CN108410861B

CN108410861B - 一种皮张中古dna的提取方法及试剂盒

Info

Publication number: CN108410861B
Application number: CN201810465329.3A
Authority: CN
Inventors: 付巧妹; 曹鹏; 戴情燕
Original assignee: Institute Of Vertebrate Paleontology And Paleoanthropology
Current assignee: Institute Of Vertebrate Paleontology And Paleoanthropology
Priority date: 2018-05-16
Filing date: 2018-05-16
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2038-05-16
Also published as: CN108410861A

Abstract

本发明涉及一种皮张中古DNA的提取方法，包括样品预处理步骤、消化蛋白步骤、吸附步骤及洗脱步骤；所述消化蛋白步骤采用proteinK/EDTA消化液，所述protein K/EDTA消化液为包含蛋白酶K、EDTA、Tween 20的水溶液；所述吸附步骤采用的吸附体系包含Binding buffer、乙酸钠溶液、以及浸泡于所述Binding buffer和乙酸钠的混合液中的带滤膜的吸附柱；所述Binding buffer为包含盐酸胍、异丙醇或无水乙醇、Tween20的水溶液；所述滤膜为硅基质滤膜；所述洗脱步骤采用TET洗脱液，所述TET洗脱液是包含三羟甲基氨基甲烷‑HCl、EDTA、Tween 20的水溶液。本发明方法与现有技术相比，在古皮张样品相同情况下，可获得现有技术12倍以上DNA分子总量，因此可用更少的皮张样品用量，提取效率更高。

Description

一种皮张中古DNA的提取方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种DNA的提取技术领域，尤其涉及一种古DNA的提取方法及试剂盒。

背景技术

古DNA是指保存于古生物遗骸中的遗传物质。随着分子生物学的出现，古DNA研究也逐渐进入了考古工作者的视野，为现代与古代生物间谱系发育关系提供直接证据，同时也为研究人类起源与迁徙、动植物的家养与驯化以及农业文明的起源和早期发展等问题提供一个新视角。然而，古DNA的成功提取一直是其中的重点和难点。这主要是由于受保存时间和保存状态的影响，古DNA的含量相对较低且极易受有机物质污染降及解。在此基础上，针对古DNA的提取技术也受到了各种制约，提取的成功与否很大程度上决定了研究的深度和广度。据以往经验，考古遗址中经常会发现动物毛皮，这对研究古代动物与现代动物之间的遗传关系，揭示家养动物的起源与驯化具有重要意义，而考古现场发现或博物馆保存的皮张又因长时间的降解影响，进一步加大了提取难度。

皮张古DNA提取技术可为珍稀动物保护遗传学研究提供基础。目前，绝大部分珍稀濒危动物的种群生存状况已相当脆弱，已不允许破坏性取样，因此利用馆藏标本样品用于保护遗传学和系统进化等方面的研究成为解决这一难题的重要途径。虽已有学者从馆藏陈旧皮张标本中成功提取了DNA，但因陈旧皮张中DNA相对含量低及污染问题，使这些方法往往存在着标本样品用量大、提取效果差、实验周期长和操作步骤繁琐等不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的皮张中古DNA的提取方法及试剂盒，能够实现提取时皮张样品用量少、DNA污染低、提取效率高、操作时间短、操作简单、内源DNA获取量较大等目标，从而为考古学研究、珍稀动物保护研究和其他相关领域研究提供了技术保障和支持。

为了达到上述目的，本发明主要通过选择使用高效的消化液和吸附缓冲液(DNAbinding Buffer)，获取更多的古DNA信息，尤其是不易捕获的短片段DNA信息。由此，既避免了古DNA的污染问题，同时又能高效、便捷地获得含有古DNA的溶液。

本发明采用的主要技术方案如下：

一种皮张中古DNA的提取方法，其包括：样品预处理步骤、消化蛋白步骤、吸附步骤及洗脱步骤；其中：

所述消化蛋白步骤采用protein K/EDTA消化液，所述protein K/EDTA 消化液为包含蛋白酶K、EDTA、Tween 20的水溶液；

所述吸附步骤采用的吸附体系包含Binding buffer、乙酸钠溶液、以及浸泡于所述Binding buffer和乙酸钠的混合液中的带滤膜的吸附柱；所述Binding buffer为包含盐酸胍、异丙醇或无水乙醇、Tween 20的水溶液；所述滤膜为硅基质滤膜；

