CN108949901B

CN108949901B - 一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌的酶切方法

Info

Publication number: CN108949901B
Application number: CN201810929537.4A
Authority: CN
Inventors: 刘倩倩; 陈彬彬; 张治洲; 何宏魁; 曹润洁; 李安军
Original assignee: Harbin Institute of Technology Weihai
Current assignee: Harbin Institute of Technology Weihai
Priority date: 2018-08-15
Filing date: 2018-08-15
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2038-08-15
Also published as: CN108949901A

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌(Methanoculleus)的酶切方法，该方法包含以下步骤：(1)将窖泥中含量最高的30个优势菌属与甲烷囊菌属的16S rDNA全长序列分别进行MAFFT比对，找出各属的代表性序列2‑4个；(2)各属代表性序列的酶切分析，从中找出来甲烷囊菌16S rDNA全长序列的特征性酶切方式3‑10种；(3)在全部30个优势菌属与甲烷囊菌属的16S rDNA全长序列中逐一验证上述3‑10种特征性酶切方式。(4)经过确认的特征性酶切方式再进行实验验证。(5)最终确认至少一种甲烷囊菌16S rDNA全长序列的特征性酶切方式用于窖泥厌氧培养过程中菌落的快速鉴定。本发明可达到从窖泥厌氧菌群中快速识别甲烷囊菌属细菌的目的，比起常规测序鉴定节省大量时间。

Description

一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌的酶切方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌的酶切方法，该方法原则上可以找出若干经济方便的针对16S rDNA全长序列的限制性内切酶方案，用于把甲烷囊菌属细菌与窖泥中其他菌属的厌氧培养菌落区分开来。实际应用时与每次都进行菌落测序相比可以节约大量的时间。

背景技术

窖泥中含有丰富的微生物菌群，其中厌氧菌和兼性厌氧菌占大多数。根据实验室既有的高通量测序数据显示，Aminobacterium，Clostridium，Methanoculleus，Sedimentibacter，Syntrophomonas五个属的微生物含量在古井窖泥微生物菌群结构中排名前五。并已知Aminobacterium(胺杆菌属)，Methanoculleus(甲烷囊菌属)，Sedimentibacterr(瘤胃球菌属)是窖泥中的优质菌属，研究表明它们能够改善浓香型大曲酒的风味，提升酒产品的质量。所以研究这些菌属的培养条件、鉴定方法，提高它们在窖泥微生物群落中的含量，对酒产品质量的提升具有重要意义。

对窖泥厌氧菌的培养实验证明Methanoculleus的细菌较难培养获得，因为严格的绝对厌氧是甲烷细菌的主要特征之一。甲烷囊菌属作为窖泥中的优质菌属，研究其各种生物学特征是有意义的，而这些工作的前提是要培养鉴定出甲烷囊菌属细菌。

目前窖泥中微生物的种属主要通过16S rDNA测序来鉴定，包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。16S rRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16S rDNA就是编码该亚基的基因。目前已知甲烷囊菌对白酒发酵很重要，但是很难得到纯的甲烷囊菌，原因之一是没有从窖泥厌氧菌落中快速鉴定甲烷囊菌的方法。利用16S rDNA限制性酶切分析法从窖泥厌氧菌落中快速鉴定甲烷囊菌就是本专利要解决的科学技术问题。

利用酶切鉴定甲烷囊菌的工作目前还未有报道，本专利设计的酶切方案能够快速地从窖泥中菌群的厌氧培养菌落中识别出甲烷囊菌，将来可以应用到窖泥中的甲烷囊菌属的鉴定工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速鉴定甲烷菌菌落的酶切方法。通过对窖泥中培养得到的厌氧菌的16S rDNA进行限制性酶切分析，使甲烷囊菌属细菌16S序列的酶切结果(酶切片段的数量和大小)区别于窖泥其他属细菌的酶切结果，这样就可达到从窖泥厌氧培养生长的菌落中快速识别甲烷囊菌属细菌的目的。利用扩增16S rDNA限制性酶切片段分析法对甲烷囊菌进行快速鉴定，选择甲烷囊菌属为目标属，开展限制性酶切片段分析鉴定的研究工作。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

