CN112501250A - 一种rna提取方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种RNA提取方法，及利用该方法进行RNA提取的试剂盒。该方法和试剂盒利用由曲拉通、氯化锌、乙酸钠、碳酸乙烯酯、蛋白酶K组成的裂解液，裂解细胞释放出核酸，离心沉淀回收RNA，弃上清去除DNA，然后以由盐酸胍和巯基乙醇组成的重悬液溶解含有RNA的沉淀，加入到核酸吸附柱中，再K用含有75％乙醇pH4.5的10mM乙酸钠洗涤液洗涤2次后，洗脱得到高纯度的RNA。该方法快速简便，不需要使用DNase酶消化DNA，不需要使用苯酚、氯仿等刺激性毒性较强的有机溶剂，可从细菌、细胞、组织、血液、痰液等各类样品中提取得到高纯度的RNA，RNA得率和纯度优于常规方法，并且有利于健康防护和环境保护。

Description

一种RNA提取方法及试剂盒
技术领域
本发明属于用于医学检测的样本核酸提取纯化技术领域，涉及一种一步去除DNA的RNA提取方法及试剂盒，技术关键在于利用由曲拉通、氯化锌、乙酸钠、碳酸乙烯酯、蛋白酶K组成的裂解液，裂解细胞释放出核酸，离心沉淀回收RNA。
背景技术
RNA(核糖核酸)是遗传信息传递的载体。从细胞中分离RNA的纯度与完整性对于许多分子生物学实验至关重要。如Northern印迹及杂交分析、寡聚(dT)纤维素选择分离mRNA、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上决定于提取得到的RNA的质量。RT-PCR(reverse transcription逆转录聚合酶链反应)，指将逆转录反应(ReverseTranscription，RT)和PCR(Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的方法。RT-PCR把RT即以RNA为模板的cDNA合成，同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法，已发展成为进行基因表达水平的检测分析，病原体的检测分析等有力的手段。由于PCR的强大扩增性能，用于RT-PCR检测的RNA样品需要额外步骤除去核酸样品中的DNA以避免其干扰。由于RNA的化学性质稳定性不如DNA，从核酸样品中除去DNA的步骤经常导致RNA的损失甚至失败。这也是RT-PCR在临床检测应用方面的重要改进方向。
RNA提取的最关键因素是尽量减少RNA酶(RNase)的污染,减少RNA酶对RNA的降解作用，尽力创造并保持一个无RNase的环境。然而，RNase尤其是胰RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类。除样品内源RNase以外，环境中灰尘、各种试验器皿和试剂、人体的汗液、以及唾液中均存在RNase。这类酶耐热、耐酸、耐碱，煮沸也不能使之完全失活，蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。RNase的活性不需要辅助因子，二价金属离子鳌合剂对它的活性无任何影响。当前RNA提取纯化传统方法，主要为柱纯化法和Trizol法，主要问题是RNA提取和纯化的步骤繁琐，不能兼顾RNA提取得率和纯度的提升。其中，柱纯化法需要采取DNase酶消化等额外步骤去除残留DNA，易造成RNA的降解丢失，在处理痰液等含有大量杂质的复杂样品时，经常发生柱子堵塞而提取失败。Trizol法，需要使用苯酚和氯仿等有刺激性有毒性的有机溶剂，且操作过程中经常发生吸取到中间层或酚-氯仿分层不清而难以吸取上层上清等状况而导致提取失败。
为了解决目前RNA抽提纯化存在操作复杂耗时且RNA易损失等问题，本发明提供了一种同步完成细胞裂解、核酸抽提、吸附去除DNA过程的RNA抽提纯化方法及试剂盒。该发明不仅能够简化RNA抽提纯化过程，节省操作时间，最大程度地提高RNA的纯度并减少RNA损失而提高RNA提取得率，还能降低RNA提取成本。
发明内容
本发明的技术方案是：锌离子共沉淀法(Zinc Cation-Mediated Co-precipitation,ZCMC)，其以含Zn2+的酸性裂解液处理样品，同步完成细胞裂解、释放核酸、抑制核酸酶，再离心沉淀RNA、弃上清去除DNA，最后将RNA沉淀重悬上柱再洗涤洗脱得到高纯度RNA。
