R.Influence of DNA extraction methods，PCR inhibitors and quantification methods on real-time PCR assay of biotechnology-derived traits.Anal Bioanal Chem.396(6)，2010：1977-1990)，传统DNA与mRNA分步提取的方法会造成“时间差”，从而导致分析结果难以“同步”，而且，由于不同的研究采用了不同的核酸提取方法，而不同的提取方法又会对研究结果有影响而产生差异(Inceoglu，O.，Hoogwout，E.F.，Hill，P.&van Elsas，J.D.Effect of DNA Extraction Method on the Apparent Microbial Diversity of Soil.Appl Environ Microb.76(10)，2010：3378-3382)，导致在不同的研究之间也难以比较，因此，制定适用于矿区样品基因组DNA与总RNA同时提取的标准技术十分有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低成本、能够同时从矿区环境样品中提取高纯度、完整性好的微生物基因组DNA与总RNA的方法。
为了解决以上提出的问题，本发明采用的技术方案为：
一种矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法，包括以下步骤，
步骤S1：环境样品的预处理，通过离心的方法收集液体样品中的微生物或通过过滤的方法剔除固体样品中的杂质；
步骤S2：细胞的破碎，将步骤S1中预处理好的样品与灭菌的石英砂混 合后加入液氮研磨三次，再加入pH值为7.0的PIPES抽提缓冲液和十二烷基磺酸钠溶液在65℃下裂解细胞1小时；
步骤S3：核酸纯化与沉淀，裂解细胞完毕后通过离心的方法收集上清液，并向上清液中加入萃取剂离心萃取蛋白与脂类，待萃取后，上清液用冰冻的异丙醇或乙醇沉淀并离心获取总核酸，总核酸经过分离即可得到宏基因组DNA与总RNA。
根据本发明的一优选实施例：在所述步骤S3中还包括向经过异丙醇沉淀并离心获取的总核酸中加入2mL浓度为70％的乙醇充分洗涤，并在离心力为12000×g的条件下室温离心15min，再收集沉淀的总核酸，弃去上清液，在室温下干燥20-30min，待乙醇挥发完后，加入50-200μL的TE缓冲液溶解，即获得总核酸溶液。
根据本发明的一优选实施例：若步骤S3中所得总核酸的A260／230比值低于1.8，则可向总核酸中加入1／10体积的3M NaOAc和2.5体积无水乙醇后混匀，静置于-20℃冰箱中30min后，再在离心力为12000×g的条件下室温离心30min后收集总核酸。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S2中的PIPES抽提缓冲液的配方为，0.1M PIPES钠盐，0.1M EDTA，1.5M NaCl和1％CTAB，并且PIPES抽提缓冲液的加入量为16.5mL。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S2中的石英砂的加入量为2-5g，并且在加入后须与样品混匀混合。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S2中的十二烷基磺酸钠溶液的浓度为(质量体积比)20％，其加入量为：1.83mL。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S3中的萃取剂为氯仿和异戊醇的混合液，该氯仿和异戊醇的体积比为24∶1；并且萃取剂的加入量为与所萃取上清液的体积相等。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S3中用于沉淀上清液的异丙醇 或乙醇为100％纯度，并且异丙醇或乙醇的加入量与所沉淀上清液的体积比为0.6∶1。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S3中离心萃取蛋白与脂类的条件为在离心力为6000×g的条件下室温离心10min。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S3中离心获取总核酸的条件为在离心力为12000×g的条件下室温离心30min。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明较现有单独提取DNA与RNA的方法以及从其他样品中同时提取DNA与RNA的方法相比有以下的优点：
1、本发明能够从低pH、高重金属浓度的极端环境样品中同时提取得到高纯度、大片段的基因组DNA与总RNA；
2、本发明的样品需求量较少，当总细胞数目达到109可有效提取微克级的核酸，对于珍贵或难以取样的环境样品的核酸提取，该方法具有较大优势；
3、本发明具有广泛适用性，适用于生物反应器、不同矿区以及土壤样品中微生物基因组DNA与总RNA的同时提取；该方法能够更加广泛应用于其他环境样品的核酸同步提取，为研究、开发和利用微生物资源，提供了强有力的工具，将为微生物湿法冶金、微生物修复环境污染、微生物能源等热门研究奠定技术基础。
附图说明