(1)优势菌属与甲烷囊菌属的16S rDNA全长序列分别进行MAFFT比对，找出各属代表性序列

(2)各属代表性序列的酶切分析，找出甲烷囊菌16S rDNA全长序列的特征性酶切方式并在各个菌属逐一验证，确认至少一个甲烷囊菌特征性酶切方式；

(3)通过具体实验验证种特征性酶切方式有效性，最终确认的至少一种甲烷囊菌16S rDNA全长序列的特征性酶切方式并用于窖泥厌氧培养过程中菌落的快速鉴定；

具体实施方式

1、窖泥菌群结构组成的测定及菌属核糖体RNA基因的全长DNA序列的获取

可以使用核糖体高通量RNA基因的全长DNA测序获取含量最高的前30-50名菌属，并获取各自菌属的大量核糖体RNA基因的全长DNA序列；如果没有经过上述全长高通量测序，只是使用了核糖体基因可变区的高通量测序，仍然可以获得含量最高的30-50名菌属的名单，然后通过公共数据库下载对应菌属的核糖体RNA基因的全长DNA序列也可以。一般要求每个菌属随机下载至少100条核糖体RNA基因的全长DNA序列。

2、利用MAFFT比对获取各个菌属的代表性序列

MAFFT(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)网站可以进行多重序列的比对，把窖泥前30个优势菌属和甲烷囊菌属的所有16S全长序列按属分别输入到该网站中，比对结果显示属内序列产生分类，同类序列序列碱基排列方式相似，不同类序列之间碱基排列方式不同，从每类序列中找出最能代表此类序列碱基排列特征的序列，即代表性序列。MAFFT比对的最大优势是相似性越大的DNA序列在比对结果中越被摆放在越近的位置。利用这个特性可以对每个属的几十到几百条甚至更多的上述序列快速进行比对并直接挑选出来2-4条代表性序列。将甲烷囊菌属(Methanoculleus)及窖泥前30个优势菌属所有的16S全长序列进行MAFFT比对，最后根据比对结果各属分别找出了3条代表性序列。各属的代表性序列及属内序列总条数整理汇总如表1所示。对应的93条代表性序列见序列表。

表1甲烷囊菌属和窖泥前30个优势菌属16S代表性序列汇总表

3、上述代表性序列进行限制性内切酶图谱比较获取甲烷囊菌属的若干特征性酶切方案

对上述代表性序列进行酶切图谱分析。首先把每条序列的0cutter即没有酶切位点的酶列举出来，做成交集。该交集中的限制性内切酶后面步骤中不予考虑。通过反复比较找出来至少一个甲烷囊菌属的特征性酶切方案，该方案理论上可以把甲烷囊菌与其他所有菌属区分开来。理论上一定可以找到若干个甚至很多个特征性酶切方案。确定手头上实际可用酶的范围，结果如表2所示.

表2部分研究可用酶

4、上述若干特征性酶切方案在全部菌属的核糖体RNA基因的全长DNA序列中的理论酶切测试对全部代表性序列进行限制性酶切位点分析。利用NEBcutter网站获得研究所用酶在代表性序列上的酶切位点图，找出各种酶在每个属代表性序列上的酶切位点个数及所在的位置。将优势菌属公共代表性序列的酶切位点图整理到一起，在甲烷囊菌属3条序列上的查找切割情况都相似的酶。这里各属代表性序列的酶切位点图以甲烷囊菌属为代表进行展示，该属代表性序列上的酶切位点如图1所示。

5、经过验证的特征性酶切方案进行实验验证

发现AcuI与XhoI两种酶符合要求(图2)。AcuI在3条序列上都有2个酶切位点且位置相近，同样XhoI在3条序列上都有3个酶切位点且位置相近，以这两种酶为对象进行接下去的研究。

6、经过实验验证的酶切方案用于窖泥厌氧菌培养中菌落菌属的快速鉴定

利用XhoI酶限制性酶切窖泥厌氧菌16S rDNA序列，再将酶切产物跑电泳。如果电泳结果出现4或5条亮带(含3或4个酶切位点)，那么就可确定其是甲烷囊菌序列，若只有1或2条亮带(含0或1个酶切位点)，那么就是非甲烷囊菌序列，而若有3条亮带(含2个酶切位点)，根据上述甲烷囊菌16S序列的2cutter酶切产物片段长度与其他属序列的2cutter酶切产物片段长度存在的明显差异，也可以将甲烷囊菌序列识别出来。