上面所述的裂解液由曲拉通、氯化锌、乙酸钠、碳酸乙烯酯、蛋白酶K组成。优选的组成为：8％(v/v)曲拉通、10mM氯化锌、5％(w/v)碳酸乙烯酯、0.1mg/ml蛋白酶K、150mM乙酸钠pH 4.5。保温条件为室温5分钟。曲拉通的主要作用是裂解细胞释放核酸；氯化锌、碳酸乙烯酯和蛋白酶K的共同作用能彻底抑制核酸酶包括RNase；乙酸钠提供pH 4.5的缓冲环境。进一步地，碳酸乙烯酯能够降低核酸双链Tm值，使得在室温条件下的溶液中，RNA单链更为舒展，而DNA仍保持双链状态。氯化锌提供Zn2+，不仅有抑制核酸酶的作用，而且在pH 4.5的溶液条件下，单链RNA呈酸性带负电能够结合Zn2+生成沉淀而通过离心回收，同时，在pH 4.5的溶液条件下，DNA双链呈中性状态，不结合Zn2+，而仍保持在上清液中。
上面所述的离心条件为高速台式离心机，室温条件下12000rpm，15分钟。
上面所述的重悬上柱的柱子为核酸纯化常用的吸附柱，重悬液为高浓度的GuHCl溶液，优选的组成为：3MGuHCl、100mM 2-巯基乙醇。
上面所述的洗涤条件为室温，优选的洗涤液组成为：75％(v/v)乙醇、5mMpH4.5的乙酸钠缓冲液。
上面所述的洗脱条件为向吸附柱中加入适量洗脱液，60℃保温2分钟，再离心回收洗脱得到的RNA。洗脱液可以是超纯水或pH 7.7的10mM Tris-HCl。
基于本方法的试剂盒，由吸附柱、收集管、处理液等主要组分组成。吸附柱和收集管的作用是吸附核酸和收集柱纯化步骤产生的废液。处理液1是裂解液，组成为：8％(v/v)曲拉通、10mM氯化锌、5％(w/v)碳酸乙烯酯、0.1mg/ml蛋白酶K、150mM乙酸钠pH 4.5。处理液2是重悬液，组成为：3MGuHCl、100mM 2-巯基乙醇。处理液3是浓缩的洗涤液，组成为：pH 4.5的125mM乙酸钠，使用前用75％乙醇稀释25倍。处理液4是洗脱液，组成为：pH 7.7的10mMTris-HCl。用于RNA样品提取时，用户按10:1的体积比将处理液1加入到细菌、细胞、血液或已磨碎的组织中，混匀，在室温静置保温5分钟，然后以12000rpm离心15分钟，吸去上清液，向沉淀加入700μl体积的处理液2吸打混匀，加到吸附柱中，离心弃流出液，再向柱子中加入550μl已用75％乙醇稀释25倍的处理液3，以12000rpm离心1分钟，弃流出液，重复操作1次，再将柱子转移至干净的1.5ml离心管上，向柱子膜中间加入50μl处理液4，在60℃保温2分钟，以12000rpm离心1分钟，收集流出液，得到RNA样品，取2μl于紫外分光光度计上测定A260、A280，A260/A280>1.9表明RNA样品纯度较好。按1OD＝38μg/ml计算RNA浓度。利用看家基因RPLP0进行荧光定量PCR，比对进行同一样品进行逆转录再行PCR扩增与不进行逆转录而直接PCR扩增的Ct值，进一步判断RNA样品中DNA污染量。
我们利用本方法试剂盒分别从100μl培养至饱和的大肠杆菌菌液、100μl收获在PBS里浓度为106/ml的人肺癌A549细胞、100μg猪肉糜等初始样品提取RNA，并与2种传统方法：Qiagen RNeasy柱纯化法和传统的Trizol法进行比对。本发明试剂盒方法操作同上文所述，略述如下：向样品加入1ml处理液1，混匀，室温保温5分钟，然后经离心-重悬-上柱-洗涤-洗脱等步骤，最后得到约50μl RNA样品。Qiagen RNeasy柱纯化法按其说明书方法进行，在对上述初始样品进行600μl裂解保温后，加入等体积乙醇混匀上柱离心后，先经洗涤液RW1洗涤后，向柱子膜中央加入10μl DNase I溶液，室温保温15分钟后，再进行2次洗涤，最后洗脱得到约50μl RNA样品。Trizol法在对上述初始样品加入1ml Trizol裂解保温后，向体系加入200μl氯仿，盖好后剧烈振荡15秒，在室温放置2分钟，然后离心12000rpm 15分钟。离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，上面是无色的水相。将上层水相转移到另一干净的离心管中，加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟，然后离心12000rpm 15分钟，可以在管的侧面底部看到白色RNA沉淀。弃上清，加入1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7500rpm 5分钟。弃上清，置空气中5分钟，干燥RNA沉淀，加入50μl无RNase水用枪头反复吹打几次，60℃静置10分钟，得到RNA样品。对3种方法得到的RNA样品分别取2μl，加入到干净的1.5ml离心管中，再加入98μl无RNase水，离心混匀，以无RNase水作空白对照，测A260/A280值。结果统计如下表所示：