所述洗脱步骤采用TET洗脱液，所述TET洗脱液是包含三羟甲基氨基甲烷-HCl、EDTA、Tween 20的水溶液。

优选地，所述protein K/EDTA消化液中，所述protein K/EDTA消化液中，蛋白酶K的浓度为0.20mg/mL～40mg/mL，EDTA浓度为 0.40mol/L～0.60mol/L，Tween20的体积分数为0.03～0.08％。

优选地，所述proteinK/EDTA消化液由5体积份的100％Tween20、 250体积份的10mg/mL的ProteinaseK、9000体积份的0.5mol/L且pH8.0 的EDTA和745体积份的水配制而成。

优选地，所述Bindingbuffer中，盐酸胍的浓度为3～7mol/L，异丙醇或无水乙醇的体积分数为30～50％，100％Tween20的体积分数为 0.03～0.08％。

优选地，所述乙酸钠溶液为2～4mol/L，其使用量为Bindingbuffer体积的2～5％。

优选地，所述Bindingbuffer向0.25mol的盐酸胍加水至30mL溶解，再加异丙醇或无水乙醇至50mL，最后加25μl的100％Tween20配制而成。

优选地，所述TET洗脱液中，三羟甲基氨基甲烷-HCl的浓度为 0.005～0.015mol/L，EDTA浓度为0.0008～0.0012mol/L，Tween20的体积分数为0.03～0.08％。

优选地，所述TET洗脱液由1体积份的100％Tween20，20体积份的 1mol/LpH＝8.0的三羟甲基氨基甲烷-HCl，4体积份的0.5mol/LpH＝8.0的 EDTA，和1975体积份的水配制而成。

具体地，配制TET洗脱液的过程为：量取500μl浓度1mol/L且pH＝8.0 的三羟甲基氨基甲烷-HCl，再量取100μl浓度0.5mol/LpH＝8.0的EDTA，再滴加25μl的100％Tween20，最后加水至50mL，振荡摇匀即配制完成。

根据本发明的皮张中古DNA的提取方法，其步骤如下：

S1样品预处理步骤：通过该样品预处理步骤获得清洁、无外源有机质污染的皮张样品；

S2消化蛋白步骤：将所述proteinK/EDTA消化液加入盛装有皮张样品的离心管中，封口密封，于35～38℃下振荡、温育过夜，以消化本步骤反应体系中的大分子蛋白；高速离心处理去除未溶解的皮张样品，留取上清液；

S3吸附：取一定量的所述上清液至盛装有所述Bindingbuffer和乙酸钠溶液的离心管中并混匀得混合液，接着将该混合液转移至容纳有带滤膜的吸附柱的离心管中，低速离心处理，使上清液中DNA与滤膜结合，同时还有少量小分子蛋白也被该滤膜吸附；

S4纯化：将所述带滤膜的吸附柱转移至新的离心管中，中速离心处理并弃去离心产出的清液，去除去滤膜上吸附的小分子蛋白；

S5清洗纯化：加PE缓冲液至所述吸附柱的滤膜，中速离心处理并弃去离心产出的清液，再次去除滤膜上吸附的小分子蛋白；执行本步骤至少1次；

S6洗脱：将盛装所述带滤膜的吸附柱的离心管进行高速离心干燥，再转移所述带滤膜的吸附柱至另一新的离心管内，加TET洗脱液至所述滤膜上，静置、高速离心，离心产生的清液重新加载至该滤膜上，再次静置和高速离心，将滤膜上的DNA洗脱，得到含DNA的溶液。

优选地，步骤S5使用的PE缓冲液为购自荷兰凯杰(QIAGEN)公司编号19065号产品。

优选地，步骤S1所述的样品预处理步骤包含:

S1-1：采用紫外处理过的无DNA、RNA污染的刀片或剪刀剔除掉皮张表层的毛发，并取20～30皮张，剪碎为<1mm³皮张颗粒；

S1-2：将所述皮张颗粒置于低DNA吸附离心管中，加1～2ml的70％乙醇，高速震荡洗涤，以＞12000rpm离心0.5min～2min；执行此步骤至少2次；

优选地，所述低DNA吸附离心管是eppendorf公司的产品LoBind低 DNA吸附管。该低DNA吸附管采用高纯度的聚丙烯材质，减少管壁和 DNA样品的结合力，确保接近100％地回收DNA/RNA样品，适用于核酸样品的制备和保存。其中PCRclean洁净级的纯度级别，可直接进行PCR 实验制备。LoBind低DNA吸附管显著降低DNA损失，且管无表面涂层，不会污染样品；不含DNA、DNase、RNase和PCR抑制剂(PCRclean洁净级)。

S1-3：将步骤S1-22离心管敞口静置于37～40℃培养箱中5min，充分去除残留的乙醇。

其中，所述低速离心是指离心转速为1000～2000rpm，优选为1500rpm；中速离心是指离心转速为5000～7000rpm，优选为6000rpm；高速离心是指离心转速为12000～14000rpm，优选为13200rpm。步骤S6的高速离心将滤膜所结合在DNA在洗脱液TET的作用下脱去，以便得到含DNA的溶液。可见，离心转速超过12000时，会使结合在滤膜上的DNA脱下，故在清洗纯化处理时，离心转速不宜过高。

低速离心主要其搅拌及均质化的作用，帮助DNA被滤膜吸附。高速离心主要是起到离心去除大颗粒物、干燥脱水等作用。中速离心主要是清洗纯化滤膜的作用，使吸附柱的滤膜上被吸附的蛋白质脱去，而吸附的DNA留下，因此在S4～S5是一定要控制好离心转速，离心转速不能过高也不能太低，离心转速太低则起不到去除蛋白质和核苷酸等杂质的作用。

本发明还涉及一种皮张中古DNA的提取试剂盒，其包括：成为蛋白消化液的第一组试剂、成为吸附缓冲液的第二组试剂、成为洗脱液的第三组试剂；其中第一组试剂包含250μl的10mg/ml的蛋白酶K；第二组试剂包含0.25mol的盐酸胍；第三组试剂包含500μl的1mol/L且pH＝8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。

需要用到的其他试剂，如去离子水、起到pH调控作用的缓冲液 EDTA、表面活性剂Tween20等可为由操作人员在按照本发明方法自行获得或配制，当然也可配设在试剂盒中。

试剂中的异丙醇或无水乙醇作用是作为DNA沉淀剂。试剂中的 tween20用于保证DNA不被离心管所吸附，以防含DNA的溶液经冷冻和解冻处理后，因离心管的吸附作用，造成溶液中DNA的浓度下降。

本发明的有益效果是：

本发明通过获取清洁的、无外源污染的古皮张，然后选择高效的消化液，设计高效的结合体系，使古DNA充分与吸附柱内的滤膜(硅基质膜)结合，选择合理的洗脱液，使古DNA溶于洗脱液中，得到含古DNA 的溶液。吸附柱中的滤膜在低pH值、高浓度盐(盐酸胍)存在的条件下，能选择性吸附DNA片段，而蛋白质和其它杂质(如核苷酸、引物分子等) 不会被吸附(即使有也是少量小分子蛋白因滤膜孔隙作用吸附，但吸附力很低，易被破坏)。再通过一系列漂洗、离心、纯化步骤将核苷酸、蛋白质等杂质去除。最后用适当的洗脱缓冲液TET将纯净的DNA从滤膜上洗脱下来。

本发明方法与现有技术相比，在古皮张样品完全相同情况下，可以获得现有技术12倍以上DNA分子总量，因此可用更少的皮张样品用量，提取效率更高、操作时间更短(除消化蛋白需过夜外其余步骤操作时间为 0.5min～5min)、操作简单，从而为考古学研究、珍稀动物保护研究和其他相关领域研究提供了技术保障和支持。

本发明大大简化了核酸提取纯化过程，提供了一种快速、高通量的古DNA提取方法。通过本发明方法提取纯化的DNA片段可用于可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