技术优势

1、本发明通过对窖泥中培养得到的厌氧菌的16S rDNA进行限制性酶切分析，使甲烷囊菌属细菌16S序列的酶切结果(酶切片段的数量和大小)区别于窖泥其他属细菌的酶切结果，这样可达到从窖泥厌氧菌群中快速识别甲烷囊菌属细菌的目的。将其利用到实际鉴定工作中，能够快速地将甲烷囊菌属细菌从窖泥厌氧菌群识别区分出来，比起每次都测序鉴定将节省大量的时间。

2、本发明所提供的鉴定方法有助于培养鉴定出甲烷囊菌属细菌，得到较难通过实验方法获得纯的Methanoculleus(甲烷囊菌属)细菌，作为窖泥中的优质菌属，研究其各种生物学特征。

3、本发明提供了一种从窖泥厌氧菌落中快速鉴定甲烷囊菌的方法，该方法流程稍加调整其实也适合建立任意其他类型甲烷菌厌氧培养菌落的基于限制性酶切的特异性识别方法，有很广泛的潜在应用价值。

4、本发明成功找到了一种酶——XhoI，利用该酶对窖泥厌氧菌的16S序列进行限制性酶切，根据酶切情况就能够将甲烷囊菌从窖泥中厌氧菌群中识别出来。

5、本发明采用MAFFT比对获取各个菌属的代表性序列，相似性越大的DNA序列在比对结果中越被摆放在越近的位置。所以即使处理几百条甚至几千条核糖体RNA基因的DNA序列也可以很快找到其代表性序列。

附图说明

图1甲烷囊菌属代表性序列的酶切位点。

图2甲烷囊菌属代表性序列上XhoI与AcuI的酶切位点。

图3古井ABC三个厂区107个厌氧菌落16S rDNA扩增结果电泳图。

图4第一次参与酶切实验的16S rDNA酶切产物实验电泳图。

图5第二次参与酶切实验的16S rDNA酶切产物实验电泳图。

图6甲烷囊菌属16S rDNA的M1片段序列上3个XhoI的酶切位点图。

实施案例

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述。

实施例1.基因组DNA提取、16S rDNA通用引物PCR扩增、扩增产物纯化

(1)基因组提取：利用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(购自上海生工生物有限公司的植物基因组抽提试剂盒B518261-0050)提取窖泥厌氧菌的基因组，该试剂盒通过Buffer PCB裂解细菌，释放出基因组DNA，然后采用特殊的吸附膜，能够有选择性地吸附核酸分子，去除其他杂质，得到高质量的基因组DNA。按瓶身标签说明在PW Solution中加入相应量的异丙醇混匀，Wash Solution中加入相应量的无水乙醇混匀，在瓶身做好标记(18mlPW Solution加入12ml异丙醇，7.5ml Wash Solution加入22.5ml无水乙醇；36ml PWSolution加入24ml异丙醇，15ml Wash Solution加入45ml无水乙醇)。提前将水浴锅调至65℃备用。

1)利用干净tip头将从窖泥中培养得到的厌氧菌单菌落分别挑到1.5ml的离心管中，每管加入600μl 65℃预热的Buffer PCB和12μlβ-巯基乙醇。震荡混匀，置于65℃水浴25min，间或混匀。2)加入等体积(612μl)的氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min。吸取上层水相至一个干净的1.5ml的离心管中。3)加入等体积的Buffer BD，颠倒混匀3～5次,再加等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到吸附柱中，室温静置2min。10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液。4)将吸附柱放回收集管中，加入500μl PW Solution，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中，加入500μl Wash Solution，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min。5)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μl TE Buffer，静置3min，12000rpm离心2mi你，得到的DNA溶液置于-20℃保存。

(2)PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳：对提取的窖泥厌氧菌基因组进行16S rDNA的PCR扩增，具体实验步骤如下：12μl PCR反应体系(6μl NPK02，0.25μl Taq酶，1.5μl引物(27F、1942R)，0.5μl模板DNA，3.75μl dH₂O)。PCR反应条件：94℃-3min；35cycles(94℃-30s，56℃-70s，72℃-90s)；72℃-3min。扩增结束后进行电泳实验，首先制备1％琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖加入到100ml 1×TAE溶液中，混匀后放入微波炉加热至固体溶化完全，溶液呈透明为止，拿出冷却到65℃左右后倒胶，插上梳子室温下冷却凝固。将完全凝固的胶移入电泳槽中，向电泳槽加入适量1×TAE电泳缓冲液使液体刚好没过胶面，再向槽中溶液里加入8μlEB溶液，打开电源预跑20min。在每个小管中分别加入3μl上样缓冲液，再分别加入8μl PCR产物，混匀。然后分别取3μl Marker D在两排点样口的中间点样口点样，接着进行混合样品的点样，点完后120V电泳20min。将电泳结束后的胶从电泳槽取出，小心移入凝胶成像分析仪中，打开紫外灯进行观察，观察并拍照记录后将胶小心移回电泳槽中。