表1本发明方法(ZCMC)与2种传统方法提取得到RNA样品的A260及A260/A280
Figure BDA0002706884530000031
可见本发明方法提取RNA的纯度与传统上柱法RNeasy相似，均优于Trizol法；本发明方法提取的RNA得率约为RNeasy的10倍、Trizol的5倍，显著提升了RNA提取的得率。
我们进一步利用荧光定量PCR对3种方法得到的A549 RNA样品进行看家基因RPLP0mRNA的PCR扩增检测。引物序列为：RPL1:TGTGGCTGCTGCCCCTGTGG，RPL2:CGACTCCTCCGACTCTTCCTTGGC。检测方法：取上述RNA样品2μl，加入2μl0.5μM OligodT21、50mM KCl，混合，60℃保温1分钟后，冷却至室温，再加入16μl逆转录(+RT)体系，组成为：50mM Tris-HClpH8.3、75mMKCl、5mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM dNTP、5U/μl MMLV RT酶，短暂离心后，于42℃保温30分钟，取15μl与15μl荧光定量PCR反应体系混合，使得30μl荧光定量PCR体系终浓度组成包含：50mM Tris-HClpH8.3、50mM KCl、2.5mM MgCl2、0.2mM dNTP、8％(v/v)甲酰胺、0.4×SYBR Green I(浓度0.4×的含义是，其中各组分在反应液中的终浓度为1×SYBR Green I中的0.4倍，市购生产商Microprobe的SYBR Green I原液为10000×，使用时按体积比稀释至PCR缓冲液中终浓度为0.4×即可)、0.025U/μl Taq DNA聚合酶、0.2μM引物RPL1、0.2μM引物。对于无逆转录(-RT)的对照扩增，则从RT体系中去掉MMLVRT酶，其它条件相同。PCR程序为：93℃5分钟，然后40个循环的93℃15秒、60℃25秒、80℃35秒，荧光信号采集在80℃。分别重复3组扩增结果如下表所示：
表2本发明方法(ZCMC)与2种传统方法提取得到RNA样品的RPLP0 PCR扩增Ct值
Figure BDA0002706884530000041
可见本发明方法RPLP0 mRNA扩增检测(+RT)显著强于RNeasy法或Trizol法；同时，无逆转录(-RT)对照扩增，本发明方法与RNeasy法均无扩增(No Ct)，显示RNA样品值无DNA污染，而Trizol法仍有Ct，显示存在痕量DNA污染。
本发明的有益效果是：提供了一种从初始样品中快速提取RNA的方法和试剂盒。本发明仅需常规离心步骤即能沉淀回收RNA，排除掉DNA，得到能够直接应用于下游RT-PCR检测的高纯度RNA。本发明提取RNA不仅可以达到与常规整合DNase I消化步骤纯化方法的高纯度，而且得率比传统方法高出约10倍，大大提高了RNA提取效率。本发明还减去有毒有机溶剂苯酚和氯仿在核酸提取步骤中的使用，不仅简化了核酸提取过程，节省操作时间，而且还降低了核酸提取成本，有利于操作者的健康和环境保护。本方法可应用于临床或科研等领域，实现快速提取和检测样品RNA的目标。本方法与2种传统RNA提取方法比对总结见下表：
Figure BDA0002706884530000051
附图说明：
附图1是本发明及2种传统方法操作过程图示
A，本发明，循：裂解(不含酚)-离心-重悬-上柱-洗涤-洗脱等6大步骤操作提取得到RNA；B，传统RNeasy方法，循：裂解(不含酚)-加乙醇-上柱-洗涤-加DNase-保温-洗涤-洗脱等8大步骤操作提取得到RNA；C，传统Trizol方法，循：裂解(含酚)-加氯仿-离心-吸取上层上清-加异丙醇-离心-洗涤-晾干-洗脱等9大步骤操作提取得到RNA.