图1为本发明的矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法的流程图。
图2为本发明中不同浸矿纯菌的核酸同时提取结果示意图。
图3为本发明中不同矿区样品中核酸同时提取结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一：
本实施所提供的方法成功的用于了浸矿纯菌、大冶铜矿矿坑水样、阿希金矿水样和反应器水样的基因组DNA与总RNA的同时提取。其中，所采用的纯菌样品均来自中南大学资源生物学院生物冶金教育部重点实验室菌种库中保藏的纯菌，这些细菌均分离自酸性矿坑水(pH1-3左右)，能够在较低的pH下生长，具有氧化亚铁和硫的能力，一般用于微生物湿法冶金生产中，其中，Acidithiobacillus.ferrooxidans(A.f)为嗜酸氧化亚铁硫杆菌，最适生长温度25-30℃，最适pH1.5-2，以氧化亚铁离子获取能源；Acidithilbacillus caldus(A.c)为嗜酸喜温硫杆菌，最适生长温度40-45℃，最适pH2-2.5，以还原型硫化物，单质硫为能源物质；At.albertlensis(A.t)为嗜酸中温硫杆菌，最适生长温度30℃，最适pH1.8，利用单质硫和还原型硫化物生长；Leptospirillum.ferriphilium(L.f)为嗜铁钩端螺旋菌，最适生长温度40℃，最适pH1.6，仅利用亚铁为能源物质；Ferroplasma.thermophilum(F.t)嗜热铁质古菌，最适生长温度为45℃，最适pH为1.0，该菌为化能有机营养型或化能混营养型，可以利用酵母浸出物。进行核酸提取时，所用纯菌菌液体积为200mL，菌浓约107个／mL，取自湖北大冶铜录山铜矿酸性矿坑水样5L，微生物浓度约为1.67～4.75×106个／mL；取自新疆阿希金矿的水样量约为100mL，其中，微生物浓度约1×108个／mL，取自金红石脱硅生物反应器水样量约100mL，微生物浓度约5.84×107，上述三个环境样品经离心收集微生物后用于核酸提取。核酸同时提取实验具体操作步骤如下(结合图1)：
第一步、浸矿纯菌、酸性矿坑水样、浸矿反应器液体采集后4℃离心收菌，并于-20℃以下保存；
第二步、样品与2g石英砂混匀，加入液氮冷冻样品，等液氮快挥发完 时研磨样品直至样品开始融解，并重复三次；
第三步、在以上混合物中加入16.5mL抽提缓冲液(0.1M PIPES钠盐，0.1M EDTA，1.5M NaCl和1％CTAB，pH7.0)，20％十二烷基磺酸钠(SDS)溶液1.83mL，轻混均匀，并于65℃水浴中温浴1小时，每隔15min混匀一次，并离心，再将上清液转移入新的管中；
第四步、重新加入6mL PIPES抽提缓冲液到石英砂与菌的混合物中，混匀后，加入0.67mL20％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，混匀后65℃水浴15min，在离心力为3600×g的条件下室温离心10min，上清液与第三步中上清液的合并，从而提高总核酸的提取率；
第五步、向第四步中获得的上清液中加入1倍体积的氯仿和异戊醇混合液(其体积比为24∶1)，充分混匀10min，在离心力为3600×g的条件下室温离心10min，吸取上清液转移入新管；并重复该步骤直至上清液中无杂蛋白存在；
第六步、向上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，轻混匀后，-20℃静置30min，在离心力为12000×g的条件下室温离心30min，丢弃上清液；
第七步、在沉淀物中加入2mL浓度为70％的乙醇，轻轻冲洗沉淀物，在离心力为12000×g的条件下室温离心15min，晾干乙醇，用一定体积的RNase-free水或TE缓冲液溶解混合核酸，获取总核酸，总核酸经过分离即可得到宏基因组DNA与总RNA。
在本实施例的步骤中，所有的容器经RNase喷雾清除剂处理后，在121℃，0.1MPa高温高压蒸汽灭菌30min后，用105℃烘4-8h。
以下表1分别列出了不同浸矿纯菌核酸提取质量与紫外吸收比值，表中结果显示，所提取到的核酸A260／280的比值在1.8-2.0之间，A260／230的比值在1.8-2.2之间，说明核酸质量较高，适用于后续的分子生物学操作。
表1不同浸矿纯菌核酸提取质量与紫外吸收比值
而图2显示了不同浸矿纯菌的核酸同时提取结果示意图，图中的条带依次为Acidithiobacillus.caldus(A.c)(lane1，2，3)，At.albertensis(A.t)(lane4,5,6)，Leptospirillum.ferrooxidans(L.f)(lane7,8,9)，Ferroplasma Thermophilium(F.t)(lane10，11，12)的总核酸电泳，图2显示，采用本方法能够成功的从四种纯浸矿纯菌中提取得到大片段DNA与总RNA，胶图显示，所提取到的核酸具有较高质量，适合用于进一步的分子生物学分析。
实施例二：
本实施例的方法成功的用于泥样与渣样微生物基因组DNA与总RNA的提取。其中，铜矿泥样取自大冶铜矿酸性水积水坑底部，金矿矿泥取自阿希金矿矿堆，生物反应器矿渣则为静置沉淀后，滤出上清液后所留固体渣。实施的步骤步骤基本与实施例一相同，不同之处在于：
1、取水体底泥、矿渣样品2-5g，于-70℃条件下略冷冻结块后，与5g左右的石英砂混匀，加入液氮研磨；