(3)PCR扩增产物纯化：采用酚/氯仿抽提及乙醇沉淀的方法纯化PCR扩增产物，酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，同时抑制了DNANase的降解作用。由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，并能加速有机相与液相的分离。乙醇能够消除DNA的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来，然后再加入醋酸钠能够促进DNA的沉淀。具体纯化实验步骤如下：

1)从每管PCR产物中取80μl到新的离心管中，接着每管中加入80μl dH2O，然后每管中再加入160μl的酚(PH8.0)，充分颠倒混匀1min。混匀后12000rpm离心15min，离心结束后，取出上清液体(120μl)到新管中。每管中加入100μl氯仿，充分颠倒混匀1min。

2)混匀后12000rpm离心15min，离心结束后，取出上清液体(100μl)到新管中。每管加入1/10体积的NaAc(3M，PH5.2)和2倍体积的100％酒精(冷)，充分颠倒混匀1min，-20℃过夜沉淀。

3)过夜沉淀后，取出15000rpm离心15min，然后用真空泵吸去液体部分(底部留有一些)。每管4000rpm离心10s，将管盖及管壁上的液体甩下，接着用小枪头小心吸去剩余液体，注意白色小斑点不能被吸走。

4)每管加入600μl 70％酒精(冷)，15000rpm离心5min，然后用真空泵吸去液体部分(底部留有一些)。5000rpm离心1min，用小枪头吸净残液，再干燥20min，最后每管加15μldH2O溶解，于-20℃冰箱保存。最后将获得样品送到生物测序公司进行测序。

(4)限制性酶切实验：PCR扩增产物无需纯化可以直接进行限制性内切酶的酶切。为每个样品配备20μl酶切反应体系：12μl待切割DNA，2μl 10×Buffer K，1.5μl XhoI，4.5μl dH₂O。放入37℃水浴150min(90min时取出，4000rpm离心10s甩下液体后再放回水浴锅)。取出离心管，4000rpm离心10s，将管盖及管壁上的液体甩下。配制2.5％的凝胶(2.5g琼脂糖+100ml 1×TAE溶液)，倒胶凝固后，拔出梳子移入电泳槽中，向槽中加入8μl EB溶液，120V预跑1h，使EB充满胶体。向每管酶切产物中分别加入3μl上样缓冲液，混匀。在两排点样口的中间点样口各点入3μl Marker D，然后每管样品分别按序点样，120V电泳40min。将电泳结束后的胶从电泳槽取出，小心移入凝胶成像分析仪中，打开紫外灯进行观察，观察并拍照记录后将胶小心移回电泳槽中。

实施例2.古井窖泥厌氧菌16S rDNA的扩增及纯化

古井贡酒的窖泥来源于其ABC三个厂区。成功提取了3批共107个古井窖泥厌氧菌的基因组。将PCR扩增产物进行电泳实验，AB厂第一批、C厂第一批和AB厂第二批厌氧菌的凝胶成像结果分别如图3所示。图3(a，b)中15、30、43号未出现条带，(c，d)中1、14、21号未出现出条带，(e)中只有7号未出现出条带，证明上述实验未能成功扩增出它们的16S rDNA，可能对应的菌落属于真菌或真核为生物。去除未扩增成功的7管样品，剩下的样品进行纯化实验，最终获得了100管窖泥厌氧菌16SrDNA纯化样品，并将其送到生物测序公司进行测序。将样品测序结果进行BLAST比对分析，统计各样品的菌属情况。

实施例3.选取XhoI酶切方案所需要的各个菌属的DNA样本

选取三批菌中的部分16S rDNA样品进行酶切实验，选取以包含所有属、所有厂、所有批次的的序列为要求。根据测序后的序列数据，验证发现AB厂第一批24号(AB24I)、AB厂第二批3号(AB3II)和21号(AB21II)的16S序列上均有XhoI酶的一个酶切位点，如表3所示。为了增加实验的比较性，将选取这些样品参与酶切实验。