下面我们结合具体实施例进一步介绍本发明的应用。
具体实施方式
实施例1利用本方法和试剂盒从大肠杆菌提取RNA
本方法和试剂盒组成如说明书正文所述。大肠杆菌过夜培养至饱和，OD600测定大于2.0。取0.1ml培养至饱和的大肠杆菌菌液置于1.5ml离心管中，继续加入1ml处理液1，混匀，室温保温5分钟，以12000rpm离心15分钟，仔细吸去上清，注意尽量吸干，同时不接触到底部侧面的沉淀，向沉淀加入700μl处理液2，反复吸打使得沉淀分散于溶液中，再转移至吸附柱中，以12000rpm离心1分钟，弃流出液，将柱子放回到空的收集管上，向柱中加入550μl以75％乙醇稀释至1×的处理液3，以12000rpm离心1分钟，弃流出液，将柱子放回到空的收集管上，重复洗涤1次，然后将柱子放到干净的1.5ml离心管上，向柱子中加入50μl处理液4，60℃保温2分钟后，以12000rpm离心1分钟得到RNA样品约50μl。采用A260/A280测定进行RNA样品质量检测。A260>0.7且A260/A280>1.90为合格。
实施例2利用本方法和试剂盒从人肺癌A549细胞提取RNA
本方法和试剂盒组成如说明书正文所述。人肺癌A549细胞于12孔板培养至饱和，显微镜下观察密度约100％。吸去培养液，直接向孔内加入1ml处理液1，以干净的移液枪吸头开口大端在孔内仔细刮擦混匀，室温保温5分钟，将全部液体转移至干净的1.5ml离心管内，以12000rpm离心15分钟，仔细吸去上清，注意尽量吸干，同时不接触到底部侧面的沉淀，向沉淀加入700μl处理液2，反复吸打使得沉淀分散于溶液中，再转移至吸附柱中，以12000rpm离心1分钟，弃流出液，将柱子放回到空的收集管上，向柱中加入550μl以75％乙醇稀释至1×的处理液3，以12000rpm离心1分钟，弃流出液，将柱子放回到空的收集管上，重复洗涤1次，然后将柱子放到干净的1.5ml离心管上，向柱子中加入50μl处理液4，60℃保温2分钟后，以12000rpm离心1分钟得到RNA样品约50μl。取2μl稀释至100μl，采用A260/A280测定进行RNA样品质量检测。A260>0.5且A260/A280>1.90为合格。
实施例3利用本方法和试剂盒从猪肉糜组织提取RNA
本方法和试剂盒组成如说明书正文所述。称取新鲜猪肉糜约0.1g置于研钵内，倒入液氮浸没肉糜组织后，迅速碾碎，向研钵内加入1ml处理液1，吸打混匀转移至1.5ml离心管中，室温保温5分钟，以12000rpm离心15分钟，仔细吸去上清，注意尽量吸干，同时不接触到底部侧面的沉淀，向沉淀加入700μl处理液2，反复吸打使得沉淀分散于溶液中，再转移至吸附柱中，以12000rpm离心1分钟，弃流出液，将柱子放回到空的收集管上，向柱中加入550μl以75％乙醇稀释至1×的处理液3，以12000rpm离心1分钟，弃流出液，将柱子放回到空的收集管上，重复洗涤1次，然后将柱子放到干净的1.5ml离心管上，向柱子中加入50μl处理液4，60℃保温2分钟后，以12000rpm离心1分钟得到RNA样品约50μl。取2μl稀释至100μl，采用A260/A280测定进行RNA样品质量检测。A260>0.3且A260/A280>1.90为合格。
实施例4利用本方法和试剂盒从人体血液提取RNA