实施例1

本实施例对狼皮张样品中古DNA的提取方法的操作步骤如下：

S1样品预处理步骤：通过该样品预处理步骤获得清洁、无外源有机质污染的皮张样品。在本实施例中具体操作如下：

S1-1：从中国科学院昆明动物研究所博物馆获取馆藏狼皮张样，用紫外处理过的无DNA、RNA污染的刀片和剪刀剔除掉皮张表层毛发，并取 25mg皮张样品1，剪碎为<1mm³皮张颗粒。

S1-2：将步骤S1-1中皮张颗粒至于eppendorf公司2.0ml的PCRclean 级别的DNALoBind离心管中，加1ml的70％乙醇，高速震荡洗涤，以 13200rpm离心0.5min～2min；此步骤重复3次。

S1-3：将步骤S1-2离心管敞口静置于40℃培养箱中，充分去除残留的乙醇。

S2消化蛋白步骤：将所述proteinK/EDTA消化液加入盛装有皮张样品的离心管中，封口密封，于35～38℃下振荡、温育过夜，以消化本步骤反应体系中的大分子蛋白；高速离心处理去除未溶解的皮张样品，留取上清液。在本实施例中具体操作如下：

S2-1:配制proteinK/EDTA消化液，配制时按照表1进行：

表1

试剂名称	体积	终浓度
			Water	745μl
0.5MEDTA,pH8.0	9ml	0.45M
			10mg/mlProteinaseK	250μl	0.25mg/ml
100％Tween20	5μl	0.05％

S2-2:取上述proteinK/EDTA消化液1.0mL至步骤S1-3的离心管中，涡旋混匀后用封口膜密封。

S2-3:将步骤S2-2的离心管至于旋转转子上，并于培养箱37℃振荡、温育过夜。这个过程中，蛋白被消化成分子量较小的多肽等。

S2-4:将S2-3的离心管取出后，13200rpm离心2min；留取离心产出的上清液。高速离心用以去除未消化溶解的皮张样品。

S3吸附：取所述上清液至盛装有所述Bindingbuffer和乙酸钠溶液的离心管中并混匀得混合液，接着将该混合液转移至容纳有带滤膜的吸附柱的离心管中，低速离心处理，再调换离心管的朝向后，继续该低速离心处理，使上清液中DNA被吸附至滤膜上，少量小分子蛋白也被该滤膜吸附。在本实施例中具体操作如下：

S3-1：配制吸附缓冲液Bindingbuffer，配制时按照表2进行：

表2

试剂名称	体积/质量	终浓度
			Guanidine hydrochloride(盐酸胍)	23.88g	5M
Water(水)	加至30ml
			Isopropanol(异丙醇)	加至50ml	40％
Tween 20(吐温20)	25μl	0.05％

S3-2:取步骤S3-1配制的吸附缓冲液Binding buffer 10mL于一个50 ml离心管中，再加400μL 3M乙酸钠溶液混合均匀。

S3-3:将步骤S2-4的上清液转移至步骤S3-2所述盛有吸附缓冲液 Bindingbuffer的离心管中，并混合均匀。

S3-4:在一个新的50mL离心管中放入带有滤膜的吸附柱，并将步骤 S3-3的混合液转移至这个离心管内，在1500rpm离心5min，然后调转离心管90°角方向后，继续1500rpm离心2min，使混合液中DNA与吸附柱的滤膜充分接触，尽可能完全与滤膜结合。

S4纯化：将所述带滤膜的吸附柱转移至新的离心管中，中速离心处理并弃去离心产出的清液，去除去滤膜上吸附的小分子蛋白。在本实施例中具体操作如下：

将步骤S3-4中带滤膜的吸附柱再转移至一个新的离心管中，在转速 6000rpm下离心0.5min～2min，弃除离心产出的清液，这个过程中主要通过离心将滤膜所吸附的混合液，包含水分、试剂(盐酸胍、异丙醇或无水乙醇)还有少量的小分子蛋白、核苷酸等杂质去除掉。

S5清洗纯化：加PE缓冲液(Qiagen，cat.no19065)至所述吸附柱的滤膜，中速离心处理并弃去离心产出的清液，再次去除滤膜上吸附的小分子蛋白；执行本步骤至少1次。在本实施例中具体操作如下：