表3 3条序列上XhoI酶的酶切位点汇总表(bp)

Lactobacillus属的菌数量相对较多，从中选取了16个样品进行下步的酶切实验(AB厂8个加C厂8个)，而其他四个属的菌数量相对较少，依次为13，8，3，1个，所以将这四个属的25个16S DNA样品全部取来进行酶切实验，所有样品依次编号为1-41号(表格4)。

由于甲烷囊菌较难培养获得，实验室培养的三批菌经测序结果发现其中并没有甲烷囊菌(但是高通量测序实验及文献反复表明浓香型白酒的窖泥中确实含有甲烷囊菌)，所以使用实验室自制引物扩增得到的2条甲烷囊菌16S片段参与酶切实验。其中M1片段具有3个XhoI的酶切位点，能够反映甲烷囊菌属16S序列的特异酶切特征，如果能通过XhoI进行限制性酶切从古井窖泥厌氧菌16S rDNA中识别出该片段，那么说明该酶切方案是能够识别出甲烷囊菌16S序列的(因为仅仅是片段参与实验比较已能够被区分开来，如果是全长序列参与酶切实验，那么得到的结果将会是有相同或是更多的电泳条带，就会更加容易被识别出来)，从而证明了该方案是有效的。另外也加入了4条实验室自制引物扩增得到的其他两个属的16S片段进行酶切分析，增加了结论的说服性。

以窖泥基因组为模板做PCR，利用实验室自制引物扩增得到的6个16S片段分别为A1、A2、M1、M2、S1、S2片段，其中A₁、A₂为Aminobacterium(氨基杆菌)属16S片段，M₁、M₂为Methanoculleus(甲烷囊菌)属16S片段，而S₁、S₂为Sedimentibacter(瘤胃球菌)属16S片段，依次编号为①、②、③、④、⑤、⑥。选取进行酶切实验的16S rDNA样品统计如表4所示，共47个。

表4参与酶切实验的16S rDNA样品统计表

实施例4.XhoI酶切实验

进行了两次酶切实验。第一次酶切实验将酶切产物跑电泳，电泳结束将胶移到凝胶成像仪中观察，结果如图4所示。由图4发现只有③号具有2条亮带，其他的都只有一条亮带，说明③号片段以被XhoI切开，而③号正是用特异性扩增甲烷囊菌16S序列的自制引物扩增到的片段M₁。由于③号条带不是很清晰，也缺乏对照，又进行了第二次酶切实验，产物然后进行电泳，点样顺序为M1(不酶切)、M1(酶切)、M2(不酶切)、M2(酶切)、Marker D、AB3II(不酶切)、AB3II(酶切)，电泳结果如图5所示。由图5发现只有2号出现两条条带，5和6号结果表明AB3II这个样品已降解。由此证明M1片段的确是被XhoI酶切开了，而其他的序列都未被切开。根据测序结果，A1、A2为Aminobacterium(氨基杆菌)属16S片段，M1、M2为Methanoculleus(甲烷囊菌)属16S片段，而S1、S2为Sedimentibacter(瘤胃球菌)属16S片段。其中M1片段序列上有3个XhoI的酶切位点，其序列见序列表，其酶切位点如图6所示。通过NEBcutter酶切情况验证，AB3II、AB21II、AB24I是可以被XhoI切开的，形成的片段长度分别为AB3II(286bp，1207bp)、AB21II(9bp，1483bp)、AB24I(22bp，1423bp)。现在实验结果发现AB3II这个样品已降解，而AB21II(编号9)、AB24I(编号38)的电泳结果只有一条条带，这是由于它们酶切后的短片段过小，分别为9bp和22bp，电泳无法显示出它们的亮带。由图6知M1片段被XhoI酶切理论上形成的片段大小分别为38，52，94，161bp，由图5可知2号的两条亮带带分别为94bp和161bp长度的片段，而38bp，52bp两个片段由于太小未能显示出亮带来，因此可以说明M1片段的确可以被XhoI酶切开，而且实际酶切产物的片段长度与理论长度相符。AB21II(编号9)、AB24I(编号38)的电泳结果只有一条亮带，如果假设它们的小片段也显示亮带，那么它们亮带的分布的位置也将与M1明显不同，同样如果AB3II样品未降解，其酶切产物片段的条带位置也将与M1的明显不同(没有比Marker 100bp跑的更快的条带)，最终也是可以从这些16S序列中将甲烷囊菌的片段识别出来。