本方法和试剂盒组成如说明书正文所述。取志愿者血常规剩余血液约100μl于1.5ml离心管中，加入1ml处理液1，吸打混匀，室温保温5分钟，以12000rpm离心15分钟，仔细吸去上清，注意尽量吸干，同时不接触到底部侧面的沉淀，向沉淀加入700μl处理液2，反复吸打使得沉淀分散于溶液中，再转移至吸附柱中，以12000rpm离心1分钟，弃流出液，将柱子放回到空的收集管上，向柱中加入550μl以75％乙醇稀释至1×的处理液3，以12000rpm离心1分钟，弃流出液，将柱子放回到空的收集管上，重复洗涤1次，然后将柱子放到干净的1.5ml离心管上，向柱子中加入50μl处理液4，60℃保温2分钟后，以12000rpm离心1分钟得到RNA样品约50μl。取2μl直接于超微量紫外分光光度计上测定A260/A280进行RNA样品质量检测。A260>0.15且A260/A280>1.90为合格。
实施例5利用本方法和试剂盒从人痰液标本提取RNA
本方法和试剂盒组成如说明书正文所述。以50ml离心管采集志愿者新鲜咳痰约2ml，向管内加入20μl 1M ZnCl2和0.5g乙酰半胱氨酸，室温振荡约10分钟，使得痰液液化溶解，于9000rpm离心10分钟，弃上清，向沉淀加入加入1ml处理液1，吸打混匀，转移至干净的1.5ml离心管中，室温保温5分钟，以12000rpm离心15分钟，仔细吸去上清，注意尽量吸干，同时不接触到底部侧面的沉淀，向沉淀加入700μl处理液2，反复吸打使得沉淀分散于溶液中，再转移至吸附柱中，以12000rpm离心1分钟，弃流出液，将柱子放回到空的收集管上，向柱中加入550μl以75％乙醇稀释至1×的处理液3，以12000rpm离心1分钟，弃流出液，将柱子放回到空的收集管上，重复洗涤1次，然后将柱子放到干净的1.5ml离心管上，向柱子中加入50μl处理液4，60℃保温2分钟后，以12000rpm离心1分钟得到RNA样品约50μl。取2μl稀释至100μl，采用A260/A280测定进行RNA样品质量检测。A260>0.1且A260/A280>1.90为合格。

Claims (4)

1.一种RNA提取方法，所述方法包括：锌离子共沉淀法，其以含Zn2+的酸性裂解液处理样品，同步完成细胞裂解、释放核酸、抑制核酸酶，再离心沉淀RNA、弃上清去除DNA，最后将RNA沉淀重悬上柱再洗涤洗脱得到高纯度RNA。
2.如权利要求1所述的RNA提取方法，其特征在于，所述裂解液组成如下：8％(v/v)曲拉通、10mM氯化锌、5％(w/v)碳酸乙烯酯、0.1mg/ml蛋白酶K、150mM乙酸钠pH 4.5。
3.如权利要求1所述的RNA提取方法，其特征在于，所述重悬上柱的重悬液组成如下：3MGuHCl、100mM 2-巯基乙醇。
4.一种RNA提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括吸附柱、收集管和4种处理液，所述处理液1是裂解液，组成为：8％(v/v)曲拉通、10mM氯化锌、5％(w/v)碳酸乙烯酯、0.1mg/ml蛋白酶K、150mM乙酸钠pH 4.5；所述处理液2是重悬液，组成为：3MGuHCl、100mM 2-巯基乙醇；所述处理液3是浓缩的洗涤液，组成为：pH 4.5的125mM乙酸钠，使用前用75％乙醇稀释25倍；所述处理液4是洗脱液，组成为：pH 7.7的10mM Tris-HCl。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
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Application publication date: 20210316