向吸附柱的滤膜中央上滴加750μL PE(Qiagen，cat.no19065)，然后在6000rpm离心30sec，弃去离心产生的清液。重复此至少步骤一次。

S6洗脱：将盛装所述带滤膜的吸附柱的离心管进行高速离心干燥，再转移所述带滤膜的吸附柱至另一新的离心管内，加TET洗脱液至所述滤膜上，静置、高速离心，离心产生的清液重新加载至该滤膜上，再次静置和高速离心，将滤膜上的DNA洗脱，得到含DNA的溶液。在本实施例中具体操作如下：

S6-1:将带吸附柱的离心管旋转180°，在13200rpm离心干燥 0.5min～2min，转移吸附柱至新收集管。

S6-2：配制TET洗脱液，配制时按照表3进行：

表3

试剂名称	体积	终浓度
			Water(水)	49.38ml
0.5M EDTA,pH 8.0	100μl	1mM
			1M Tris-HCl,pH 8.0	500μl	10mM
Tween 20(吐温20)	25μl	0.05％

注：表中Tris-HCl为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。

S6-3：取50μL上述步骤S6-2配制的TET至吸附柱的滤膜中央，静置5min，13200rpm离心30sec，再将滤液重新加至滤膜中央，静置5min， 13200rpm离心30sec，在洗脱液和高速离心共同配合作用下，将滤膜上结合的DNA脱去，得到含DNA的溶液。

实施例2

从云南大学获取馆藏灵长类皮张样，用紫外处理过的无DNA、RNA 污染的刀片和剪刀剔除掉皮张表层毛发，并取25mg皮张样品2，剪碎为 <1mm³皮张颗粒。再按照步骤S1-2和S1-3进行清洁/去除有机质污染等预处理，用于本实施例。本实施例与实施例1的区别仅在于：

在本实施例中protein K/EDTA消化液，其中蛋白酶K的浓度为0.20 mg/mL，EDTA浓度为0.60mol/L，Tween 20的体积分数为0.03％。

在本实施例中吸附缓冲液Binding buffer，盐酸胍的浓度为3mol/L，无水乙醇的体积分数为50％，100％Tween 20的体积分数为0.08％。

在本实施例中TET洗脱液，三羟甲基氨基甲烷-HCl的浓度为 0.005mol/L，EDTA浓度为0.0008mol/L，Tween 20的体积分数为0.03％。

其他步骤及处理参见实施例1。

实施例3

从云南大学获取馆藏灵长类皮张样，用紫外处理过的无DNA、RNA 污染的刀片和剪刀剔除掉皮张表层毛发，并取25mg皮张样品3，剪碎为 <1mm³皮张颗粒。再按照步骤S1-2和S1-3进行清洁/去除有机质污染等预处理，用于本实施例。本实施例与实施例1的区别仅在于：

在本实施例中protein K/EDTA消化液，其中蛋白酶K的浓度为0.40 mg/mL，EDTA浓度为0.40mol/L，Tween 20的体积分数为0.08％。

在本实施例中吸附缓冲液Binding buffer，盐酸胍的浓度为7mol/L，异丙醇的体积分数为30％，100％Tween 20的体积分数为0.08％。

在本实施例中TET洗脱液，三羟甲基氨基甲烷-HCl的浓度为 0.015mol/L，EDTA浓度为0.0012mol/L，Tween 20的体积分数为0.05％。

其他步骤及处理参见实施例1。

对比例

从云南大学获取馆藏灵长类皮张样，用紫外处理过的无DNA、RNA 污染的刀片和剪刀剔除掉皮张表层毛发，并取25mg皮张样品4，剪碎为 <1mm³皮张颗粒。再按照步骤S1-2和S1-3进行清洁/去除有机质污染等预处理，使用市售的QlAamp DNA Mini Kit(50)DNA提取试剂盒。