从两次酶切实验看来，实验结果中只M1酶切产物出现两条亮带，而其他样品酶切产物只有一条亮带，而且M1亮带的位置与甲烷囊菌属两个特异性94bp和161bp酶切片段相符合，仅根据电泳结果已经能够将甲烷囊菌属16S片段M1从这些窖泥厌氧菌16S rDNA中识别出来，M2虽然也是甲烷囊菌属16S片段，但它不具备XhoI酶切位点，并不能代表甲烷囊菌全长序列的酶切结果，所以M2酶切结果只有一个亮带，无法被识别是正常的，并不能影响酶切方案的有效性。综上所述，可以证明通过XhoI酶对窖泥厌氧菌16S rDNA进行限制性酶切是能够用来鉴定甲烷囊菌属的，设计的酶切方案是正确有效的。

序列表

<110> 哈尔滨工业大学（威海）

<120> 一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌的酶切方法

<130> Demo reference number

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1434

<212> DNA

<213> Uncultured Methanoculleus sp. clone sagar55 16S ribosomal RNA genepartial sequence JN030633.1

<400> 1

ctggttgatc ctgccagagg tcactgctat cggggttcga ttaagccatg cgagtcgaga 60

gggttcggcc ctcggcgtac tgctcagtaa cacgtggata acctgacctg aggaagggga 120

tacccccggg aaactgggga taatacccta taggttaccg atgctggaat gctcggtaac 180

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gtcaggcaac gagcgagacc cacgccaaca gttgccagca cgacccccgg gctggtgggg 1080

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gccccgaatt atccgggcta cacgcgggct acaatgggca ggacaatggg tatcgacacc 1200

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ctccttgcac acaccgcccg tcaaaccatc ttagtggggt ttggatgagg ctgcggtcgt 1380

tgccgcagtc gaatctaggt tccgcaagag gggttaagtc gtaacaaggt aacc 1434

<210> 2

<211> 1445

<212> DNA

<213> Methanoculleus marisnigri strain CoCam 16S ribosomal RNA gene partialsequence AF028693.1

<400> 2

gtcactgcta tcggggttcg attaagccat gcgagtcgag agggttcggc cctcggcgta 60

ctgctcagta acacgtggat aacctgccct aaggaagggg ataacctcgg gaaactgagg 120

ataataccct ataggttaca gatgctggaa tgctttgtaa cccaaagttc cgacgcctta 180

ggatggatct gcggccgatt aggttgttgt tggggtaatg gcccaacaag ccagtaatcg 240

gtacgggttg tgggagcaag agcccggagt tggattctga gacacgaatc caggccctac 300

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ccggtgccag ccgccccggt aataccggcg gctcgagtgg tggccacttt tattgggctt 480