2、对于环境样品中革兰氏阳性菌的破壁，可在PIPES抽提缓冲液中加入溶菌酶(终浓3-4mg／mL)，轻混匀后37℃水浴30min后加入20％的SDS溶液；
3、对于核酸A260／280指标要求高的样品可进一步纯化，具体操作为加入1／10倍体积的醋酸钠溶液(3M，pH5.2)，2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀后于-20℃静置30min后离心回收总核酸。
以下表2显示了不同矿区样品核酸提取质量与紫外吸收比值，表中结果显示，所提取到的核酸A260／280的比值在1.8-2.0之间，A260／230的比值在1.8-2.2之间，说明核酸质量较高，适用于后续的分子生物学操作。
表2不同矿区样品核酸提取质量与紫外吸收比值
同时图3显示了不同矿区样品中核酸同时提取结果示意图，其中a为大冶铜矿水样(lane1，3)及渣样(lane2)总核酸电泳；b为阿希金矿水样(lane1)及渣样(lane2)总核酸电泳；c为生物反应器水样(lane1)及渣样(lane2)总核酸电泳，图3显示，采用本方法能够成功的从酸性环境样品中提取得到大片段DNA与总RNA，胶图显示，所提取到的核酸具有较高质量，适合用于进一步的分子生物学分析。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤，
步骤S1.环境样品的预处理，通过离心的方法收集液体样品中的微生物或通过过滤的方法剔除固体样品中的杂质；
步骤S2.细胞的破碎，将步骤S1中预处理好的样品与灭菌的石英砂混合后加入液氮研磨三次，再加入pH值为7.0的PIPES抽提缓冲液和十二烷基磺酸钠溶液在65℃下裂解细胞1小时；
步骤S3.核酸纯化与沉淀，裂解细胞完毕后通过离心的方法收集上清液，并向上清液中加入萃取剂离心萃取蛋白与脂类，待萃取后，上清液用冰冻的异丙醇或乙醇沉淀并离心获取总核酸，总核酸经过分离即可得到宏基因组DNA与总RNA。
2.根据权利要求1所述的矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法，其特征在于：在所述步骤S3中还包括向经过异丙醇沉淀并离心获取的总核酸中加入2mL浓度为70％的乙醇充分洗涤，并在离心力为12000×g的条件下室温离心15min，再收集沉淀的总核酸，弃去上清液，在室温下干燥20-30min，待乙醇挥发完后，加入50-200μL的TE缓冲液溶解，即获得总核酸溶液。
3.根据权利要求2所述的矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法，其特征在于：若步骤S3中所得总核酸的A260／230比值低于1.8，则可向总核酸中加入1／10体积的3M NaOAc和2.5体积无水乙醇后混匀，静置于-20℃冰箱中30min后，再在离心力为12000×g的条件下室温离心30min后收集总核酸。
4.根据权利要求1所述的矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法，其特征在于：所述步骤S2中的PIPES抽提缓冲液的配方为，0.1M PIPES钠盐，0.1M EDTA，1.5M NaCl和1％CTAB，并且PIPES抽提缓冲液的加入量为16.5mL。
5.根据权利要求1所述的矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法，其特征在于：所述步骤S2中的石英砂的加入量为2-5g，并且在加入后须与样品混匀混合。
6.根据权利要求1所述的矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法，其特征在于：所述步骤S2中的十二烷基磺酸钠溶液的浓度为(质量体积比)20％，其加入量为：1.83mL。
7.根据权利要求1所述的矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法，其特征在于：所述步骤S3中的萃取剂为氯仿和异戊醇的混合液，该氯仿和异戊醇的体积比为24∶1；并且萃取剂的加入量为与所萃取上清液的体积相等。
8.根据权利要求1所述的矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法，其特征在于：所述步骤S3中用于沉淀上清液的异丙醇或乙醇为100％纯度，并且异丙醇或乙醇的加入量与所沉淀上清液的体积比为0.6∶1。
9.根据权利要求1所述的矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法，其特征在于：所述步骤S3中离心萃取蛋白与脂类的条件为在离心力为6000×g的条件下室温离心10min。
10.根据权利要求1所述的矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法，其特征在于：所述步骤S3中离心获取总核酸的条件为在离心力为12000×g的条件下室温离心30min。
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| CN104560951A (zh) * | 2014-12-03 | 2015-04-29 | 复旦大学泰州健康科学研究院 | 一种宏基因组dna的提取方法及其试剂盒 |
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