对实施例1-3和对比例所提取的含DNA溶液，采用安捷伦荧光定量 PCR方法，测其中含DNA的总量，测定结果比较如表4：

样品名称	方法	copies qPCR(所有分子)
			狼皮张样品1	实施例1	2.54E+11
灵长类皮张样品2	实施例2	2.51E+11
			灵长类皮张样品3	实施例3	2.47E+11
灵长类皮张样品4	市售试剂盒	2.08E+10

其中，所有分子表示DNA和所有的DNA片段的总量。

由上表可知，本发明中古DNA提取方法获得DNA信息量相比于其他方法处理的相同样品来说，本发明的方法获得的DNA总量是现有方法的12倍以上。由此说明，本发明的方法和试剂盒可适用于皮张中古DNA 的提取和纯化，且所需样品量少，提取效率高，操作简单，DNA纯度高，为考古学研究、珍稀动物保护研究和其他相关领域研究提供了技术保障和支持。

Claims

1.一种皮张中古DNA的提取方法，包括样品预处理步骤、消化蛋白步骤、吸附步骤及洗脱步骤；其特征在于：包括如下步骤：

步骤S1所述的样品预处理步骤包含：

S1-1：采用紫外处理过的无DNA、RNA污染的刀片或剪刀剔除掉皮张表层的毛发，并取20～30mg皮张，剪碎为<1mm³皮张颗粒；

S1-2：将所述皮张颗粒置于低蛋白吸附离心管中，加1mL～2mL的70～80％乙醇，高速震荡洗涤，以＞12000rpm离心0.5min～2min；执行此步骤至少2次；

S1-3：将步骤S1-2离心管敞口静置于37～40℃培养箱中，充分去除残留的乙醇；

S2消化蛋白步骤：将protein K/EDTA消化液加入盛装有皮张样品的离心管中，封口密封，于35～38℃下振荡、温育过夜，以消化本步骤反应体系中的大分子蛋白；高速离心处理去除未溶解的皮张样品，留取上清液；

所述消化蛋白步骤采用protein K/EDTA消化液，所述protein K/EDTA消化液为包含蛋白酶K、EDTA、Tween 20的水溶液；所述protein K/EDTA消化液中，蛋白酶K的浓度为0.20mg/mL～40mg/mL，EDTA浓度为0.40mol/L～0.60mol/L，Tween 20的体积分数为0.03～0.08％；

S3吸附：取一定量的所述上清液至盛装有Binding buffer和乙酸钠溶液的离心管中并混匀得混合液，接着将该混合液转移至容纳有带滤膜的吸附柱的离心管中，低速离心处理，使上清液中DNA与滤膜结合，少量小分子蛋白被该滤膜吸附；

所述吸附步骤采用的吸附体系包含Binding buffer、乙酸钠溶液、以及浸泡于所述Binding buffer和乙酸钠的混合液中的带滤膜的吸附柱；所述Binding buffer为包含盐酸胍、无水乙醇、Tween 20的水溶液；所述滤膜为硅基质滤膜；S4纯化：将所述带滤膜的吸附柱转移至新的离心管中，中速离心处理并弃去离心产出的清液，去除去滤膜上吸附的小分子蛋白；

S6洗脱：将盛装所述带滤膜的吸附柱的离心管进行高速离心干燥，再转移所述带滤膜的吸附柱至另一新的离心管内，加TET洗脱液至所述滤膜上，静置、高速离心；离心产生的清液重新加载至该滤膜上，再次静置和高速离心，将滤膜上的DNA洗脱，得到含DNA的溶液；所述洗脱步骤采用TET洗脱液，所述TET洗脱液是包含三羟甲基氨基甲烷-HCl、EDTA、Tween 20的水溶液；

所述低速离心是指离心转速为1000～2000rpm；中速离心是指离心转速为5000～7000rpm；高速离心是指离心转速为12000～14000rpm。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述Binding buffer中，盐酸胍的浓度为3～7mol/L，无水乙醇的体积分数为30～50％，100％Tween 20的体积分数为0.03～0.08％。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述乙酸钠溶液为2～4mol/L，其使用量为Binding buffer体积的2～5％。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述TET洗脱液中，三羟甲基氨基甲烷-HCl的浓度为0.005～0.015mol/L，EDTA浓度为0.0008～0.0012mol/L，Tween 20的体积分数为0.03～0.08％。