aaagcgttcg tagctgggtt gctaagtctc ttgggaaatc cgacggctta accgtcgggc 540

gtctaagaga tactggtaat cttggaaccg ggagaggtga ggggtacttc gggggtagga 600

gtgaaatcct gtaatcctcg agggaccacc tgtggcgaag gcgcctcacc agaacggctt 660

cgacagtgag ggacgaaagc tgggggagca aaccggatta gatacccggg tagtcccagc 720

cgtaaacgat gcgcgttagg tgtatcgacg accacgagtc gtcgaggtgc cgaagggaaa 780

ccgtgaaacg tgccgcctgg gaagtacggt cgcaaggctg aaacttaaag gaattggcgg 840

gggagcacca caacaggtgg agcctgcggt ttaattggac tcaacgccgg aaatctcacc 900

ggataagaca gcggaatgat tgccgggctg aagactctgc atgactagct gagaggaggt 960

gcatggccgt cgtcagttcg tactgtgaag catcctgtta agtcaggcaa cgagcgagac 1020

ccacgccaac agttgccagc atggtctccg gactgatggg gacactgttg ggaccgcctc 1080

tgctaaagag gaggaaggaa tgggcaacgg taggtcagca tgccccgaat tatccgggct 1140

acacgcgggc tacaatgggc aggacaatgg gtatcgacac cgaaaggtga aggcaatctc 1200

ttaaacctgt ccgtagttcg gattgtgggc tgtaactcgc ccacatgaag ctggaatctg 1260

tagtaatcgc gtttcaaaat aacgcggtga atgtgtccct gctccttgca cacaccgccc 1320

gtcaaaccac ccgagtgggg tttggatgag gctgcggttg ttgccgcagt cgaatctagg 1380

ttccgcaagg ggggttaagt cgtaacaagg tagccgtagg ggaatctgcg gctggatcac 1440

ctcct 1445

<210> 3

<211> 1457

<212> DNA

<213> Uncultured Methanoculleus sp. clone AL2 1 16S ribosomal RNA gene,partial sequence JX101964.1

<400> 3

ctggttgatc ctgccagagg tcactgctat cggggttcga ttaagccatg cgagtcgaga 60

gggttcggcc ctcggcgtac tgctcagtaa cacgtggata acctgcccta gggaagggga 120

taaccccggg aaactgggga taatacccta tagattacag atgctggaat gccctgtaat 180

ccaaggttcc gacgccctag gatggatctg cggccgatta ggttgttgtt ggggtaatgg 240

cccaacaagc ccgtaatcgg tacgggttgt gggagcaaga gcccggagtt ggattctgag 300

acacgaatcc aggccctacg gggcgcagca ggcgcgaaaa ctttacaatg cgggcaaccg 360

tgataaggga acctcgagtg cctgtaaatg caggctgttc aggtgcctaa aacacacctg 420

aagaaagggc cgggcaagac cggtgccagc cgccgcggta ataccggcgg ctcgagtggt 480

ggccgctttt attgggctta aagcgttcgt agctgggttg ttaagtctct tgggaaatct 540

ggcggcttaa ccgtcaggcg tctaatggat actggcaaat cttggaaccg ggagaggtga 600

gggggtactt cgggggtagg agtgaaatcc tgtaatcctc gaggggcccc cttgtgggcg 660

aaggggcctt cacgggaacg ggctttctac agtgagggga cgaaaggttg ggggagcaaa 720

cccggattta gatacctggg ttagtccccg gccttaaaac tatgcgcgtt aggtgttttc 780

ggtgaccacg agtttaccga aggtgccgaa gggaaaacct tgaaaacgtg ccgcctggga 840

agtacggtcg cagggttgaa acttaaagga attggcgggg gagcaccaca acaggtggga 900

gcctgcggtt taattggact caacgccggg aagctcaccg gataagacag cagaatgatt 960

gccgggctga agactctgca tgactagctg agaggaggtg catggccgtc gtcagttcgt 1020

actgtgaagc atcctgttaa gtcaggcaac gagcaagacc cacgccaaca gttgccagca 1080

tggtctccgg actgatgggg acactgttgg gaccgcctct gctaaagagg aggaaggaat 1140

gggcaacggt aggtcagcat gccccgaatt atccgggcta cacgcgggct acaatgggca 1200

ggacaatggg catcgacacc gaaaggtgaa ggcaatctcc taaacctgtc cttagttcgg 1260

attgtgggct gcaactcgcc cacatgaagc tggaatctgt agtaatcgcg tttcaaaata 1320

acgcggtgaa tttgtccctg ctccttgcac acaccgcccg tcaaaccacc cgagtggggt 1380

ttggatgagg ttgcggttgt tgccgcagtc gaatctaggt tccgcaaggg gggttaagtc 1440

gtaacaaggt agccgta 1457

<210> 4

<211> 357

<212> DNA

<213> 16S rDNA fragment Methanoculleus M1

<400> 4

gaaaacttta caatgcgggc aaccgtgata agggaacctc gagtgcctgt aaatgcaggc 60

tgttcaggtg cctaaaacac acctgaagaa agggccgggc aagaccggtg ccagccgccg 120

cgataatacc ggcggctcga gtggtggccg cttttattgg gcttaaagcg ttcgtagctg 180

ggttgttaag tctctgggga aatctggcgg cttaaccgtc agccgtctaa gggatactgg 240

caatcttgga accgggagag gtgaggggta cttcgggggt aggagtgaaa tcctgtaatc 300

ctcgagggac cacctgtggc gaaggcgcct caccagaacg gcttcgacag cgaagcg 357

<210> 5

<211> 545

<212> DNA

<213> 16S rDNA fragment Methanoculleus M2

<400> 5

gattagatac ccgggtagtc ccagccgtaa actatgcgcg ttaggtgtat cggtgaccac 60

gagttaccga ggtgccgaag ccaaaccgtg aaacttcctc ctgttaagta cggtcgcaag 120

gatgaaactt aaaggaattg gcgggcgagc accacaacag tggagcctgc ggtttaattg 180

ggctcaactt cgcaaagctc atcggataag acagcggaat gattgctgca ctgaagactc 240

tgcatgactg gctgagagtc ggtgcatgga tctctccagt gcgtactgtg aagcatcttg 300

ttaagttagg ccacgagcaa gacccacgcc aaccggtgcc agcatgccct ccggactgat 360

gttaacactg ttgctaccgc ctctgcttcc gaggaggaag gaatgagcaa cgctagttca 420

gcatgccccg aattatccgc gctacacgcg ggctacaatg ggcaggacaa tgggcatcga 480

caccgaatct gaaggcaatc tcttaaacct gtccttagtt cggattgtgg gtgtaacttg 540

gcaaa 545

<210> 6

<211> 324

<212> DNA

<213> Aminobacterium 16S rDNA fragment A1

<400> 6

ctccggcacg gatgcctctc gacacccaca cctagcattc atcgtttacg gccaggacta 60

ccggggtatc taatcccgtt cgctcccctg gctttcgcgc ctcagcgtca gttgctggcc 120

agtaagccgc cttcgccact ggtgttcttc ccgatatcta cgcatttcac cgctacaccg 180

ggaattccgc ctacctctcc agcactctag atacccagtt tcaaccgcat ccatgagttg 240

agcccatgac tttaacagct gacttaaata tccgcctgcg cgccctttac gcccagtaat 300

tccggacaac gctcgttccc tact 324

<210> 7

<211> 183

<212> DNA

<213> Aminobacterium 16S rDNA fragment A2

<400> 7

gtagttaagc cgggacttcc tcgtatggta ccgtcacttc cttcttccca tacaacagag 60

gtttacgacc caaagccttc ttccctcacg cggcgtcgct gggtcaggct tgcgcccatt 120

gcccaatatt ccccactgct gcctcccgta ggagtctgga ccgtatctca tttccagtgt 180

gga 183

<210> 8

<211> 138

<212> DNA

<213> Sedimentibacter 16S rDNA fragment S1

<400> 8

ggcggtgtgt acaagacccg ggaacgcatt caccgcgacg ttctgattcg cgattactag 60

caactccgac ttcatgcagg cgagttgcag cctgcaatcc gaactgggat cggtttactg 120

ggatttgctc cgattcaa 138

<210> 9

<211> 190

<212> DNA

<213> Sedimentibacter 16S rDNA fragment S2

<400> 9

cgctccgttg taccgaccat tgtagcacgt gtgtagccca agacataagg ggcatgatga 60

tttgacgtca tccccacctt cctccggttt atcaccggca gtctccttag agtgcccaac 120

ttaacttgct ggcaactaag gataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacactt 180

cacgacacga 190

Claims

1.一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌属(Methanoculleus)的方法，该方法包含以下步骤：

(1)利用XhoI酶对甲烷囊菌属(Methanoculleus)16S rDNA进行限制性酶切，将获得的酶切产物跑电泳，记录电泳结果，当电泳结果为3条亮带时记录各个酶切产物的序列长度；

(2)利用XhoI酶对待测窖泥厌氧菌16S rDNA进行限制性酶切，将获得的酶切产物跑电泳，记录电泳结果，当电泳结果为3条亮带时记录各个酶切产物的序列长度；

(3)将步骤(2)的电泳结果与步骤(1)进行对比，确定步骤(2)的待测窖泥厌氧菌是否包含甲烷囊菌属(Methanoculleus)：当电泳结果出现4或5条亮带，那么就可确定其是甲烷囊菌属(Methanoculleus)序列，当只有1或2条亮带，那么其就是非甲烷囊菌属(Methanoculleus)序列；当有3条亮带，将步骤(2)记录的酶切产物的序列长度与步骤(1)记录的酶切产物的序列长度进行对比，当步骤(2)记录的酶切产物的序列长度有与步骤(1)相同的序列长度时，其就是甲烷囊菌属(Methanoculleus)序列；

所述窖泥厌氧菌为古井贡酒窖泥厌氧菌。